淋巴细胞培养

1. 掌握人外周血淋巴细胞体外培养技术。

2. 学习制备染色体标本并进行核型分析。

3. 了解淋巴细胞有丝分裂过程及其影响因素。

二、实验原理淋巴细胞是免疫系统中的重要细胞，在免疫应答和维持内环境稳定中起关键作用。

在体外培养条件下，淋巴细胞受到植物血球凝集素（PHA）的刺激，可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂周期。

通过秋水仙素处理，使细胞分裂停滞在中期，便于染色体标本的制备和核型分析。

三、实验材料1. 实验动物：小鼠2. 试剂：PHA、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、PRMI 1640或M199培养基、小牛血清、肝素、双抗等3. 仪器：显微镜、培养箱、吸管、培养瓶、载玻片、酒精灯、碘酒、无菌棉签等四、实验方法1. 采样：无菌条件下，取小鼠外周血0.5-1ml。

2. 培养液配制：无菌条件下，按照比例配制PRMI 1640或M199培养基、小牛血清、PHA、肝素、双抗等。

3. 细胞培养：将外周血加入培养瓶中，每瓶加20滴左右，轻摇均匀。

将培养瓶置于36℃培养箱中培养72小时，每隔12小时轻摇1次。

4. 秋水仙素处理：在培养72小时后，加入适量秋水仙素，使细胞分裂停滞在中期。

5. 细胞收获：收获细胞，进行低渗处理，使细胞膜破裂，染色体释放。

6. 固定：将低渗处理后的细胞加入甲醇和冰醋酸的混合液中固定。

7. 染色：将固定后的细胞涂片，进行染色。

8. 显微镜观察：在显微镜下观察染色体形态，进行核型分析。

1. 细胞培养：在培养过程中，细胞逐渐增多，形成细胞群体。

2. 秋水仙素处理：细胞分裂停滞在中期，染色体形态清晰。

3. 显微镜观察：观察到人类染色体，男性为46，XY；女性为46，XX。

六、实验讨论1. 外周血淋巴细胞培养的成功与否，取决于培养液的成分和培养条件。

本实验采用PRMI 1640或M199培养基，并加入适量小牛血清、PHA、肝素、双抗等，保证了细胞的正常生长。

2. 秋水仙素处理是本实验的关键步骤。

适量的秋水仙素可以使细胞分裂停滞在中期，便于染色体标本的制备和核型分析。

小鼠淋巴细胞的分离培养
一、血液中淋巴细胞的分离：
1在1.5ML离心管中加入淋巴细胞分离液0.7ML；
2眼部采集小鼠的抗凝血，抗凝剂20%.。

3轻轻将血液加入淋巴细胞分离液的表面，立即以2000—2500转/分离心10MIN。

4小心吸取上层细胞，转移至另一1.5ML离心管中,再用HANK’S 悬浮至1.5ML，再离心，去上清，再悬浮，等待分型用。

二、鼠脾脏中淋巴细胞的分离：
1无菌采集鼠的脾脏，且灭菌注射器的弯针头轻轻扎取，尽可能使单个细胞分离，再分别用4层灭菌纱布过滤2次。

2将滤液小心加入淋巴细胞分离液中。

离心。

3 吸取上层淋巴细胞，HANK‘S液洗涤2次（尽可能去除淋巴
细胞分离液）。

4加入1640培养液进行培养。

、
*淋巴细胞分离液不低于全部液体的50%。

淋巴细胞增殖实验细胞形态法
淋巴细胞增殖实验是一种常用的细胞生物学实验方法，用于研究淋巴细胞的增殖能力。

其中，细胞形态法是一种直接观察和描述细胞形态变化的方法。

下面是该实验的步骤：
1. 细胞准备：收集需要进行实验的淋巴细胞，并将其分散在培养基中。

2. 细胞培养：将淋巴细胞悬浮液加入培养皿中，放置在恒温培养箱中，使其在适宜的温度、湿度和氧气条件下培养。

3. 处理因子添加：根据实验设计的要求，可以在培养期间添加不同的诱导因子或抑制因子，以刺激或抑制淋巴细胞的增殖。

4. 细胞观察：在特定时间点（例如24小时、48小时等）取出培养皿中的细胞，使用显微镜观察细胞形态的变化。

5. 形态描述：通过观察细胞的大小、形状、颜色、胞质和核的结构等特征，描述细胞在不同处理条件下的形态变
化。

6. 数据分析：根据形态观察结果，结合其他实验数据（如细胞计数、代谢活性等），进行统计分析和结果解释。

通过淋巴细胞增殖实验细胞形态法，可以评估淋巴细胞的增殖能力，并揭示不同因子对细胞形态的影响，有助于进一步研究淋巴细胞的生物学特性和相关疾病的发生机制。

・诊断技术・淋巴细胞培养条件及常见失败原因探讨遵义医学院附属医院肾病风湿科(563003)　刘春梅　赵士启　张克非　陈忠霞　刘　永 淋巴细胞培养是实验研究常用的一项技术,对于培养器皿,可以选用培养板,培养瓶,培养皿,三角烧瓶,试管,青、链霉素小瓶等[1,2]。

目前,关于淋巴细胞分离方法的文献资料较多,论述较详细,而对淋巴细胞培养则论述较少,较简单。

细胞培养工作十分繁琐,环节较多,探讨细胞培养的条件,对于成功培养细胞具有十分重要的意义。

本文选用1.5ml离心管培养淋巴细胞,观察了淋巴细胞培养前后的变化,探讨了淋巴细胞培养的条件及失败的常见原因。

现报道如下。

1　材料与方法1.1　主要材料和设备　淋巴细胞分离液(上海试剂二厂):RPMI1640培养液(G ibco,华美生物工程公司进口分装);血清(各实验对象的自身血清);肝素溶液(250U/m1),D’—Hanks液,lm ol/L盐酸,516%氢氧化钠溶液,2%台盼蓝染液,均为本实验室自配; pH试纸(上海三爱思试剂有限公司);1.5ml离心管(Axygen);10ml、15ml、50ml刻度离心管;毛细吸管;移液枪,1～200μl、1000μlT ip(枪头);洁净工作台(月坛牌,北京冠鹏净化设备有限公司);HC—TPⅡ-5架盘药物天平(上海第二天平仪器厂);水平式低速离心机(北京医用离心机厂);kx—21N血细胞自动分析仪(Sysmex,日本):O LY MPUS倒置显微镜;Shel LABC O2恒温培养箱(37℃,5%C O2)(Shelton manufac2 turing,inc,US A);BC D—218冰箱(澳柯玛);202-2型电热恒温干燥箱(上海实验仪器厂有限公司)。

1.2　研究对象　为2003年3～8月住本院肾内科的部分病人。

其中,原发性肾病综合征患者18例(男10例,女8例),年龄15～53岁(平均31.28±11.83岁);慢性肾小球肾炎患者11例(男8例,女3例),年龄18～49岁(平均38.00±8.83岁)。

淋巴细胞培养方法引言：淋巴细胞是机体中重要的免疫细胞，其培养方法对于研究免疫功能、疾病发生机制以及药物筛选具有重要意义。

本文将介绍一种常用的淋巴细胞培养方法，帮助研究者进行淋巴细胞的体外培养。

一、材料和试剂准备1. 血液样品：采集新鲜、无菌的血液样品，尽量避免使用已保存的血液。

2. 培养基：常用的淋巴细胞培养基包括RPMI 1640培养基、DMEM培养基等，可根据实验需要选择合适的培养基。

3. 补充物：培养基中可添加的补充物包括胎牛血清(FBS)、人血清(HS)、重组细胞因子等。

4. 抗生素：培养过程中可添加适量的抗生素，如青霉素和链霉素等，以抑制细菌和真菌的污染。

二、淋巴细胞分离1. 密度梯度离心法：将新鲜血液样品稀释后，加入离心管中，缓慢加入等体积的淋巴细胞分离液，离心后淋巴细胞会沉积在离心管底部，可用无菌移液器吸取上清液。

2. 磁珠分离法：利用磁珠表面特异性抗体与淋巴细胞表面标志物结合，通过磁力将淋巴细胞与其他细胞分离。

三、淋巴细胞培养1. 细胞计数和调整：将分离得到的淋巴细胞进行细胞计数，根据需要调整细胞密度，通常为1-2×10^6个细胞/mL。

2. 培养基配置：根据实验需要配置相应的培养基，通常包括培养基、补充物和抗生素。

3. 培养条件：将淋巴细胞悬浮液均匀地加入含有培养基的培养皿中，置于37℃恒温培养箱中，通常采用5% CO2气氛。

4. 细胞增殖：培养过程中，淋巴细胞会进行增殖，可根据需要进行细胞传代。

5. 培养液更换：一般情况下，每2-3天更换一次培养液，以保持培养环境的稳定。

6. 实验操作：在培养过程中，可根据具体实验需要进行细胞刺激、药物处理等，以模拟体内环境或研究特定的生物学功能。

四、细胞检测和分析1. 细胞活力检测：使用细胞活力试剂盒等方法，对培养的淋巴细胞进行细胞活力检测，评估其生存状态和增殖情况。

2. 免疫分析：可使用流式细胞术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化等方法，对培养的淋巴细胞进行免疫表型分析、细胞因子检测等。

・诊断技术・淋巴细胞培养条件及常见失败原因探讨遵义医学院附属医院肾病风湿科(563003)　刘春梅　赵士启　张克非　陈忠霞　刘　永 淋巴细胞培养是实验研究常用的一项技术,对于培养器皿,可以选用培养板,培养瓶,培养皿,三角烧瓶,试管,青、链霉素小瓶等[1,2]。

目前,关于淋巴细胞分离方法的文献资料较多,论述较详细,而对淋巴细胞培养则论述较少,较简单。

细胞培养工作十分繁琐,环节较多,探讨细胞培养的条件,对于成功培养细胞具有十分重要的意义。

本文选用1.5ml离心管培养淋巴细胞,观察了淋巴细胞培养前后的变化,探讨了淋巴细胞培养的条件及失败的常见原因。

现报道如下。

1　材料与方法1.1　主要材料和设备　淋巴细胞分离液(上海试剂二厂):RPMI1640培养液(G ibco,华美生物工程公司进口分装);血清(各实验对象的自身血清);肝素溶液(250U/m1),D’—Hanks液,lm ol/L盐酸,516%氢氧化钠溶液,2%台盼蓝染液,均为本实验室自配; pH试纸(上海三爱思试剂有限公司);1.5ml离心管(Axygen);10ml、15ml、50ml刻度离心管;毛细吸管;移液枪,1～200μl、1000μlT ip(枪头);洁净工作台(月坛牌,北京冠鹏净化设备有限公司);HC—TPⅡ-5架盘药物天平(上海第二天平仪器厂);水平式低速离心机(北京医用离心机厂);kx—21N血细胞自动分析仪(Sysmex,日本):O LY MPUS倒置显微镜;Shel LABC O2恒温培养箱(37℃,5%C O2)(Shelton manufac2 turing,inc,US A);BC D—218冰箱(澳柯玛);202-2型电热恒温干燥箱(上海实验仪器厂有限公司)。

1.2　研究对象　为2003年3～8月住本院肾内科的部分病人。

其中,原发性肾病综合征患者18例(男10例,女8例),年龄15～53岁(平均31.28±11.83岁);慢性肾小球肾炎患者11例(男8例,女3例),年龄18～49岁(平均38.00±8.83岁)。

二、论文细胞培养法淋巴细胞微核标本的制作过程及注意事项北京市预防医学研究中心于贵新1材料与方法1．1人员：接触放射性工作的岗前、在岗及离岗人员。

1．2接种：消毒1640培养基，抽静脉血接种于1640培养基内，混匀，浓度适当。

瓶上写清楚受检者姓名或者实验室自行编号。

1．3培养：接种后将培养基放于(37±0．5)℃恒温培养箱内培养72h。

1．4收获：1．4．1收集细胞：将细胞悬液混匀倒人编好号的离心管中，离心1000rpm，6min，弃上清液。

1．4．2低渗：加入0．075mol／L氯化钾低渗液5ml，用滴管轻打混匀，低渗6—8min。

1．4．3预固定：加入lml固定液，轻轻混匀后1000rpm离心6min。

固定液为甲醇：冰醋酸(3：1)。

1．4．4固定：弃上清液，加入5ml固定液，轻轻混匀，静置10min。

1000rpm 离心6min，弃上清液。

重复操作固定步骤2—3次，直至固定液透明为止。

1．4．5制悬液：弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液打匀。

1．5滴片：吸取细胞悬液滴在一张洁净的4℃湿的载玻片上，轻吹散，风干，及时正确编号。

1．6染色：Giemsa染液染色20min左右，细水冲洗多余染液，风干。

1．7镜检：光学显微镜下计数1000个胞体完整、已转化的淋巴细胞，计数淋巴细胞微核，以千分率(‰)表示。

1．8微核判定标准：微核应位于完整的淋巴细胞胞浆内，与主核完全分开(如有重叠或相切，必须看到各自的完整核膜)，呈圆形或椭圆形，结构与主核相同，着色与主核一致或略浅，不折光，大小为主核的1／3以下的小核姑3。

2评价为好片的标准细胞数量多、分布均匀、密度适中、染色清晰、核浆分明、透明度好。

3注意事项3．1要严格进行消毒，避免细胞在培养过程中细菌污染，影响制片效果及阅片。

3．2接种血液量要适当，太多不容易打散，太少不易观察。

3．3培养温度应严格控制在(37±0．5)。

C。

3．4微核制备操作过程中最关键的步骤是低渗处理，低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀。