混合淋巴细胞反应

BTLA介导的负调共刺激信号对混合淋巴细胞反应抑制的研究冯嘉瑜;方针强;宋波;张艮甫;黄赤兵;王平贤;范明齐;肖亚;贾维胜【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2006(035)015【摘要】目的 HVEM基因突变体腺病毒载体对大鼠混合淋巴细胞反应(MLR)的影响.方法 RT-PCR获得人HVEM的cDNA,使其与LIGHT分子结合的表位点突变,保留与BTLA结合的关健位点.构建经修饰的HVEM基因的复制缺陷型腺病毒载体Adv-mHVEM-IRES2-EGFP并对其进行鉴定和转染效率测定.将该载体用于混合淋巴细胞反应中,观察对淋巴细胞增殖的影响.结果成功构建HVEM突变体和EGFP 复制缺陷型腺病毒载体,经过测序与预期一致,体外培养细胞转染效率达到95%以上.该载体能够对大鼠MLR有明细的抑制作用.结论构建的腺病毒载体能够共表达目的基因的产物HVEM突变体和EGFP蛋白,对体外细胞具有高效转染能力.该载体能够对大鼠混合淋巴细胞反应有明显的抑制作用.【总页数】3页(P1366-1368)【作者】冯嘉瑜;方针强;宋波;张艮甫;黄赤兵;王平贤;范明齐;肖亚;贾维胜【作者单位】第三军医大学西南医院泌尿外科,重庆,400038;第三军医大学新桥医院泌尿外科,重庆,400037;第三军医大学西南医院泌尿外科,重庆,400038;第三军医大学新桥医院泌尿外科,重庆,400037;第三军医大学新桥医院泌尿外科,重庆,400037;第三军医大学新桥医院泌尿外科,重庆,400037;第三军医大学新桥医院泌尿外科,重庆,400037;第三军医大学新桥医院泌尿外科,重庆,400037;第三军医大学新桥医院泌尿外科,重庆,400037【正文语种】中文【中图分类】Q26【相关文献】1.BTLA介导的负调共刺激信号对小鼠心脏移植受体Treg的影响 [J], 冯嘉瑜;肖亚;范明齐;黄赤兵;张艮甫;王平贤;贾维胜;方针强2.同种和异种混合淋巴细胞反应及分类混合淋巴细胞反应的比较 [J], 王英禹;王云杰;张瑞3.同种异基因成骨细胞对混合淋巴细胞反应体系中T细胞的免疫抑制 [J], 盘荣贵;范鍥;邓耀良;赵劲民4.混合淋巴细胞反应体系中胎盘间充质干细胞的免疫抑制效应 [J], 薛一峰;黄建荣;孙鸿丽;苗宗宁5.浓缩红细胞和去白细胞的浓缩红细胞对双向混合淋巴细胞反应的抑制作用研究[J], 骆群;刘景汉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

淋巴细胞亚群分析报告一、背景介绍淋巴细胞是免疫系统中的重要成分，通过分析淋巴细胞亚群的分布情况，可以评估机体的免疫功能及潜在疾病风险。

本报告旨在对您进行淋巴细胞亚群分析，以提供对您免疫系统状况的了解。

二、实验方法我们采用了流式细胞术（flow cytometry）对您的淋巴细胞亚群进行检测。

通过自动计数细胞的特定抗体标记，我们能够高效准确地分析淋巴细胞的亚群分布情况。

三、结果解读1. CD3+ T淋巴细胞CD3+ T淋巴细胞是一类非常重要的免疫细胞，负责调节和执行免疫应答。

根据我们的检测结果显示，您的CD3+ T淋巴细胞数量处于正常范围内。

2. CD4+ T细胞CD4+ T细胞又称为辅助性T细胞，对机体的免疫反应起重要作用。

根据检测结果，您的CD4+ T细胞比例为XX%，处于正常范围。

3. CD8+ T细胞CD8+ T细胞是细胞介导的免疫反应的关键成分，负责杀伤感染的细胞和控制体内的肿瘤细胞。

我们的结果显示，您的CD8+ T细胞比例为XX%，处于正常范围。

4. CD4+/CD8+ 比值CD4+/CD8+ 比值是评估免疫功能的重要指标之一。

正常情况下，CD4+/CD8+ 比值在1.5到2.5之间。

根据我们的检测结果，您的CD4+/CD8+ 比值为XX，可判断您的免疫功能正常。

5. NK细胞NK细胞是重要的自然杀伤细胞，对抗病毒感染和肿瘤细胞起到重要作用。

根据我们的检测结果，您的NK细胞比例为XX%，处于正常范围。

四、结果分析根据对您淋巴细胞亚群的分析，您的免疫系统状况良好，各项指标均在正常范围内。

您的CD4+/CD8+ 比值正常，表明您的免疫应答和监测能力正常。

此外，您的NK细胞比例正常，对抵抗感染和抗肿瘤细胞有良好的保护作用。

然而，请注意，本报告只是对您淋巴细胞亚群的初步分析，仅能提供免疫系统的总体情况。

如有其他相关检测需求或担忧，建议您咨询专业医生或进行更全面的免疫功能评估。

五、结论通过对您淋巴细胞亚群的分析，我们认为您的免疫系统状况良好，各项指标处于正常范围内。

淋巴细胞转化（lymphocyte transformation）实验步骤
实验步骤
采血：
需要在严格无菌条件下采血。

肝素抗凝，室温保存，24hr-72hr转化效率高。

也有保存更长时间，采血后不要将血液置冰箱中，长途运输也不要冷藏。

分离淋巴细胞：
采集血液4-5mL，与2mL1640（含1%双抗）在离心管内混合，然后缓慢沿管壁注入淋巴分离液（已37℃预热），3000rpm离心 30min。

收集白细胞层，转移至另一离心管中，加入10mL1640（含1%双抗），轻轻吹打均匀，1500 rpm离心15min。

弃上清，如此反复洗涤3次，收集白细胞。

转化
取1 mL全培养基（+0.5%pHA）加入已经洗涤三次的白细胞离心管中，轻轻吹打均匀，转入24孔板中，加入自备EBV液0.6mL，20ug/ mL环孢霉素0.2 mL，放入37℃5%CO2培养箱中培养。

3-4天后观察细胞，镜下可见集合的细胞团，以及已被转化的明显增大
的类淋母细胞，4-5天后可加入0.5 mL全培养基（1640+15%FBS+1%双抗+1.6%1M Hepes），然后视细胞生长情况更换培养基，并且转入培养瓶中。

附：
EBV液制备：
培养B95-8细胞，待细胞长满，培养基变黄，收集于50mL离心管中，于-80℃冰箱中，过夜，37℃水浴融化，再置于-80℃冰箱中，如此反复冻融三次，2000 rpm离心20min，上清0.2um过膜，-80℃冰箱中冻存备用。

病理学理论指导：混合血栓的特点第一篇：病理学理论指导：混合血栓的特点肉眼：与血管壁粘连，构成延续性血栓的体部。

镜下：淡红色的珊瑚状的血小板小梁和小梁间由充满红细胞的纤维素网所构成，血小板小梁边缘有较多的中性粒细胞粘附。

第二篇：病理学理论指导：支气管扩张症的病理特点（一）病因和发病机制1、管壁的支撑结构的损坏2、遗传因素（二）病理变化1、肉眼观：病变支气管可呈圆柱状或囊状扩张，肺呈蜂窝状。

扩张的管腔内常潴有黄绿色脓性或血性渗出物。

周围肺组织常发生程度不等的肺萎陷、纤维化和肺气肿。

先天性支气管扩张常呈多囊状。

2、镜下：支气管壁呈慢性炎症、不同程度的组织破坏、鳞状上皮化生、支气管周围的纤维组织增生。

（三）临床病理联系及结局：并发肺脓肿、脓胸、脓气胸。

若经血道播散可引起脑膜炎、脑脓肿等。

可导致肺动脉高压，引起肺心病。

第三篇：病理学理论指导：恶性淋巴瘤的性质和形态特点1.霍奇金淋巴瘤（1）病理变化：主要发生部位在颈部和锁骨上淋巴结，其次为纵隔，腹膜后等处淋巴结。

肉眼观，淋巴结肿大，以后可互相粘连，形成大的结节状肿块。

镜下淋巴结结构部分或全部破坏，可见霍奇金肿瘤细胞分散在反应性增生的细胞中（主要是淋巴细胞、组织细胞、嗜酸粒细胞、浆细胞、中性粒细胞及成纤维细胞等）。

霍奇金瘤细胞形态多样，主要有以下几种：①R-S细胞：对霍奇金淋巴瘤具有诊断意义的，最具代表性的瘤细胞，细胞体积大，15～45μm，胞质丰富，嗜酸性。

核大，核膜厚、泡状、中央有一大而圆、伊红染色的核仁，核仁周围有一空晕。

双核的R-S细胞，两核对称，形如镜中之影故称镜影细胞。

有的可为多核；②霍奇金细胞：体积较大，胞质淡染，核大，扭曲或分叶状，核仁或大或小；③陷窝细胞：细胞体积大，胞质丰富，淡染或透明。

核大分叶状，有小核仁。

组织固定后，胞浆收缩，与周围细胞之间形成透明空隙，细胞好似位于陷窝内：④多形性细胞：瘤细胞体积大小不等，有明显异型性。

核大，畸形，核仁大，核分裂象多见。

b细胞抗原递呈的试验方法
B细胞的抗原递呈功能可以通过多种实验方法进行研究和验证，以下是一些常见的试验方法：
1.混合淋巴细胞反应（MLR）：
可以通过体外混合B细胞与带有特定受体的CD4+ T细胞，如果B细胞表面提呈了T细胞识别的抗原肽-MHCⅡ类分子复合物，则会激活相应
的T细胞增殖。

通过检测T细胞增殖或细胞因子释放（如IFN-γ、IL-2
等）来评估B细胞的抗原递呈能力。

2.荧光激活细胞分选（FACS）分析：
用已知抗原处理B细胞后，可以使用荧光标记的特异性抗体来检测B细胞表面MHCⅡ类分子与其结合的抗原肽复合物表达水平，或者检测共
刺激分子如CD80、CD86的变化。

3.抗原肽加载实验：
人工合成含有特定抗原表位的短肽，将这些短肽与纯化的MHCⅡ类分
子体外结合后，再将其加载到B细胞上，随后观察这些加载有抗原肽的B细胞是否能够有效活化对应的CD4+ T细胞。

4.报告基因系统：
利用转基因技术构建报告基因小鼠模型，其中CD4+ T细胞携带报告基因，在与抗原提呈B细胞相互作用时可启动报告基因表达，从而间接证明B细胞的抗原递呈活性。

5.共培养及功能性实验：
将抗原预先刺激的B细胞与T细胞共培养，并监测T细胞分化为效应子细胞（如Th1、Th2、Th17或Treg细胞）的能力，或者其分泌的细胞因子类型和数量。

6.单细胞测序技术：
近年来，单细胞转录组测序等高通量技术也用于解析B细胞在抗原递呈过程中的转录变化，揭示不同亚群B细胞在抗原加工和递呈方面的异质性。

每种方法都有其适用范围和局限性，选择哪种方法取决于研究的具体目标和条件。

一、淋巴细胞转化试验（MTT）（一）原理：四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。

当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。

（二）材料：MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。

用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。

丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原（三）方法：1、脾细胞制备：（1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；（2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。

放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；（4）制备脾细胞悬液①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。

取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。

调整细胞浓度为5 105/ml。

②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；③酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。

MLR混合淋巴细胞反应混合淋巴细胞培养（MLC）或称混合淋巴细胞反应（MLR）常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原（HLA抗原）相容的程度。

由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。

一、实验原理两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLAⅡ类抗原中D和DP抗原（淋巴细胞鉴定的抗原，SD抗原）不同，可相互刺激对方的T细胞发生增殖，此为双向混合淋巴细胞培养（two way MLC）；若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素C（mytomycine C）处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养（one way MLC）。

两个个体间HLA抗原差异程度越大，反应越强烈，可通过细胞数量、形态检查或3H-TdR掺入率检测反应细胞的增殖水平。

如用经照射的、已知D位点抗原的纯合子分型细胞（Homozygous typing cell，HTC）作为刺激细胞，则可检测待检者的D位点抗原型别。

若待检者抗原与标准HLA-D抗原相同，MLC不发生增殖，此为HLA-D抗原阴性分型法。

EB病毒转化的B淋巴母细胞表达高水平的HLAⅡ类抗原，常作为单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞。

二、实验方法这里介绍多年前做过的MLR的方法，绝对正宗，传统的标准方法：1、方法分别取C57BL（H-2b）和Balb/C（H-2d）小鼠脾脏制备细胞悬液，Balb/C小鼠脾细胞悬液（2X107/ml）加丝裂霉素C（50微克/ml）处理，37oC，30min，培养液洗涤3次后用5%NBS培养液配制细胞悬液（5X106/ml），作为刺激细胞，加入96孔培养板，5X105/0.1ml/孔；再加入C57BL脾细胞悬液，为反应细胞，也是5X105/0.1ml/孔；另设单独刺激细胞孔和单独反应细胞孔，均为三复孔。

流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中小鼠脾脏的摘取（图文解说）作者: 日期:准备眼科镊和眼科剪若干 （文中笔者使用眼科流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中小鼠脾脏的摘取最近老婆要提取脾脏细胞做流式，我就做个简单的解说，也顺便传到网上供菜鸟理解， 如果有大神看到这篇文章，也欢迎指导。

大家一起讨论，把实验做得更好。

无论是做混合淋巴细胞反应或者流式细胞分析都要用到脾脏。

小鼠的脾脏摘取颇为简 单，但有很多同学是第一次接触，所以在此做一个简单的图文讲解。

在此讲解不甚详细，具 体步骤请同学参照网上已有各种Protocol,本文重点在于图文解说，让大家对照图片和其他Protocol 更好的理解脾脏的摘取。

小鼠处死后泡酒精 2-3分钟，泡久了细胞会缩水， 泡的时间短了起不到消毒杀菌的 作用摆好小鼠体位，取右侧卧位。

沿着小鼠左侧肋骨走行方向做切口。

直镊3把，眼科剪2把）四，向小鼠左后背方探查，在皮下很浅的地方可见深红色脾脏。

脾脏走行向与肋骨方向近似平行、宅.rI4*五, 用镊子轻轻提起脾脏。

脾脏下会连着许多结缔组织，轻轻把它们撕掉。

■ 'IkII-r--.7X XZ放于培养皿中【事先在培养皿中放入 PBS （混淋）或红裂（流式）和200 白色的为后面要用到的过滤六，完整摘下脾脏， 目的铁丝网】 如下右图所示，银色的为本步骤中使用的铁丝网, 膜七，一把新的眼科剪和一把新的眼科镊（新消毒过的。

本文所用的为新高压的），把脾脏在培养皿里剪成小块。

然后用 2.5ml或5ml注射器柄，把脾脏研磨成细胞。

研磨过程要轻柔，否则会损伤脾脏中的细胞。

4 A八, 研磨至培养皿中不见整块脾脏，只剩一些不能磨碎的结缔组织为止。

九，再加入4ml红细胞裂解液，冲洗铁丝网，注射器内芯，并用枪头吹打混匀，裂解5mi n十，将液体一并转入15ml离心管中，400g,5min,离心十^一, 弃去上清，加入5ml含10%FBS的1640 ,重悬，用装有200目的尼龙滤膜过滤(可过滤两次);尼龙滤膜就是第六步中右图的白色滤膜。