养殖水体中孔雀石绿的快速检测技术

I he『esea rch『eviewed水产品中残留孔雀石绿的毒性与检测方法王邦国(靖远县农产品质量安全检验检测管理站730699)摘要：作为一种带有金属光泽绿色结晶体的孔雀石绿,在化学界中被称为四甲基代二氨基三苯甲烷,其在戊醇、乙醇、甲醇以及水中易于溶解,水溶液呈现蓝绿色,抗菌效力在药物染料中较强，可作为驱虫剂或杀菌剂，属于三苯甲烷类染料。

下面本文章将对水产品残留孔雀石绿的研究进展加以分析。

关键词:水产品;残留物质；孔雀石绿；研究进展在养殖过程中，我国曾以孔雀石绿作为清塘杀菌剂，同时，也常将孔雀石绿使用在存放池内和运输过程中，它们在鱼体内可分别代谢为无色结晶紫与无色孔雀石绿，因为其母体化合物与代谢物质存在较大的副作用，极易致突变、致畸、致癌，至此多数国家已经在20世纪90年代将孔雀石绿列为水产养殖禁用药用。

但是现阶段仍有一些渔民在违规使用,主要是因为孔雀石绿价格便宜,抗菌效果较好,所以有效监测孔雀石绿残留物质是至关重要的遥1孔雀石绿的分布与代谢情况进入机体后的孔雀石绿通常会经过生物转化，变成无色孔雀石绿，属于脂溶性的衍生物,极易残留在组织中。

一些业界人士发现，在鱼体内残留的孔雀石绿物质比水体中孔雀石绿的浓度明显要高,主要分布在内脏器官、皮肤、肌肉、肝脏、肾脏以及血浆中,同时体内也会蓄积孔雀石绿，特别是含有较多脂肪的组织中浓度水平更高。

在清除体内的孔雀石绿过程中，除脂肪含量影响与自身解毒能力外，还会受到环境因素的影响，如PH值和温度等。

在体内孔雀石绿的代谢方式有两条:首先，在还原酶的催化作用下,孔雀石绿可降解成无色孔雀石绿;其次，经N-脫甲基作用,在细胞色素催化下,生成次级或初级代谢产物芳香胺。

另外,无色孔雀石绿也有两条代谢方式:首先,基于氧化酶作用下,无色孔雀石绿会被重新氧化成孔雀石绿;其次,无色孔雀石绿经N-脫甲基作用，在催化作用下，酯化后与DNA形成DNA加合物。

2孔雀石绿的毒性与致毒机制据大量研究证实,在水产品中，孔雀石绿对动物的毒性较强,导致鱼皮肤和鳃上皮细胞轻度炎症,扩大肾小管壁细胞的胞核,使肾管腔有轻度扩张，甚至会影响鱼的生长与摄食,减少鱼肠中酶的分泌量。

水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法1范围本方法规定了水产品及其养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的胶体金免疫层析快速检测方法。

本方法适用于鱼肉及养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的快速测定。

2原理样品中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿经有机试剂提取，吸附剂净化，正己烷除脂后，加入氧化剂将隐色孔雀石绿氧化成为孔雀石绿，经浓缩复溶后，孔雀石绿与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和微孔膜检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。

通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量进行定性判定。

3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。

3.1 试剂3.1.1正己烷。

3.1.2乙腈。

3.1.3冰乙酸。

3.1.4盐酸。

3.1.5吐温-20。

3.1.6氯化钠。

3.1.7对-甲苯磺酸。

3.1.8无水乙酸钠。

3.1.9盐酸羟胺。

3.1.10无水硫酸钠。

3.1.11中性氧化铝：层析用，100目~200目。

3.1.12二氯二氰基苯醌。

3.1.13氯化钾。

3.1.14磷酸二氢钾。

3.1.15十二水合磷酸氢二钠。

3.1.16饱和氯化钠溶液：称取氯化钠（3.1.6）200 g，加水500 mL，超声使其充分溶解。

3.1.17盐酸羟胺溶液（0.25 g/mL）：称取2.5 g 盐酸羟胺（3.1.9），用水溶解并稀释至10 mL，混匀。

3.1.18乙酸盐缓冲液：称取4.95 g 无水乙酸钠（3.1.8）及0.95 g 对-甲苯磺酸（3.1.7）溶解于950 mL 水中，用冰乙酸（3.1.3）调节溶液pH 为4.5，用水稀释至1 L，混匀。

3.1.19二氯二氰基苯醌溶液（0.001 mol/L）：称取0.0227 g 二氯二氰基苯醌（3.1.12）置于100 mL 棕色容量瓶中，用乙腈（3.1.2）溶解并稀释至刻度，混匀。

水产品中孔雀石绿快速检测方法
组织检测步骤：
鱼虾等去皮、脂肪，用均质器均质样本，称取2±0.05g均质物于15ml离心管；加入1瓶去脂试剂，振荡2min，室温4000rpm，离心3min。

倒掉上清液，把肉样弄松散（若要做添加实验，请在此刻加入添加物）；加入1瓶提取剂A，立即摇匀，然后加入1瓶提取剂B，充分振荡混合5min，室温4000rpm，离心5min；取上层有机层4ml到15ml离心管中，加入20ul衍生化试剂，涡旋1min，加入4ml净化剂，颠倒混匀1min，静置1min；取下层（溶液显紫红色）2ml，55℃下使用便携式空气吹干仪吹干；然后加入0.5ml缓冲液剧烈涡旋2min，待检。

检测:从包装中取出微孔，用移液器吸取待检液体80ul至微孔中充分吸打均匀，然后全部滴加至检测卡加样孔（检测卡平放），静置8-15分钟，根据示意图判读结果（见彩图）水样检测步骤：
①用移液器吸取80µl样本液至样品孔中。

②静置5-8分钟，根据示意图判读结果。

结果判定及示意图：
在试纸卡的中央判读区喷有2条线，上面一条为对照线(C线)，下面一条为测试线(T线)。

若样品液中孔雀石绿的浓度小于检测限时，则T线显色比C线强，或显色与C线相近；若样品液中孔雀石绿的浓度大于检测限时，则T线显色比C线浅很多或T线显绿色。

实验设备：
1、孔雀石绿快速检测卡；
2、PRO-12L空气吹干仪;
3、HH-1水浴锅；
4、80-2离心机；
5、均质器；
6、掌上电子天平。

107实验研究孔雀石绿，又称为碱性绿、孔雀绿等，其为一类生物染色剂、染料，商品名中含有草酸盐及氯化锌两种规格，呈现翠绿色结晶体，主要包含两种结构式，即盐酸盐和无色孔雀石绿，易溶于水、乙醇及甲醇中，其水溶液呈现蓝绿色，在水生生物体内代谢产物变为无色孔雀石绿。

当前水产品感染孔雀石绿途径主要包含养殖、运输及存放，其中养殖户进行鱼苗孵阶段，会利用孔雀石绿将其各类鱼病防治。

孔雀石绿不仅拥有高毒素特征，而且致癌及致畸性较强，可在动物内长期存留，通过动物代谢之后转化为无色孔雀石绿，对人们健康构成严重威胁。

本次实践的主要内容是使用高效液相色谱法测定水体中孔雀石绿的残留量。

检测结果的准确性、稳定性有利于有关监管部门对水产养殖基地兽药使用的监控，对食品安全起到预警、监督作用。

1.材料与方法1.1仪器与设备本试验中主要涉及以下设备：Agilent 1100型高效液相色谱仪：配荧光检测器；Mettler Tolledo(PL202-L/100)百分一天平；IKA MS3 basic旋涡混合器；OA-SYS氮吹仪；CNW固相萃取装置;Thermo移液器（1mL 5mL 10mL ）；Microman微量移液器（20μL~100μL ）1.2材料与试剂乙腈：色谱纯；二氯甲烷；冰乙酸；氨水；孔雀石绿标准品(Dr.Ehrenstorfer GmbH)：纯度≥98%。

提取液：盐酸羟胺3g，对甲苯磺酸0.24 g溶于100 mL水中。

硼氢化钾溶液［ 0.2% ］：称取0.2 g硼氢化钾溶于100 mL水中，现配现用。

乙酸铵缓冲溶液［ 0.125mol /L］：称取9.64 g无水乙酸胺溶解1000 mL水中，用氨水调pH至4.5，过0.45μm滤膜备用。

乙酸铵缓冲溶液［ 0.1mol /L］：称取7.71 g无水乙酸胺溶解1000 mL水中，用氨水调pH至10.0，过0.45μm 滤膜备用。

PRS柱洗脱液：乙酸铵缓冲溶液（0.1mol /L）+乙腈=1+1，现配现用。

固相微萃取－高效液相色谱法快速测定水中孔雀石绿陶艳玲;邓爱妮;刘秋梅;郭智勇;王邃【摘要】HPLC with sample treatment by solid phase micro-extraction （SPME） was applied to the determination of malachite green in water samples. To attain a higher efficiency in SPME, the 85 μm PA coating was applied to the micro-extractor, and the extraction was carried out for 15 min. The Shim-pack VP-ODS C18 column was used as the stationary phase, and a mixture of 50 mmol ·L-1 ammonium acetate solution of pH 4. 5 and acetonitrile （20＋80） was used as the mobile phase for elution. Detection at 595 nm was adopted. Linearity range of malachite green was kept in the range of 0.05--2 mg·L-1, with detection limit （3S/N） of 0. 003 mg ·L-1. A sample of fish pond water was analyzed by this method, and test for recovery was made on this sample as matrix by standard addition method giving results in the range of 98. 1 %--109. 6 %.%提出了固相微萃取-高效液相色谱法测定水中孔雀石绿的含量。

水中孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿、隐色结晶紫
快速检验方法
一、【检测原理】
水中的孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物隐色孔雀石绿、隐色结晶紫经过孔雀石绿专用SPE小柱富集、衍生化后在小柱上形成有色环带，可初步判断水样中是否含有待检物质。

用洗脱剂洗脱，收集洗脱液，即可定性检测。

二、【检测范围】
水体
三、【技术指标】
检测下限：2.0μg/kg
四、【检验步骤】
1、取样：取待检水样约50mL，若样品杂质较多可先用滤纸过滤去除杂质。

2、过层析柱：将50mL注射器与层析柱串接，将1中水样加入注射器中。

从上口加压，加快流速，建议样本通过柱子的时间为10min左右。

3、观察结果：去掉注射器，加入2mL蒸馏水洗涤，用吸耳球从上口加压挤干，观察层析柱中吸附剂颜色变化，若吸附剂逐渐形成绿色环带，可初步判断样本中含有孔雀石绿；若吸附剂逐渐形成紫色环带，可初步判断样本中含有结晶紫。

4、检测孔雀石绿或结晶紫含量：取0.8mL洗脱液于富集有待检样品的层析柱中,用比色管收集洗脱液判断是否含有孔雀石绿或结晶紫。

5、隐色孔雀石绿及隐色结晶紫检验：用2mL蒸馏水洗涤4中洗脱后的层析柱挤干，取1瓶衍生化试剂全部加入层析柱中后再加入2mL蒸馏水，挤干后将4中的洗脱剂全部加入层析柱中挤干，用比色管接收洗脱液，再加入0.8mL 洗脱液挤干，合并洗脱液，加入0.5mL蒸馏水及0.5mL萃取剂，振荡混匀后静置观察下层，既可判断是否含有所检物质。

ANAlYSIS & TEST分析与检测水产中孔雀石绿残留量快速检测新技术 ——干式分析法□ 北京六角体科技发展有限公司 供稿目前检测孔雀石绿方法有实验室标准方法及现场快速筛查方法。

实验室的标准检测方法主要是高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱法，能够提供较高的灵敏度和回收率，但是色谱法需要昂贵的仪器，费时且检测成本高，不适用于大量样品的筛选，也难在基层检测单位以及食品企业推广使用，同时检测时间仍很难满足企业产品质量安全控制的实际需求。

现场快速筛查方法快速、经济但只是起到对待检样品的初步快速筛查，实验结果受人为因素影响较大，不能准确定性、定量和及时记录传输结果。

现本方法采用北京六角体科技发展有公司限研制的便携干式分析仪，结合六角体科技研制的孔雀石绿快速检测试剂盒-柱净化点滴板比色法，利用便携干式分析仪记录色斑达到现场定性定量快速准确检测孔雀石绿的目的。

水产品中孔雀石绿快速提取样液经过柱色谱分离净化及隐色孔雀在线快速衍生转化成有色孔雀石绿，分离衍生样液并浓缩于聚四氟乙烯点滴板上，采用便携干式分析仪快速定量检测，设计了5个添加水平（1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μg/kg）6次重复试验。

结果表明，方法线性范围为0～20.0μg/kg；检测限均为1.0μg/kg，回收率在70%～85%之间，RSD在3.6%～12.5%之间，在30分钟内完成整个检测过程。

本方法操作简单、检测时间短、对实验人员素质要求不高、可准确定量检测水产品中孔雀石绿含量，并可现场记录传输结果，可以满足基层检测及执法单位的需求。

实验部分1.仪器、设备和试剂便携干式分析仪(北京六角体科技发展有限公司)；孔雀石绿快速检测试剂盒(北京六角体科技发展有限公司)。

2.实验方法(1)检测范围鱼、虾等水产品肌肉组织。

(2)技术指标检测下限：1.0μg/kg。

图1 样品前处理流程图. All Rights Reserved.30食品安全导刊•技术 2013年９月（3）样品前处理样品前处理操作如图1所示。

水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物的快速测定作者：冯魁艾佳俊来源：《食品安全导刊》2015年第11期孔雀石绿、结晶紫是有毒的三苯甲烷类化学物，农业部将它们列为水产上的禁药。

然而由于其对鱼体水霉病和鱼卵的水霉病有特效，许多水产业养殖户仍在违规使用。

因此，农业部将孔雀石绿、结晶紫列为水产品检测的重点项目。

本文依据农业部公告SNT 1768-2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物的快速测定方法》，采用智能化食品安全一体机进行前处理，经过固相萃取技术浓缩净化，再用高效液相色谱仪检测。

大大减少检测步骤和检测时间，可用于水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物的应急筛查和常规检测。

试剂和材料标准品：孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫纯度大于98%，均来自中国水产科学研究院。

孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒（北京六角体科技发展有限公司），其中包括提提取剂、液体提取剂、固相萃取柱、洗脱剂。

其余试剂均为色谱纯。

仪器和设备高效液相色谱仪：配紫外-可见光可变波长检测器；检测波长时间程序可控。

智能化食品安全一体机。

液相色谱条件和实验步骤色谱柱：C18柱，4.6mm×150mm （d.i），粒度5µm；流动相：乙腈+乙酸盐缓冲液（80+20，V/V）；流速：1.0mL/min；柱温：室温；进样量：20µL。

检测波长时间程序：0min～5.0 min，618nm；5.0min～12min，588nm；12min～18min，267nm；孔雀石绿的检测波长为618nm，结晶紫的检测波长为588nm，隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的检测波长为267nm。

鱼取肉质部分，虾去壳。

取样品5.00g于通道1搅拌杯中，再加入一瓶固体提取剂，并连接底座和固相萃取柱。

将搅拌杯置入仪器。

设置各项参数为：搅拌时间1：1（s）、搅拌间歇1：30（s）、搅拌次数1：5、提取剂量1：10（mL）、搅拌时间2：1（s）、搅拌间歇2：30（s）、搅拌次数2：2、提取剂量2：20（mL）、萃取时间：60（s）、气压档位：8。

附件1水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法（KJ201701）1范围本方法规定了水产品及其养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的胶体金免疫层析快速检测方法。

本方法适用于鱼肉及养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的快速测定。

2原理样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿经有机试剂提取，吸附剂净化，正己烷除脂后，加入氧化剂将隐色孔雀石绿氧化成为孔雀石绿，经浓缩复溶后，孔雀石绿与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。

通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量进行定性判定。

3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。

3.1 试剂3.1.1正己烷。

3.1.2乙腈。

3.1.3冰乙酸。

3.1.4盐酸。

3.1.5吐温-20。

3.1.6氯化钠。

3.1.7对-甲苯磺酸。

3.1.8无水乙酸钠。

3.1.9盐酸羟胺。

3.1.10无水硫酸钠。

3.1.11中性氧化铝：层析用，100目~200目。

3.1.12二氯二氰基苯醌。

3.1.13氯化钾。

3.1.14磷酸二氢钾。

3.1.15十二水合磷酸氢二钠。

3.1.16饱和氯化钠溶液：称取氯化钠（3.1.6）200g，加水500mL，超声使其充分溶解。

3.1.17盐酸羟胺溶液（0.25g/mL）：称取2.5g盐酸羟胺（3.1.9），用水溶解并稀释至10mL，混匀。

3.1.18乙酸盐缓冲液：称取4.95g无水乙酸钠（3.1.8）及0.95g对-甲苯磺酸（3.1.7）溶解于950mL 水中，用冰乙酸（3.1.3）调节溶液pH为4.5，用水稀释至1L，混匀。

3.1.19二氯二氰基苯醌溶液（0.001mol/L）：称取0.0227g二氯二氰基苯醌（3.1.12）置于100mL 棕色容量瓶中，用乙腈（3.1.2）溶解并稀释至刻度，混匀。

4℃避光保存。

3.1.20复溶液：称取8.00g氯化钠（3.1.6），0.20g氯化钾（3.1.13），0.27g磷酸二氢钾（3.1.14）及2.87g十二水合磷酸氢二钠（3.1.15）溶解于900mL水中，加入0.5mL吐温-20（3.1.5），混匀，用盐酸（3.1.4）调节pH为7.4，用水稀释至1L，混匀。