【CN110208441A】淡水鱼中隐性孔雀石绿的快速提取和检测方法【专利】

专利名称：一种养殖水中孔雀石绿的快速检测方法专利类型：发明专利
发明人：康怀志,刘国坤,曾勇明,陈启振
申请号：CN201610018253.0
申请日：20160112
公开号：CN105675578A
公开日：
20160615
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种养殖水中孔雀石绿的快速检测方法，涉及孔雀石绿的检测。

将待测养殖水放入检测池中，加入金属溶胶和无机盐絮凝剂，再放在拉曼光谱仪检测室内进行检测。

所述待测养殖水浑浊，颗粒物等杂质较多时，可先将待测养殖水过0.45um滤膜，或者先将待测养殖水离心处理，再进行后续步骤。

操作简便，无需专业人员即可实现检测。

即时检测，检测时间小于1min，适用于大批量样品的快速筛选。

检出限低，准确度高，无假阳性，且能满足检测灵敏度的要求。

整个检测过程中不需要使用任何有机试剂，不会危害检测人员的身体健康，也不对污染环境。

申请人：厦门大学
地址：361005 福建省厦门市思明南路422号
国籍：CN
代理机构：厦门南强之路专利事务所(普通合伙)
代理人：马应森
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水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法1范围本方法规定了水产品及其养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的胶体金免疫层析快速检测方法。

本方法适用于鱼肉及养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的快速测定。

2原理样品中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿经有机试剂提取，吸附剂净化，正己烷除脂后，加入氧化剂将隐色孔雀石绿氧化成为孔雀石绿，经浓缩复溶后，孔雀石绿与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和微孔膜检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。

通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量进行定性判定。

3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。

3.1 试剂3.1.1正己烷。

3.1.2乙腈。

3.1.3冰乙酸。

3.1.4盐酸。

3.1.5吐温-20。

3.1.6氯化钠。

3.1.7对-甲苯磺酸。

3.1.8无水乙酸钠。

3.1.9盐酸羟胺。

3.1.10无水硫酸钠。

3.1.11中性氧化铝：层析用，100目~200目。

3.1.12二氯二氰基苯醌。

3.1.13氯化钾。

3.1.14磷酸二氢钾。

3.1.15十二水合磷酸氢二钠。

3.1.16饱和氯化钠溶液：称取氯化钠（3.1.6）200 g，加水500 mL，超声使其充分溶解。

3.1.17盐酸羟胺溶液（0.25 g/mL）：称取2.5 g 盐酸羟胺（3.1.9），用水溶解并稀释至10 mL，混匀。

3.1.18乙酸盐缓冲液：称取4.95 g 无水乙酸钠（3.1.8）及0.95 g 对-甲苯磺酸（3.1.7）溶解于950 mL 水中，用冰乙酸（3.1.3）调节溶液pH 为4.5，用水稀释至1 L，混匀。

3.1.19二氯二氰基苯醌溶液（0.001 mol/L）：称取0.0227 g 二氯二氰基苯醌（3.1.12）置于100 mL 棕色容量瓶中，用乙腈（3.1.2）溶解并稀释至刻度，混匀。

高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留量金雁;刘宁;姚家彪;赵颖;孟祥勇
【期刊名称】《现代仪器与医疗》
【年(卷),期】2006(012)003
【摘要】建立高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿残留量的检测方法.样品用乙腈-乙酸盐缓冲混合溶液提取,溶液分配到二氯甲烷层,后过中性氧化铝柱净化,采用高效液相色谱分离,二极管阵列检测器检测,外标法定量.本法简便、快速、定量准确、精密度高,适用于水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿残留量的检测.
【总页数】3页(P52-54)
【作者】金雁;刘宁;姚家彪;赵颖;孟祥勇
【作者单位】沈阳出入境检验检疫局,沈阳,110016;沈阳出入境检验检疫局,沈阳,110016;沈阳出入境检验检疫局,沈阳,110016;沈阳出入境检验检疫局,沈
阳,110016;沈阳出入境检验检疫局,沈阳,110016
【正文语种】中文
【中图分类】O6
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1.高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿及隐色孔雀石绿的残留 [J], 施彩仙;周亚莲;马秋玲;王森;周丽燕;周建昌
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水中孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿、隐色结晶紫
快速检验方法
一、【检测原理】
水中的孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物隐色孔雀石绿、隐色结晶紫经过孔雀石绿专用SPE小柱富集、衍生化后在小柱上形成有色环带，可初步判断水样中是否含有待检物质。

用洗脱剂洗脱，收集洗脱液，即可定性检测。

二、【检测范围】
水体
三、【技术指标】
检测下限：2.0μg/kg
四、【检验步骤】
1、取样：取待检水样约50mL，若样品杂质较多可先用滤纸过滤去除杂质。

2、过层析柱：将50mL注射器与层析柱串接，将1中水样加入注射器中。

从上口加压，加快流速，建议样本通过柱子的时间为10min左右。

3、观察结果：去掉注射器，加入2mL蒸馏水洗涤，用吸耳球从上口加压挤干，观察层析柱中吸附剂颜色变化，若吸附剂逐渐形成绿色环带，可初步判断样本中含有孔雀石绿；若吸附剂逐渐形成紫色环带，可初步判断样本中含有结晶紫。

4、检测孔雀石绿或结晶紫含量：取0.8mL洗脱液于富集有待检样品的层析柱中,用比色管收集洗脱液判断是否含有孔雀石绿或结晶紫。

5、隐色孔雀石绿及隐色结晶紫检验：用2mL蒸馏水洗涤4中洗脱后的层析柱挤干，取1瓶衍生化试剂全部加入层析柱中后再加入2mL蒸馏水，挤干后将4中的洗脱剂全部加入层析柱中挤干，用比色管接收洗脱液，再加入0.8mL 洗脱液挤干，合并洗脱液，加入0.5mL蒸馏水及0.5mL萃取剂，振荡混匀后静置观察下层，既可判断是否含有所检物质。

１００４ １６５６２０２００７ １１７０ ０６淡水鱼中隐性孔雀石绿的快速提取和检测刘　柳 ，徐传杰２，韦媛媛１，林　华３，忻　欣４，韩　莹４，粟　晖１（１．广西糖资源绿色加工重点实验室，广西科技大学，广西　柳州　５４５００６；２．广西壮族自治区计量检测研究院，广西　南宁　５３０００７；３．柳州市食品药品检验所，广西　柳州　５４５００６；４．西派特（北京）科技有限公司，北京　１０００２９）摘要：基于向量 子空间夹角判据，建立了淡水鱼中隐性孔雀石绿（ＬＭＧ）的快速提取和紫外光谱检测方法。

首先采用高效液相色谱 紫外可见光谱仪联用，建立不含待测组分ＬＭＧ的淡水鱼本底数据库；然后采集ＬＭＧ的标准光谱数据库，即可建立快速分析的数学模型。

运用该模型，直接采集市售淡水鱼的紫外可见光谱即可快速计算ＬＭＧ的含量。

实验结果表明：快速分析法和高效液相色谱法结果接近，加标回收率在９２～１２０％之间；乙腈提取法的提取率高于国标法，相对标准偏差小于５％，重现性好，解决了现有隐性孔雀石绿提取方法繁琐的问题；实现了淡水鱼中隐性孔雀石绿快速提取和检测。

关键词：隐性孔雀石绿；孔雀石绿；向量 子空间夹角；紫外可见光谱中图分类号：Ｏ６５７ ３ 文献标志码：ＡＲａｐｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｌｅｕｃｏｍａｌａｃｈｉｔｅｇｒｅｅｎｉｎｆｒｅｓｈｗａｔｅｒｆｉｓｈＬＩＵＬｉｕ１，ＸＵＣｈｕａｎ ｊｉｅ２，ＷＥＩＹｕａｎ ｙｕａｎ１，ＬＩＮ ｈｕａ３，ＸＩＮＸｉｎ４，ＨＡＮＹｉｎ４，ＳＵＨｕｉ１（１．ＧｕａｎｇｘｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｒｅｅｎＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇｏｆＳｕｇａｒＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，ＧｕａｎｇｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＬｉｕＺｈｏｕ５４５００６，Ｃｈｉｎａ；２．ＧｕａｎｇｘｉＺｈｕａｎｇＡｕｔｏｎｏｍｏｕｓＲｅｇｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｅｔｒｏｌｏｇｙ＆Ｔｅｓｔ，ＮａｎＮｉｎｇ５３０００７，Ｃｈｉｎａ；３．ＬｉｕｚｈｏｕＩｎｓｔｉｔｕｅｆｏｒＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌ，ＬｉｕＺｈｏｕ５４５００６，Ｃｈｉｎａ；４．ＣＳＥＰＡＴ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００２９，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｒａｐｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄＵＶａｎａｌｙｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｏｆＬＭＧｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｃｒｉｔｅｒｉｏｎｏｆｖｅｃｔｏｒ ｓｕｂｓｐａｃｅ．Ｆｉｒｓｔｌｙ，ｔｈｅｓａｍｐｌｅｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｓｐｅｃｔｒｕｍｄａｔａｂａｓｅｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｓｅｐａｒａｔｅｄｂｙＨＰＬＣ ＵＶ，ｗｈｉｃｈｄｏｅｓ’ｔｃｏｎｔａｉｎＬＭＧｓｐｅｃｔｒａｍａｔｒｉｘｄｅｄｕｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｐｅｃｔｒｕｍｄａｔａｂａｓｅ．Ｓｅｃｏｎｄｌｙ，ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇＬＭＧｓｔａｎｄａｒｄｓｐｅｃｔｒｕｍ．Ｔｈｅｎｔｈｅｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓｍｏｄｅｌｗａｓｃｏｎ ｓｔｒｕｃｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓａｍｐｌｅｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｍａｔｒｉｘａｎｄＬＭＧｓｔａｎｄａｒｄｓｐｅｃｔｒｕｍｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅＬＭＧｉｎｆｒｅｓｈｗａｔｅｒｆｉｓｈｂｙｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇｔｈｅＵＶｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆｓａｍｐｌｅ．ＴｈｅｓｔｕｄｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｒａｐｉｄａｎａｌｙｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅｃｌｏｓｅｔｏＨＰＬＣ，ｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅｓｗｅｒｅ９２％～１２０％；ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｓｗｉｔｈＡｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅｗｅｒｅｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｔｈｅｎａｔｉｏｎａｌｓｔａｎｄａｒｄｍｅｔｈｏｄ，ｗｈｉｃｈｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎｏｆｒａｐｉｄｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗａｓｗｉｔｈｉｎ５％ｗｉｔｈｇｏｏｄｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ．ＴｈｉｓｍｅｔｈｏｄｗａｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｆｏｒｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＬＭＧｉｎｆｒｅｓｈｗａｔｅｒｆｉｓｈａｎｄｓｏｌｖｅｄｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｓｏｆｃｏｍｐｌｅｘｏｐｅｒａｔｉｏｎ．收稿日期：２０１９ １１ ２１；修回日期：２０２０ ０４ ０１基金项目：广西重点研发计划（桂科ＡＢ１６３８０３４８）资助联系人简介：粟晖（１９７１ ），女，教授，硕士，主要从事为过程分析技术研究。

专利名称：淡水鱼中孔雀石绿的快速提取和检测方法
专利类型：发明专利
发明人：刘柳,徐传杰,韦媛媛,忻欣,韩莹,林华,粟晖,吴雨婷,覃雪霞
申请号：CN201910044586.4
申请日：20190117
公开号：CN109765087A
公开日：
20190517
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及孔雀石绿的检测方法，具体涉及淡水鱼中孔雀石绿的快速提取和检测方法，首先利用乙腈快速提取淡水鱼(在含有孔雀石绿的水池中饲养)中的孔雀石绿和隐性孔雀石绿，分成两份，一份加入硼氢化钾粉末将孔雀石绿转化成隐性孔雀石绿，得到不含孔雀石绿的样品本底，采集其紫外‑可见光谱得到本底的数据N，另一份直接采集紫外‑可见光谱作为待测样本数据c，第二，建立孔雀石绿的紫外‑可见标准光谱数据库V，第三，采用向量‑子空间夹角判据法计算待测样品中的孔雀石绿含量。

本发明解决了现有国标中孔雀石绿提取方法繁琐以及采用高效液相色谱法分析孔雀石绿耗时长，大量使用溶剂等问题，实现淡水鱼中孔雀石绿的快速分析，便于推广。

申请人：广西科技大学,广西壮族自治区计量检测研究院
地址：545006 广西壮族自治区柳州市广西科技大学东环路268号
国籍：CN
代理机构：北京国坤专利代理事务所(普通合伙)
代理人：王峰刚
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[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 101067619A [43]公开日2007年11月7日[21]申请号200710068348.4[22]申请日2007.04.27[21]申请号200710068348.4[71]申请人浙江大学地址310029浙江省杭州市凯旋路268号浙江大学华家池校区昆虫科学研究所共同申请人杭州安达生物科技有限公司[72]发明人沈建福 张岳 李蕾蕾 陈秋平 [74]专利代理机构杭州天勤知识产权代理有限公司代理人胡红娟[51]Int.CI.G01N 30/02 (2006.01)权利要求书 2 页 说明书 4 页 附图 1 页[54]发明名称孔雀石绿快速检测方法及快速检测试剂盒[57]摘要本发明公开了一种孔雀石绿快速检测方法，将待测样品与提取剂混合后静置，取上清液加入层析柱中，观察层析柱中最下层吸附剂颜色变化，若形成绿色环带，可判断样品中含有孔雀石绿；提取剂为乙腈与乙酸乙酯混合液和酸性氧化铝，其中乙腈与乙酸乙酯体积比＝1∶15～30，所述的待测样品质量与乙腈与乙酸乙酯混合液的体积比为1∶3；待测样品与酸性氧化铝的质量比为2∶1。

本发明采用乙腈－乙酸乙酯溶液提取，使水产品中的孔雀石绿提取更完全并且显著降低了所用试剂的毒性，对脂肪含量较高的产品也具有较强的适用性。

200710068348.4权 利 要 求 书第1/2页 1、一种孔雀石绿快速检测方法，其特征在于：将待测样品与提取剂混合后静置，取上清液加入层析柱中，观察层析柱中最下层吸附剂颜色变化，若形成绿色环带，可判断样品中含有孔雀石绿；所述的提取剂为乙腈与乙酸乙酯混合液和酸性氧化铝，其中乙腈与乙酸乙酯体积比＝1∶15～30，所述的待测样品质量与乙腈与乙酸乙酯混合液的体积比为1∶3；待测样品与酸性氧化铝的质量比为2∶1。

2、如权利要求1所述的孔雀石绿快速检测方法，其特征在于：所述的提取剂中乙腈与乙酸乙酯体积比＝1∶20。

水产品孔雀石绿和隐性孔雀石绿快速定量检测研究桑丽雅;朱晓华;郑百芹;董李学;邵伟;王振国【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2014(000)010【摘要】采用胶体金免疫层析方法建立了水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的定量检测，并对其样品前处理方法进行了研究。

结果表明，孔雀石绿的线性范围为0.25μg/L～8μg/L，线性系数0.9961；优化后孔雀石绿提取液的pH为4.5，对甲苯磺酸浓度为0.06 mol/L，净化剂为2 g中性氧化铝，脱水剂为2 g氯化钙，氧化剂为100μL 0.1%四氯苯醌；孔雀石绿加标回收率为80.1%～89.6%，隐性孔雀石绿加标回收率为66.9%～72.9%，相对标准偏差1.07%～8.14%。

【总页数】4页(P92-95)【作者】桑丽雅;朱晓华;郑百芹;董李学;邵伟;王振国【作者单位】杭州南开日新生物技术有限公司，浙江杭州310022;江苏省淡水水产研究所，江苏南京210017;唐山市畜牧水产品质量监测中心，河北唐山063000;唐山市畜牧水产品质量监测中心，河北唐山063000;杭州南开日新生物技术有限公司，浙江杭州310022;杭州南开日新生物技术有限公司，浙江杭州310022【正文语种】中文【相关文献】1.高效液相色谱-质谱法对水产品中孔雀石绿、隐性孔雀石绿及己烯雌酚的测定 [J], 白志荣;李娜林;高娃;郭艳琼;马占山2.用LC/MS/MS快速检测食品中的孔雀石绿、结晶紫、隐性孔雀石绿、隐性结晶紫 [J], 赵亮3.柱前电化学衍生-高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿及隐性孔雀石绿 [J], 胡江涛;俞凌云;于刚;帅培强;张莹;吴孟茹;张琴4.液相色谱紫外／荧光检测法测定水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿 [J], 孙协军;谢田雨;郭永健;杜兴军;李秀霞5.SDS增敏同步荧光测定水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿 [J], 彭爱红;付媛媛;龚昕;陈晓梅;林郑忠;黄志勇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。