4第四章 单克隆抗体与基因工程抗体制备技术

第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，称为单克隆抗体。

第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的原理是利用聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测、筛选和单个细胞培养（克隆化），最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。

将这种杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。

杂交瘤技术是一项周期长和高度连续性的实验技术，涉及大量的细胞培养、免疫化学等方法。

具体包括两种亲本细胞的选择与制备，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选与克隆化等。

一、杂交瘤技术（一）小鼠骨髓瘤细胞1.细胞株稳定，易于传代培养。

2.细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子。

3.该细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷株。

4.目前最常用的骨髓瘤细胞是NS-1和SP2/O细胞株。

（二）免疫脾细胞免疫时选用与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠，鼠龄8～12周，体重约20g，雌雄均可，但必须分笼。

免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，免疫途径多用腹腔内或皮内多点注射法。

如为珍贵微量抗原，可用脾脏内直接注射法进行免疫。

（三）细胞融合细胞融合是产生杂交瘤细胞的中心环节。

PEG（聚乙二醇）有助于细胞融合。

常用PEG分子量1000D、1500D或4000D。

（四）杂交瘤细胞的选择性培养将经过融合的细胞置于含有次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷的HAT培养基中。

1.脾细胞：在一般培养基中不能生长繁殖。

2.骨髓瘤细胞：采用的小鼠骨髓瘤细胞都是HGPRT或TK代谢缺陷型细胞，在HAT培养基中，不仅合成DNA的主要途径被氨基蝶呤阻断，又因缺乏HGPRT或TK而不能利用次黄嘌呤，虽有TK可利用胸腺嘧啶核苷，但终因缺乏嘌呤不能完整合成DNA，而使骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能增殖而死亡。

单克隆抗体与基因工程抗体的制备技术掌握：1.杂交瘤技术的基本原理2.抗体工程的基本技术一、单克隆抗体技术（Monoclonal antibody，McAb）（一）概述：克隆（clone）：由单个细胞繁殖、扩增而形成性状均一的细胞集落的过程称为克隆。

多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb）：大多数抗原分子具有多个表位，每一种表位均可刺激机体一个B细胞克隆产生一种特异性抗体。

传统制备抗体的方法是用包含多种表位的抗原物质免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。

因此，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，称为多克隆抗体。

单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）：由一个仅识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体，称为单克隆抗体−−→单个克隆→B−）淋巴细胞化学性质单一、特异性强的抗体（单克隆抗体细胞群①哺乳动物在感染病原体后，体内会形成多种相应的B淋巴细胞（浆细胞），因而产生多种特异性抗体。

②每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。

多克隆抗体：劣势：均一性差、特异性低、排斥副反应强。

单克隆抗体：优势：活性专一、特异性强、纯度高、副反应弱。

（二）杂交瘤技术的基本原理1.杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特性。

2.细胞的选择与融合：(1)亲本1：经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。

(2)亲本2：肿瘤细胞，通常选择多发性骨髓瘤细胞（Sp2/0）。

其具备以下特点为：①与B细胞为同一体系，可增加融合的成功率②稳定、易培养③自身不分泌Ig或CK④融合率高⑤是HGPRT缺陷株3.融合剂（fusogen）①引起融合的病毒：副粘病毒②化学制剂：聚乙二醇（PEG）③细胞电融合技术：电脉冲（三）选择培养基的应用1.细胞融合是一个随机的物理过程。

融合后可能出现以下情况：①脾细胞与瘤细胞②瘤细胞与瘤细胞③脾细胞与脾细胞④未融合的瘤细胞⑤未融合的脾细胞⑥细胞多聚体形式2.杂交瘤细胞的选择性培养基——HAT培养基细胞的DNA合成一般有两条途径：(1)主要途径：糖和氨基酸→核苷酸→DNA(2) 替代途径：1) 细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：①次黄嘌呤（hypoxanthine，H）②甲氨蝶呤（aminopoterin，A）③胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）2)三者取前缀缩写为HAT培养基3)原理：叶酸作为重要的辅酶参与DNA主要合成过程，氨基喋呤是叶酸的拮抗剂，能阻断该主要合成途径。

第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备第一节杂交瘤技术的基本原理第二节单克隆抗体的制备第三节基因工程抗体制备第四节单克隆抗体的应用将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，称为单克隆抗体。

第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的原理是使免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，成为杂交瘤细胞，最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。

将这种杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。

一、杂交瘤技术包括两种亲本细胞的选择与制备，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选与克隆化。

（一）小鼠骨髓瘤细胞细胞株稳定，易于传代培养。

细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子。

该细胞是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株。

（二）免疫脾细胞免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，免疫途径多用腹腔内或皮内多点注射法。

如为珍贵微量抗原，可用脾脏内直接注射法进行免疫。

（三）细胞融合PEG（聚乙二醇）可能导致细胞膜上脂类物质的物理结构重排，使细胞膜容易打开而有助于细胞融合。

（四）杂交瘤细胞的选择性培养HAT培养液，是在基础细胞培养液内添加次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷。

1.脾细胞（指B细胞）在一般培养基中不能生长繁殖。

2.骨髓瘤细胞因缺乏HGPRT而合成DNA，骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能增殖而死亡。

3.杂交瘤细胞由骨髓瘤细胞和脾细胞融合形成的杂交瘤细胞。

由于与脾细胞融合，可获得其HGPRT，可以合成DNA。

因此，杂交瘤细胞在选择性培养得以生存而被筛选出来。

二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养单个细胞培养又称克隆化。

细胞克隆化有以下几种方法：1.有限稀释法；2.显微操作法；3.荧光激活细胞分选仪；4.软琼脂平板法。

三、阳性杂交瘤细胞的冻存目前均采用液氮保存细胞。

细胞放入液氮前，需要逐步降温。

复苏细胞时，从液氮罐内取出冻存管，立即浸入37℃水浴。

第四章抗体工程制药第三节单克隆抗体的制备*原理制备流程原理书本84页单克隆抗体技术的原理是基于动物细胞融合技术得以实现的，即骨髓瘤细胞与B细胞的融合。

骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。

将免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特点，既有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成的分泌特异性抗体的能力。

@ 细胞融合后存在：脾细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞@ 筛选及抗体检测：HAT培养液：次黄嘌呤（H)、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T)，氨基蝶呤可阻断DNA的合成。

如细胞含有胸腺嘧啶激酶（TK）、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）此两种酶则可启动补救（应急）途径。

次黄嘌呤，胸腺嘧啶在HGPRT作用下合成DNA的合成，并可克服氨基蝶呤的阻断。

在HAT培养液中，骨髓瘤细胞缺乏TK或HGPRT而不能生长，而脾细胞能生长但不能长期增殖而死亡，只有杂交瘤细胞具有以上两种酶故能生长。

脾细胞（HGPRT+, TK+, 不能长期生长）骨髓瘤细胞（HGPRT-, TK-，不能生长）杂交瘤细胞（HGPRT+, TK+ ，能够生长）单克隆抗体制备流程图书本85页！！！制备流程：抗原→受体动物→致敏B 细胞+骨髓瘤细胞（PEG）→杂交瘤（细胞培养（HAT 培养基）→阳性筛选—①体内培养②体外培养）→单克隆抗体；第四节基因工程抗体一、单克隆抗体人源化(humanized antibody)；降低ＨＡＭＡ反应；人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。

*人源化抗体种类特点概念二、小分子抗体*种类用途可以用图示表示包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种。

基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V区片段，其相对分子质量仅为原抗体的1/80-1/3(1)Fab片段抗体：VH+CH1 (2)FV抗体：VH+VL(3)单链抗体：VH-Linker-VL (4)单域抗体：VH或VL小分子抗体有很多优点:可以用细菌或酵母菌发酵生产，成本低;分子小，穿透力强;不含Fc，没有Fc带来的效应;在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。

第四章单克隆抗体与基因工程抗体制备技术本章考点1.概念2.杂交瘤技术基本原理3.杂交瘤抗体的制备技术4.基因工程抗体由杂交瘤细胞产生的针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

其理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、且来源容易。

传统的方法是将抗原注入动物，由动物体内B细胞产生的抗体。

由于多数天然的抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。

因此，将抗原注入机体后，刺激多个B细胞克隆所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称为多克隆抗体（PoAb）。

第一节杂交瘤技术基本原理单克隆是指利用在细胞融合基础上的B细胞杂交瘤技术。

杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。

这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。

被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。

在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。

一、B细胞杂交瘤技术1.细胞的选择和融合：杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异性的单克隆抗体，所以融合一方必须是经过抗原免疫的B细胞，通常选用被免疫动物的脾细胞，脾淋巴细胞的主要特征是抗体分泌功能。

融合细胞另一方则要求在培养条件下的永生性，只有肿瘤细胞才是具备这一条件，所以选择同一体系的骨髓瘤细胞，因多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，其特点是稳定易培养、自身不分泌免疫球蛋白及细胞因子、融合率高、是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株，是理想的脾细胞融合对象。

2.选择培养基的应用：细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字头称为HAT培养基。

第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，称为单克隆抗体。

第一节杂交瘤技术的基本原理一、杂交瘤技术（一）小鼠骨髓瘤细胞1.细胞株稳定，易于传代培养。

2.细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子。

3.该细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷株。

4.目前最常用的骨髓瘤细胞是NS-1和SP2/O细胞株。

（二）免疫脾细胞选用与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠，鼠龄8～12周，体重约20g，雌雄均可，但必须分笼。

免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，多用腹腔内或皮内多点注射法。

如微量抗原，可脾脏内直接注射进行免疫。

（三）细胞融合PEG（聚乙二醇）有助于细胞融合。

（四）杂交瘤细胞的选择性培养将经过融合的细胞置于含有次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷的HAT培养基中。

1.脾细胞：在一般培养基中不能生长繁殖。

2.骨髓瘤细胞：采用的小鼠骨髓瘤细胞都是HGPRT或TK代谢缺陷型细胞，在HAT培养基中不能增殖。

3.杂交瘤细胞：骨髓瘤细胞与脾细胞融合，获得HGPRT，可以利用次黄嘌呤合成DNA，故可以存活。

二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存单个细胞培养又称克隆化。

细胞克隆化一般至少进行3～5次。

克隆化有以下几种方法：（一）有限稀释法操作简单，出现率高，为实验室最常用的方法。

（二）显微操作法直观可靠，但操作时间过长，容易增加污染机会。

（三）荧光激活细胞分选仪先进、高效、高纯度、昂贵。

（四）软琼脂平板法本法缺点是琼脂融化温度较难掌握，过高会导致细胞死亡，过低使细胞分布不均匀，操作较复杂，克隆出现率不稳定。

杂交瘤细胞应及时冻存，以保证细胞不会因污染或过多传代变异丢失染色体而丧失功能。

目前均采用液氮保存细胞。

（注意逐步降温、快速复温）第二节单克隆抗体的制备一、单克隆抗体的产生（一）动物体内诱生法目前McAb治疗用或体外诊断用的多采用该法。