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高效液相色谱法检测水产品中的孔雀石绿和结晶紫吴仕辉;朱新平;郑光明;陈昆慈;戴晓欣;潘德博【摘要】样品中的孑L雀石绿、结晶紫经试剂盒提取,浓缩后用经固相萃取柱净化、硼氢化钾还原、反向色谱柱分离,使用荧光检测器检测,孔雀石绿、结晶紫的加标回收率在76.1%～92.5%之间,相对标准偏差1.9%～5.8%,检出限均为0.5μg/kg.结果表明:该方法检测孔雀石绿(MG)、结晶紫(GV)处理简单,灵敏度高,节省时间,可用于大量样品的快速分析.【期刊名称】《广东海洋大学学报》【年(卷),期】2009(029)001【总页数】4页(P54-57)【关键词】水产品;孔雀石绿;结晶紫;检测;高效液相色谱法(HPLC)【作者】吴仕辉;朱新平;郑光明;陈昆慈;戴晓欣;潘德博【作者单位】中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东,广州,510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东,广州,510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东,广州,510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东,广州,510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东,广州,510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东,广州,510380【正文语种】中文【中图分类】S948孔雀石绿、结晶紫属于三苯甲烷类染料，这两种化合物对鱼类的水霉病、寄生虫病等有很好的疗效，长期以来许多国家曾将其作为水产养殖业的杀菌剂。
它们在鱼体内可分别代谢为无色孔雀石绿和无色结晶紫，由于其母体化合物和代谢物均具有潜在的致癌、致畸、致突变等副作用，20 世纪90年代以来许多国家都将其列为水产养殖的禁用药物。
但是由于其抗菌效果好、价格便宜，不少业户仍在违规使用，因此孔雀石绿残留监控就显得格外重要。
目前孔雀石绿、结晶紫及其代谢物的检测方法主要有高效液相色谱法[1-3]和液质联用法[4-5]。
我国于2006年发布有关的水产行业标准（SN/T1768-2006）[6]及国家标准（GB/T20361-2006）[7]。
[作者简介] 任秀莲(1963-),博士,副教授,主要从事植物活性成份的提取与分离工作。
【化学测定方法】反相高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物任秀莲1,魏琦峰1,曲 径2,徐成刚2(11哈尔滨工业大学(威海)海洋学院,山东威海 264209;21威海出入境检验检疫局,山东威海 264209)[摘要] 目的:利用反相高效液相色谱研究水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐性孔雀石绿、隐性结晶紫的同时测定。
方法:用PbO2-硅藻土柱为柱后氧化柱,用不同比例的乙腈-乙酸铵缓冲溶液-冰醋酸体系分析,确定58+14+28的乙腈-乙酸铵缓冲溶液-冰醋酸体系为最佳流动相。
结果:孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫的加标回收率分别为8416%,8518%,8918%,8815%,相对标准偏差分别为510%,417%,413%,416%,检测限均小于2μg/kg。
结论:该方法简单、可靠,结果令人满意。
[关键词] 高效液相色谱;孔雀石绿;结晶紫;隐性孔雀石绿;隐性结晶紫[中图分类号] O65717+2 [文献标识码] A [文章编号] 1004-8685(2006)08-0939-02 孔雀石绿、结晶紫属三芳基甲烷化学物质,长期以来许多国家曾将其作为水产养殖业的杀菌剂,可用于鱼类高发的水霉病、原虫病的控制,获得了极佳的效果。
但是进一步研究证实,孔雀石绿等进入人类或动物机体后,通过生物转化可产生致癌、致畸、致突变等副作用,上世纪90年代以来许多国家都将其列为水产养殖的禁用药物。
特别是近期水产品的国际商贸中,孔雀石绿、结晶紫属类药物成为必检并限制极严的一项指标。
但在水产品养殖、保鲜和运输过程中仍有使用,致使孔雀石绿等在不同程度上存在禁而不止的现象,因此建立快速准确的测定方法具有重要意义。
目前,国内孔雀石绿等的检测方法有高效液相色谱-质谱法[1]和液相色谱法[2,3]。
文献1由于仪器价格昂贵使其应用受到限制,文献2、文献3分别采用氰柱和ODS-3色谱柱分离分析孔雀石绿和隐性孔雀石绿。
全自动固相萃取-高效液相串联质谱测定分析水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物徐潇颖;刘柱;梁晶晶;陈万勤;罗金文【摘要】建立水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物的全自动固相萃取-高效液相串联质谱检测方法,采用全自动固相萃取仪代替传统的净化方式,使前处理操作具有简单、快速、重现性好的优点.并对目前研究中常见的3种定量分析方法进行比较,发现采用同位素内标法在0.1～10ng/mL线性范围内对孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫进行定量分析,相关系数均大于0.999;在空白样品中进行0.5、1.5、4.0 μg/kg 3组不同水平的加标试验,平均回收率在88.8％～103.5％之间,相对标准偏差RSD(n=6)在1.32％～3.62％之间.相比于外标法和双同位素内标定量法,此方法结果准确、重现性佳,更适合水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物的残留测定分析.【期刊名称】《河南工业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(038)001【总页数】8页(P81-87,121)【关键词】孔雀石绿;结晶紫;隐色结晶紫;隐色孔雀石绿;同位素内标;全自动固相萃取【作者】徐潇颖;刘柱;梁晶晶;陈万勤;罗金文【作者单位】浙江省食品药品检验研究院,浙江杭州310052;浙江省食品药品检验研究院,浙江杭州310052;浙江省食品药品检验研究院,浙江杭州310052;浙江省食品药品检验研究院,浙江杭州310052;浙江省食品药品检验研究院,浙江杭州310052【正文语种】中文【中图分类】TS201.2孔雀石绿（MG）和结晶紫（CV）是人工合成的三苯甲烷类碱性工业染料，最早被应用于纺织工业，后因其抗菌效果好、价格低廉被广泛应用于水产养殖业中[1-4]。
三苯甲烷类化合物具有高毒、高残留和三致（致癌、致畸、致突变）等危害，而且孔雀石绿（MG）和结晶紫（CV）经生物体代谢后会产生危害性更强的隐色孔雀石绿（LMG）和隐色结晶紫（LCV）[5]。
固相萃取-反相高效液相色谱法检测水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢物孔雀石绿（MG）和结晶紫（CV）具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变等特点，当其进入生物体内，就会产生具有更强危害的隐性孔雀石绿（LMG）和隐性结晶紫（LCV）。
鉴于孔雀石绿和结晶紫的危害性，包括我国在内的许多国家都将它们列为水产养殖中的禁用药物。
《GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》和《SN/T 1479-2004 进出口水产品中孔雀石绿残留量检验方法》中均采用有机溶剂提取后经固相萃取柱净化，然后采用高效液相色谱法或液相色谱-串联质谱法测定。
迪马科技在参考上述两个标准的基础上开发出中性氧化铝和阳离子交换固相萃取柱串联净化后，反相高效液相色谱柱检测。
该方法准确可靠，重复性好，回收率高，可作为水产品中孔雀石绿和结晶紫及代谢物的检测方法。
水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢物的检测(参考《SN/T 1479-2004进出口水产品中孔雀石绿残留量检验方法》和《GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》)1 适用范围本方法适用于水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢物的检测。
2 样品准备/提取1、称取已粉碎（已均质）的样品1 g于15 mL离心管中，加入1 mL 0.05 mol/L 苯磺酸溶液、1 mL0.25 g/mL盐酸羟铵溶液、0.4 mL0.1 mol/L乙酸铵溶液(pH4.5)和8 mL乙腈，涡旋混合2 min，4000 rpm离心1 min；2、将上清液转移至50 mL离心管中，残渣按照步骤1重复提取一次；3、合并两次提取液，并加入6 mL三氯甲烷和7 mL水，涡旋混合1 min，4000rpm离心1 min；4、取下层清液于旋蒸瓶中，向上层清液加入6 mL三氯甲烷，重复提取一次；5、合并两次下层三氯甲烷溶液，40℃减压蒸至近干，加入5 mL乙腈待净化。
3 SPE柱净化——ProElut Al-N（1 g/6 mL）（Cat.#：65306）上层ProElut SCX（500 mg/3 mL）（Cat.#：63604）下层(1)活化：加入10 mL乙腈，流出液弃去；(2)上样：将待净化液加入小柱，流出液弃去；(3)淋洗：加入5 mL乙腈淋洗小柱，流出液弃去，并去掉上层Al-N小柱；(4)洗脱：加入5 mL5%氨水乙腈，收集洗脱液；(5)重新溶解：将洗脱液在40 ℃下减压蒸干，1 mL定容液*溶解残渣，过微孔滤膜供HPLC分析。
高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留量金 雁3 刘 宁 姚家彪 赵 颖 孟祥勇(沈阳出入境检验检疫局 沈阳 110016)摘 要 建立高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿残留量的检测方法。
样品用乙腈-乙酸盐缓冲混合溶液提取,溶液分配到二氯甲烷层,后过中性氧化铝柱净化,采用高效液相色谱分离,二极管阵列检测器检测,外标法定量。
本法简便、快速、定量准确、精密度高,适用于水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿残留量的检测。
关键词 高效液相色谱法 孔雀石绿 隐色孔雀石绿 水产品 残留检测引言孔雀石绿属于三苯甲烷类染料,它可用作杀菌剂、驱虫剂,是药用染料中抗菌效力较强的一类,孔雀石绿在动物体内可迅速代谢为隐色孔雀石绿。
在水产养殖过程中,它经常被用于防治鱼类等水产品的水霉病、烂鳃病以及寄生虫病等〔1〕。
孔雀石绿具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用〔2〕,因此美国、日本、英国等许多国家已禁止其用于水产养殖业,我国农业部也于2002年将其列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》。
由于孔雀石绿价格低廉,在我国很多地方的水产养殖和水产品贩运中还在普遍使用这种禁用药物,因此严格监控水产品中孔雀石绿的残留量具有重要意义。
目前,水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿残留量的检测方法主要有:高效液相色谱法〔3,4〕、液质联用法〔5〕、气质联用法〔6〕、薄层色谱法〔7〕、普通分光光度法〔8〕等。
本文利用高效液相色谱法对鱼、河蟹、虾、毛蚶等水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿残留量的检测方法进行研究,该方法简便、快速、定量准确、精密度高。
1 实验部分111 仪器设备Agilent1100高效液相色谱仪,配置四元泵、真空在线脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器(DAD)、Agilent化学工作站(美国Agilent公司);色谱柱:K romasil ODS150mm×416mm5μm(中科院大连化学物理研究所);PbO2氧化柱(上海安谱科学仪器有限公司);高速匀浆机;离心机;pH计等。
水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物的快速测定作者：冯魁艾佳俊来源：《食品安全导刊》2015年第11期孔雀石绿、结晶紫是有毒的三苯甲烷类化学物，农业部将它们列为水产上的禁药。
然而由于其对鱼体水霉病和鱼卵的水霉病有特效，许多水产业养殖户仍在违规使用。
因此，农业部将孔雀石绿、结晶紫列为水产品检测的重点项目。
本文依据农业部公告SNT 1768-2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物的快速测定方法》，采用智能化食品安全一体机进行前处理，经过固相萃取技术浓缩净化，再用高效液相色谱仪检测。
大大减少检测步骤和检测时间，可用于水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物的应急筛查和常规检测。
试剂和材料标准品：孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫纯度大于98%，均来自中国水产科学研究院。
孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒（北京六角体科技发展有限公司），其中包括提提取剂、液体提取剂、固相萃取柱、洗脱剂。
其余试剂均为色谱纯。
仪器和设备高效液相色谱仪：配紫外-可见光可变波长检测器；检测波长时间程序可控。
智能化食品安全一体机。
液相色谱条件和实验步骤色谱柱：C18柱，4.6mm×150mm （d.i），粒度5µm；流动相：乙腈+乙酸盐缓冲液（80+20，V/V）；流速：1.0mL/min；柱温：室温；进样量：20µL。
检测波长时间程序：0min～5.0 min，618nm；5.0min～12min，588nm；12min～18min，267nm；孔雀石绿的检测波长为618nm，结晶紫的检测波长为588nm，隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的检测波长为267nm。
鱼取肉质部分，虾去壳。
取样品5.00g于通道1搅拌杯中，再加入一瓶固体提取剂，并连接底座和固相萃取柱。
将搅拌杯置入仪器。
设置各项参数为：搅拌时间1：1（s）、搅拌间歇1：30（s）、搅拌次数1：5、提取剂量1：10（mL）、搅拌时间2：1（s）、搅拌间歇2：30（s）、搅拌次数2：2、提取剂量2：20（mL）、萃取时间：60（s）、气压档位：8。
实验十五、水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定标准依据：GB/T 19857—2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定一、实验目的：学习水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿（Leucomalachite green）、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫(Leucocrystal violet)残留量的高效液相色谱的测定方法。
二、实验原理：试样中的残留物用乙腈-乙酸盐缓冲混合液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层并浓缩，经酸性氧化铝柱净化后，高效液相色谱-PbO2柱后衍生测定，外标法定量。
三、实验试剂与仪器：（一）试剂(除另有规定外，试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
)乙腈：液相色谱纯。
二氯甲烷。
甲醇：液相色谱纯。
乙酸盐缓冲液：溶解4.95g 无水乙酸钠及0.95g对-甲苯磺酸于950mL水中,用冰乙酸调节溶液pH到4.5, 最后用水稀释到1L。
20%盐酸羟胺溶液。
1.0 mol/L对-甲苯磺酸：称取17.2g对-甲苯磺酸，并用水稀释至100mL 。
50 mmol/L乙酸铵缓冲溶液：称取3.85g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，冰乙酸调pH到4.5。
二甘醇。
酸性氧化铝：80-120目。
二氧化铅。
硅藻土545：色谱层析级。
标准品：孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）、结晶紫（CV）、隐色结晶紫（LCV），纯度大于98%。
标准溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫，用乙腈分别配制成100µg/mL的标准贮备液，再用乙腈稀释配制1µg/mL的标准溶液。
-18℃避光保存。
混合标准工作溶液：用乙腈稀释标准溶液（3.2.13），配制成每毫升含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为20ng的混合标准溶液。
-18℃避光保存。
（二）仪器和设备1、高效液相色谱仪：配有紫外-可见光检测器。
2、匀浆机。
3、离心机：4 000 r/min。
4、固相萃取装置。
5、25% PbO2氧化柱：不锈钢预柱管(5cm(4mm i.d)，两端附2(m过滤板，抽真空下，填装含有25% PbO2的硅藻土，添加数滴甲醇压实，旋紧。
实验十五、水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定标准依据：GB/T19857—2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定一、实验目的：学习水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿（Leucomalachitegreen）、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫(Leucocrystalviolet)残留量的高效液相色谱的测定方法。
二、实验原理：试样中的残留物用乙腈-乙酸盐缓冲混合液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层并浓缩，经酸性氧化铝柱净化后，高效液相色谱-PbO2柱后衍生测定，外标法定量。
三、实验试剂与仪器：（一）试剂(除另有规定外，试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
)乙腈：液相色谱纯。
二氯甲烷。
甲醇：液相色谱纯。
乙酸盐缓冲液：溶解4.95g无水乙酸钠及0.95g对-甲苯磺酸于950mL水中,用冰乙酸调节溶液pH到4.5,最后用水稀释到1L。
20%盐酸羟胺溶液。
1.0mol/L对-甲苯磺酸：称取17.2g对-甲苯磺酸，并用水稀释至100mL。
50mmol/L乙酸铵缓冲溶液：称取3.85g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，冰乙酸调pH 到4.5。
二甘醇。
酸性氧化铝：80-120目。
二氧化铅。
硅藻土545：色谱层析级。
标准品：孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）、结晶紫（CV）、隐色结晶紫（LCV），纯度大于98%。
标准溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫，用乙腈分别配制成100µg/mL的标准贮备液，再用乙腈稀释配制1µg/mL的标准溶液。
-18℃避光保存。
混合标准工作溶液：用乙腈稀释标准溶液（3.2.13），配制成每毫升含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为20ng的混合标准溶液。
-18℃避光保存。
（二）仪器和设备1、高效液相色谱仪：配有紫外-可见光检测器。
2、匀浆机。
3、离心机：4000r/min。
4、固相萃取装置。
5、25%PbO2氧化柱：不锈钢预柱管(5cm⨯4mmi.d)，两端附2μm过滤板，抽真空下，填装含有25%PbO2的硅藻土，添加数滴甲醇压实，旋紧。
超高效液相色谱质谱法测定水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测量不确定度评定作者：肖聪伟来源：《现代食品》 2018年第22期摘要：目的：评估使用超高效液相色谱质谱联用仪测定水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量过程的测量不确定度。
方法：基于国家标准方法GB/T 19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》原理，利用超高效液相色谱质谱联用仪对水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量进行检测，通过对测定方法中的关键环节进行分析，建立测量不确定度评估模型，并计算合成测量不确定度。
结果：在本试验条件下，选择95% 置信概率，孔雀石绿含量测量结果应表示为（9.976±1.85）μg·kg-1、隐色孔雀石绿为（10.186±1.550）μg·kg-1、结晶紫含量为（9.482±0.902）μg·kg-1、隐色结晶紫为（10.148±0.796）μg·kg-1。
结论：测量不确定度主要来源于样品提取液浓度测定，而加标回收、样品定容体积、重现性、称取样品质量对测量不确定贡献相对较小。
关键词：测量不确定度；超高效液相色谱质谱联用仪；水产品；孔雀石绿；结晶紫1 材料与方法1.1 主要仪器Waters Xevo? TQ-S 超高效液相色谱质谱联用仪、Buchi R-100 旋转蒸发仪、Organomation N-EVAP 氮吹仪、Sartorius QUINTIX124-1CN 电子天平。
1.2 样液制备本试验选取市场购买草鱼作为试验样品。
称取5.00 g 已捣碎样品于50 mL 离心管中，加入200 μL 内标溶液，加入11 mL 乙腈提取，超声振荡提取2 min，8 000 r·min-1 匀浆提取30 s，4 000 r·min-1 离心5 min，吸取上清液，残渣再加入11 mL 乙腈重复提取1 次，合并上清液，并用乙腈定容至25 mL。
第6卷第4期2010年8月南 方 水 产Sou t h Ch i na F isheries Sc i enceV o l 6,N o 4Aug ,2010do:i 10 3969/j issn 1673-2227 2010 04 006收稿日期:2010 02 22;修回日期:2010 04 10作者简介:王丽敏(1981-),女,硕士,从事食品安全与兽药残留分析研究。
E m ai:l w angli m i n20073225@163 co m超高效液相色谱 串联质谱快速测定水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留量王丽敏,杜雪莉,赵艳,刘耀敏(通威股份有限公司检测中心,四川成都610041)摘要:建立了超高效液相色谱 串联质谱(U PLC M S /M S)测定水产品中孔雀石绿(MG )、结晶紫(CV )及其代谢物隐色孔雀石绿(L M G )和隐色结晶紫(LCV )残留量的快速、准确检测方法。
该法在SN /T 1768 2006快速检测方法的基础上,采用空白样品添加不同质量浓度标准溶液的方式绘制校准曲线,并以氘代孔雀石绿(D 5 M G )和氘代隐色孔雀石绿(D 6 L M G )为内标进行检测,从而大大提高了定量的准确性。
结果表明,MG 、CV 、L M G 和LC V 4种待测物在0~10 0ng mL -1范围内线性关系良好(R >0 99),方法检出限均为0 1 g kg -1。
在加标量为0 5和1 0 g kg -1水平下4种待测物平均回收率在92 1%~111 0%之间,测定结果的相对标准偏差为2 2%~9 5%。
此外,该法在FA PA S 国际能力验证中得以证实,改进后的方法快速且准确,能满足水产品出口检测要求。
关键词:超高效液相色谱 串联质谱;孔雀石绿;结晶紫;代谢物;水产品中图分类号:S 948;R 155 5文献标志码:A文章编号:1673-2227-(2010)04-0032-05Rapi d residue deter m i nation ofm al achite green ,crystal violet and theirm etabolites i n aquatic products by UPLC M S /M SWANG Li m in ,DU Xuel,i Z HAO Y an ,LI U Y ao m i n(Inspection C enter of T ongw ei Co Ltd ,Chengdu 610041,China )Abstrac t :W e deve l oped a rapid and accurate m ethod by U PLC M S /M S to deter m i ne t he residue o fm a lach i te green (MG ),crysta lv iolet (CV )and the ir m etabo lites (L M G and LCV )i n aquatic produc ts B ased on the rapid m e t hod of S N /T 1768 2006,standard curv es w ere m ade by add i ng standard so l utions o f d ifferent concentra tions to the b l ank sa m ples ,and D 5 MG and D 6 L M G we re used as interna l standards ,wh i ch i m proved the accuracy o f de ter m i nati on T he resu lts show tha tMG,CV,LM G and LCV have a good li nea r co rre l a ti on w it h i n t he range o f 0~10 0ng mL -1(R >0 99),and the detec tion li m its o f the m ethod are all 0 1 g kg -1 T he aver age recoveries a t fortificati on of 0 5and 1 0 g kg -1rang e fro m 92 1%to 111 0%w ith re l a tive standa rd dev i a tions (R SD )vary ing fro m 2 2%to 9 5% Furthe r mo re ,the rapi d and accura te i m proved m ethod i s a lso proved by FAPA S P ro fi c iency T est to m ee t the ex port testi ng requ i re m ents o f aquatic produc ts K ey word s :U PLC M S /M S ;ma lach ite green ;cry sta l v i o l e t ;m e tabolite ;aquati c produc ts孔雀石绿(MG )和结晶紫(C V )是一类三苯甲烷类染料,最先应用在纺织工艺,因其具有消毒和杀菌作用而被广泛应用于水产品的养殖过程中。
第29卷 第1期 广东海洋大学学报 V ol.29 No.12009年2月 Journal of Guangdong Ocean University Feb. 2009收稿日期：2008-10-10基金项目：广东省重大科技兴海项目（B200701A06）第一作者：吴仕辉（1980－），女，硕士，研究实习员，从事水产品质量安全研究。
E-mail ：wshxjw@高效液相色谱法检测水产品中的孔雀石绿和结晶紫吴仕辉，朱新平，郑光明，陈昆慈，戴晓欣，潘德博（中国水产科学研究院珠江水产研究所，广东 广州，510380)摘 要：样品中的孔雀石绿、结晶紫经试剂盒提取，浓缩后用经固相萃取柱净化、硼氢化钾还原、反向色谱柱分离，使用荧光检测器检测，孔雀石绿、结晶紫的加标回收率在76.1 %～92.5 %之间，相对标准偏差1.9 %～5.8 %，检出限均为0.5 µg/kg 。
结果表明：该方法检测孔雀石绿（MG ）、结晶紫（GV ）处理简单，灵敏度高，节省时间，可用于大量样品的快速分析。
关键词：水产品；孔雀石绿；结晶紫；检测；高效液相色谱法（HPLC ）中图分类号：S948 文献标志码：A 文章编号：1673-9159(2009)01-0054-04Determination of Malachite Green and Gentian Violet Residues in Fishery Products by High Performance Liquid Chromatography(HPLC)with Fluorescence DetectorWU Shi-hui, ZHU Xin-ping, ZHENG Guang-ming, CHEN Kun-ci, DAI Xiao-xin, PAN De-bo (Pearl River Fishery Research Institute , Chinese Academic of Fishery Science , Guangzhou , 510380 Chin a )Abstract: M alachite green and gentian violet residues in fishery products were determined by high performance liquid chromatography method coupled with fl uorescence detector. Samples were extracted by pre-treatment kit for extraction of MG, LMG, GV, LGV and purified by solid-phase extraction cartridges. After concentrated, samples were deoxidized by potassium borohydride. The MG and GV were detected with FLD detector after C18 column separation. The recoveries for fortified fish tissue were 76.1 %～92.5 %, The relative standard deviation(RSD) values for repeatability were 1.9 %～5.8 %．The detection limit for MG and CV was 0.5 µg/kg, respectively.Key words: fisher product ；malachite green ；gentian violet ; detection ; HPLC孔雀石绿、结晶紫属于三苯甲烷类染料，这两种化合物对鱼类的水霉病、寄生虫病等有很好的疗效，长期以来许多国家曾将其作为水产养殖业的杀菌剂。
它们在鱼体内可分别代谢为无色孔雀石绿和无色结晶紫，由于其母体化合物和代谢物均具有潜在的致癌、致畸、致突变等副作用，20世纪90年代以来许多国家都将其列为水产养殖的禁用药物。
但是由于其抗菌效果好、价格便宜，不少业户仍在违规使用，因此孔雀石绿残留监控就显得格外重要。
目前孔雀石绿、结晶紫及其代谢物的检测方法主要有高效液相色谱法[1-3]和液质联用法[4-5]。
我国于2006年发布有关的水产行业标准（SN/T1768- 2006）[6]及国家标准（GB/T20361-2006）[7]。
行业标准SN/T1768-2006前处理简单，但是满足不了检测限0.5 µg/kg 的要求。
其他方法的前处理均需多次萃取，多次离心，操作烦琐，前处理时间长，有机溶剂用量大，实际检测工作中存在困难。
本文综合各个方法标准中快速和灵敏的优点，建立了同时检测孔雀石绿及代谢物无色孔雀石绿总量，结晶紫以及代谢物无色结晶紫总量的液相色谱方法。
1材料与方法1.1实验样品加州鲈，采自广东省广州市芳村好又多超市加州鲈活样品，取其肌肉，各自用均质机混均，每个样品各400 g，于-20 ℃冰箱保存备用。
1.2 试剂和溶液孔雀石绿标准品：纯度97.2 %；结晶紫标准品：纯度93.9 %；孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒，由中国检验检疫科学研究院北京陆桥商检新技术公司生产。
酸性氧化铝固相萃取柱（500 mg，3 mL），PRS固相萃取柱（500 mg，3 mL），乙腈为色谱纯，无水乙酸铵、冰乙酸、对-甲苯磺酸、乙酸钠、硼氢化钾均为分析纯，实验用水为去离子水。
孔雀石绿标准储备液：100 µg/mL孔雀石绿乙腈溶液;结晶紫标准储备液：100 µg/mL结晶紫乙腈溶液;孔雀石绿、结晶紫混合标准中间溶液：10 µg/mL;乙酸钠缓冲液：0.06 mol/L乙酸钠+0.005 mol/L 对甲苯磺酸，pH4.5;乙酸铵缓冲溶液：0.125 mol/L，pH 4.5;硼氢化钾溶液：0.07 mol/L，现配现用;洗脱液：乙酸乙酯∶甲醇∶氨水体积比10∶9∶1。
1.3 仪器与色谱条件仪器：Agilent1200型高效液相色谱仪、均质机、离心机、振荡器、旋转蒸发器、固相萃取装置、氮吹仪。
色谱条件：色谱柱，Eclipse-C18 250 mm×4.6 mm，粒度5 µm；流动相，乙腈+乙酸铵缓冲液（pH 4.5）=80+20；流速 1.5 mL/min；柱温35 ℃；激发波长265 nm, 发射波长360 nm；进样量20 µL。
1.4 样品预处理提取：准确称取5.00 g已搅碎的样品于50 mL 离心管中，加入孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒中提取剂1（20mL，由有机化学试剂组成的混合液体试剂）和提取剂2（由无机化学组成的混合粉末试剂），8 000 r/min的速度均质30 s，振荡2 min，4500 r/min离心5 min，取上清液10.0 mL于鸡心瓶中，45 ℃水浴旋转蒸发至近干，用2.5 mL 乙腈溶解残渣。
净化: 将PRS柱安装在固相萃取装置上，上端串联酸性氧化铝柱，用5 mL乙腈活化，转移提取液到柱上，再用2.5 mL乙腈洗涤瓶一次，过柱，重复操作一次，去掉酸性氧化铝柱，用5 mL乙腈清洗PRS柱，氮吹PRS柱至近干，在不抽真空的情况下，加入5 mL洗脱液洗脱，收集全部洗脱液，氮气吹至近干，加0.4 mL硼氢化钾溶液，还原，静置20 min，用乙腈定溶至1.0 mL，经聚四氟乙烯膜过滤后上机分析。
1.5 样品测定在临用前准确吸取一定量的混合标准中间溶液，加入0.4 mL硼氢化钾溶液，用乙腈准确稀释至2.0mL，配制适当浓度的混合标准工作液。
在上述色谱条件下，分别测定孔雀石绿、结晶紫混合标准工作溶液及样品提取溶液中的孔雀石绿、结晶紫，外标法定量。
1.6准确度和精密度实验以本底无孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫的加州鲈为样品，平行称取3份样品，按5 µg/kg、10 µg/kg、20 µg/kg三个加标浓度进行加标，按上述步骤进行前处理和色谱测定，分别测定各次的峰面积，计算样品中孔雀石绿、结晶紫的含量，计算回收率。
另取6个平行样品，采用添加法分别添加等量孔雀石绿、结晶紫混合标准溶液，按上述步骤进行前处理和色谱测定，分别测定各次的峰面积,计算样品中孔雀石绿、结晶紫的含量，计算相对标准偏差。
1.7 计算以标准工作液峰面积和浓度作工作曲线，根据样品提取液的峰面积，从工作曲线计算样品提取液中孔雀石绿、结晶紫的残留量，按式⑴计算样品中孔雀石绿、结晶紫残留量。
计算结果需扣除空白值。
mVCX2××=⑴式中：X—试样中的孔雀石绿、结晶紫的残留量，µg/kg；C—样品提取液中孔雀石绿、结晶紫的残留量，ng/mL；V—最终定容体积，mL；m—样品质量，g。
2结果2.1孔雀石绿、结晶紫标准色谱图本实验选定色谱条件下孔雀石绿、结晶紫的保留时间分别为为7.9 min、8.5 min左右，图1为标准溶液浓度为30 ng/ mL的标准色谱图。
2.2 标准曲线以HPLC测得的峰面积y为纵坐标，相应的浓度x为横坐标绘制标准曲线，其线性关系和相关系广 东 海 洋 大 学 学 报 第29卷56数见表1。
结果表明，孔雀石绿、结晶紫在1.0 ng/mL ～500 ng/mL 范围内线性良好，可以满足定量分析的需要。
表1 线性回归方程、相关系数、线性范围Tab.1 Regression equation 、coefficient and linear range2.3 回收率、精密度和灵敏度加州鲈空白肌肉组织样品中分别添加3个浓度水平的孔雀石绿、结晶紫标准溶液，进行回收率测定，回收率测定结果见表2，加标样品图谱见图2。
由表2可以看出，孔雀石绿、结晶紫加标浓度在5 µg/kg ～20 µg/kg 内，回收率为76.1 ％～92.5 ％。
六个平行样品测定结果的相对标准偏差（RSD ）分别为：孔雀石绿，5.6％；结晶紫，4.5％，重现性能满足要求。
以信噪比S/N=3计算，样品中孔雀石绿、结晶紫的检出限均为0.5 µg/kg 。
表2 样品加标回收率及RSD （n =3） Tab.2 Recoveries of spiked samples and RSDs 化合物 样品含量/(µg·kg -1)加标浓度 /(µg·kg -1)平均回收率/% RSD/%5 92.5 5.5孔雀石绿(MG)0 10 84.1 4.320 86.2 3.80 5 76.1 5.8结晶紫(GV) 10 80.7 2.320 88.3 1.9化合物线性回归方程相关系数 线性范围孔雀石绿MG y =0.7146x -3.5602 0.9998 1.0～500结晶紫GVy =0.9834x -3.7908 0.9996 1.0～500t /min响应值/L U6 5.5 5 4.5 41 23 4 56 78 93讨论3.1净化条件的选择样品经孔雀石绿快速前处理试剂盒提取后，如果不进一步净化，直接上机用荧光检测器检测，干扰严重。
