耳聋易感基因检测试剂盒实验标准操作程序
1.项目概述
耳聋是一种严重影响人类生活质量的常见先天性疾病，它可以由单一基因突变或不同基因的复合突变引起，也可由环境因素（如医疗因素，环境暴露，创伤，药物等）或基因和环境两者共同作用而致。在世界范围内，每1000名新生儿中就有1名先天性耳聋患儿，50% 患儿的耳聋与遗传因素有关。70%的遗传性耳聋不伴有其他症状，称为非综合征性耳聋 ( nonsyndromic hearing impairment, NSHI)。非综合征耳聋是最常见的感音神经性聋，可以分为常染色体显性（DFNA，15％~ 20%）、常染色体隐性（DFNB，80%）、性连锁（DFN X-linked，1%）和线粒体遗传性耳聋（1%）四类。迄今为止，共有114个耳聋位点见诸报道（54个为常染色体显性位点，60个为常染色体隐性位点）。40余个感音神经性耳聋基因和更多的综合征耳聋基因被克隆。据中国残疾人联合会网站统计，中国6000万残疾人口中2100万为听力残疾者。听力言语残疾者中7岁以下的聋儿达80万人并以每年新增3万聋儿的速度在增长。研究表明，大量的迟发性听力下降患者中，亦有许多患者也是由自身的基因缺陷致病，或由于基因缺陷和多态性造成对致聋环境因素易感性增加而致病。因此，需要开展耳聋基因检测，对于由明确检测到的基因缺陷致病的患者及早进行干预治疗与预防措施，提高患者的生活质量，降低患耳聋的风险度。
2.测定原理
本试剂盒采用了PCR体外扩增和DNA反向点杂交相结合的DNA芯片技术。
采用生物素标记的引物分别对耳聋易感基因突变区域进行特异性扩增，将扩增产物
与标记不同突变类型耳聋易感基因探针的尼龙膜在导流杂交仪上进行导流杂交，然后通过化学显色对结果进行判读。
3.样品采集和制备
3.1. 标本采集：
①成人男性和女性及患儿：采用无菌抗凝管(添加抗凝剂)，抽取静脉血2ml
耳聋易感基因检测试剂盒实验标准操作程序生效日期：
混匀，拧紧瓶盖并标上病人编号。
②滤纸血斑采集卡：婴儿采血方法
A.6周~4月或小于5kg的婴儿采用脚后跟采血法；
B.4~10月或5~10kg的婴儿采用脚大拇指采血；
C.大于10月或大于10kg的婴儿采用手指采血。
标本采集时，尽量让采集血液将圆圈浸满，以便试验有足够的标本量。
图1 采血部位
图2 采血流程
静脉采血后滤纸：用柠檬酸钠或EDTA抗凝管静脉血，采集的抗凝全血用移液器移取
75~80ul全血，对准采样圈中心缓慢将血液滴加在滤纸上，避免气泡产生；至少
采集3个血圈。
酒精消毒，用无
菌纱布垫擦干
针刺，无菌纱布
垫擦去第一滴血
用滤纸蘸取单个血滴，
让血滴充分浸润采血圈；
至少采集3个采血圈
温浴采血部位：不超
过41℃，3~5分钟
耳聋易感基因检测试剂盒实验标准操作程序生效日期：
3.2.滤纸血斑处理
血样采集完毕后，将制成的滤纸干血斑采集卡在干燥、清洁、平整、无吸水性的桌面放置3~4小时风干；或将采集卡放置于专业纸质干燥架上自然风干。不要放在太阳下晾晒或用任何人工方法（如烘干机）加速干燥。
3.3.滤纸干血斑的质量控制及有效性的判断
合格血斑的六条标准是①每个血斑直径要达到10mm；②同时取3个以上血斑；③血液必须完全渗透到滤纸背面；④无重叠；⑤无污染；⑥易洗脱。采集好的血斑标本应按要求保存，避免因保存不当造成标本固化于滤纸上，检测时被测物洗脱不下或部分洗脱，出现假阴性结果。
图3 有效样品
图4 无效样品
样本量不足
样本未干
血液粘连过度
血斑褪色、污染
出现血清环
血斑分层
3.4. 标本保存
3.4.1抗凝全血样本
a)短期保存：抗凝血在2-8℃存放7天以内，不影响DNA提取效果。当需要得到完整全长的基因组DNA时，抗凝血在2-8℃的保存不应超过3天。当抗凝血在4℃存放至两个月时，虽可提取DNA，但得率会相应下降。
b)长期保存：抗凝血在低温保存时（-20℃或-80℃），其保存时间可至两年以上而不影响纯化出高质量的DNA，但要避免反复冻融。
3.4.2滤纸干血斑样本
样品风干后，将每张滤纸片采集卡分装入封口袋中，最好在封口袋中同时放入干燥剂和保湿卡，轻轻将封口袋的空气挤压出去再封口，遵循一袋一卡的原则，以避免交叉污染。血片采集后，避光、防潮保存；常温干燥最多可保存3周， 2℃~8℃可保存一个月， -20℃可保存三个月。
3.5. 标本的运送
1）滤纸干血斑的递送
准确填写样本信息卡后，将采集卡和信息卡一同放入大信封，邮寄前再次核对送检单与样品是否相符。采用常温运输。
2）静脉血递送
从无菌抗凝管(添加抗凝剂，混匀）中吸取500ul外周血到EP管中，密封并标上病人编号等信息后，放置到具有匹配尺寸的标本架中，盖好盖子，用透明胶布黏好，同时附上打印好的患者信息（袋子装好），放置在具有冰袋的泡沫箱中，采用低温运输。
3.6拒收样本：不合格的样本
3.7不合格样本经审核退单处理的，如果委托方坚持要求检测，需签风险单。
4.仪器
高速离心机、PCR基因扩增仪、凯普导流杂交仪HB2012A等。
5.试剂
5.1厂家：凯普生物。
5.2稳定性：PCR试剂盒须置-20℃保存，杂交试剂盒须置2-8℃保存，提取试剂盒常温保存。
6.测定参数
凯普的耳聋基因检测试剂盒采用凯普独特的专利技术——导流杂交技术，结合低密度芯片技术检测遗传性耳聋患者所涉及的4个相关基因（GJB2, GJB3, SLC26A4和12S rRNA）的主要突变位点，在一张芯片上同时检测13种突变位点，检测类型如下表所示。
7.校准
7.1 本试剂无校准品，不适用。
7.2 定期仪器的校准，请参考相关仪器的校准标准操作规程。
8.操作步骤
8.1试剂的准备（试剂贮存和准备区）
8.1.1进入缓冲区,换上该区的蓝色工作服和工作鞋,带上口罩、帽子和手套。8.1.2从试剂盒中取出所需试剂盒，放置室温溶解后轻甩将管壁试剂甩到底部。
8.1.3 向AB管PCR混合液中各自加入15ulDNA聚合酶。振荡混均，再点动离心。
8.1.4 准备60个0.2PCR单管，A管，B管PCR混合液各自按28ul的体系分装
30人份。盖上盖子，做好相应标识。
8.1.5 取出当天要使用的分装好的PCR混合液，如果有当天使用不完的，请放置
于 -20冰箱保存，下次可以直接取出使用。请不要反复融。
8.2样本处理（标本制备区）
8.2.1血液样本提取
①进入缓冲区，换上该区的黄色工作服和工作鞋，带上口罩、帽子和手套。
②将抗凝血液标本解冻编号，振荡混匀。
③吸取200ul血液样本，若血液样本不足200ul时，用溶液P补足体积至200ul。
④加入20ul蛋白酶K，混匀。
⑤加入200ul溶液L，振荡混匀，56℃温浴15-20min，期间颠倒混匀数次。
⑥加入200ul无水乙醇，充分混匀，将全部液体转入装有2ml收集管的硅胶柱中，
10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。
⑦在硅胶柱中加入500ul溶液W1（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），
10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。
⑧在硅胶柱中加入500ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），
10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。
⑨在硅胶柱中加入500ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），
10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
⑩将硅胶柱放入收集管中，12000rpm空管离心3min，丢弃收集管。将硅胶柱放入新的1.5ml离心管中，开盖静置1-2min，往硅胶柱中心加入60-200ul的TE洗脱液（50-60℃预热），静置5min，12000rpm离心2min，丢弃硅胶柱，盖好离心管盖，做好相对应的编号。
（注意：TE洗脱液的体积应不少于50ul，体积过小影响回收率。为增加基因组DNA的回收率，可将TE洗脱液稍微加热。获得的DNA应保存在-20℃，以防DNA降解。）
8.2.2血斑样本提取
①进入缓冲区，换上该区的黄色工作服和工作鞋，带上口罩、帽子和手套。
②用打孔器将采集卡样本上的两个血斑卡剪下来，置于1.5ml离心管中（注意：
使用打孔器处理样本需注意避免交叉污染）
③加入300ul的溶液T（若血斑量较多时，相应增加适当量的溶液T，溶液T
没过血斑），再加入20ul蛋白酶K，混匀。
④56℃温浴25min，期间颠倒混匀数次。56℃温浴温浴后，点动离心，往上述EP 管中加入200ul的溶液L，震荡混匀，70℃温浴20min，把裂解后的液体转移到一个新的EP管中。
⑤加入200ul无水乙醇，充分混匀，将全部液体转入装有2ml收集管的硅胶柱中，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。
⑥在硅胶柱中加入500ul溶液W1（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），
10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。
⑦在硅胶柱中加入500ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），
10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。
⑧在硅胶柱中加入500ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
⑨将硅胶柱放入收集管中，12000rpm空管离心3min，丢弃收集管。将硅胶柱放
入新的1.5ml离心管中，开盖静置1-2min，往硅胶柱中心加入60ul的TE 洗脱液（50-60℃预热），静置5min，12000rpm离心2min，丢弃硅胶柱，盖好离心管盖，做好相对应的编号。（注意：TE洗脱液的体积应不少于50ul，体积过小影响回收率。为增加基因组DNA的回收率，可将TE洗脱液稍微加热。获得的DNA应保存在-20℃，以防DNA降解。）
8.2.3点样
取出反应管做好号码标记，AB两组反应管中，每个反应管分别加入样本模板2ul，密封后瞬时离心数秒。把离心好的反应管放入传递窗内。做好记录及清洁和消毒工作；换下工作服、工作鞋，口罩，帽子，并处理生物垃圾。
8.3PCR扩增
8.3.1进入缓冲区,换上该区的粉红色工作服和工作鞋,带上口罩、帽子和手套。
8.3.2取出PCR反应管，依次放入PCR仪中，选择已经设定好的程序开始扩增。
8.3.3做好记录及清洁和消毒工作；换下工作服、工作鞋，口罩，帽子，并处理生物垃圾。
8.4 杂交
8.4.1进入缓冲区,换上该区的紫色工作服和工作鞋,带上口罩、帽子和手套。8.4.2试验前准备
8.4.2.1打开水浴锅，将温度调至45℃。
8.4.2.2从冰箱中取出杂交试剂盒，将所有杂交检测试剂放置在室温下,使其温度平衡到室温。
8.4.2.3 将杂交液、WB1试剂瓶放入45 C水浴锅中预热。
8.4.3 HB2012-A型医用核酸分子快速杂交仪准备
8.4.3.1 打开HB2012-A型医用核酸分子杂交仪电源。
8.4.3.2 在杂交仪后面的废液出口处安装好废液缸，在废液缸内加入20ml 10%
次氯酸钠；（注：若实验中途需要倾倒废液缸中废液，则在倒完之后重
新加入10%次氯酸钠，继续实验）。
8.4.3.3 用蒸馏水充满反应室，放置好金属多孔板并打开水泵，排出多孔板上面
的水后，关闭水泵。
8.4.3.4 将与实验样品数相对应孔数的塑料薄膜放置在金属多孔板上。
8.4.3.5 用镊子将杂交膜放置在塑料薄膜对应开孔上，如有多余开孔则用
parafilm封口膜或废弃杂交膜覆盖，这一步要确保杂交膜湿润且没有气
泡；杂交膜放置的时候要注意用来定位的两个加号向上放置。
8.4.3.6 在杂交膜上面放置硅胶封圈和15孔分隔室，拉回滑盖，按[7]键升降平
台升起直至压紧反应室完成密封。密封反应室前应把滑盖拉到反应室的
正上方，才可升起升降平台。
8.4.3.7 根据控制面板指示，选定[中文], 按[确认]键进入温度设定界面，输入
温度为45℃后，再按[确认]键确认并进行升温。
8.4.3.8 开泵，泵走残留在膜上的水珠，关泵。
注意：开泵意味着将杂交膜上的所有液体全部排除完全,然后才关泵。8.4.4 导流杂交操作
8.4.4.1 从水浴锅中取出预热到45℃的杂交液，在有杂交膜的杂交孔内加入1ml
预热至45℃的杂交液，盖上盖板温育至少2分钟。将杂交液放回水浴锅中继续水浴。
8.4.4.2 从冰箱中取出所要杂交的PCR产物（A组和B组PCR产物），溶解后放
入离心机点动离心, 放PCR仪中进行95℃变性5-10 min。
8.4.4.3 从冰箱中取出冻有冰块的塑料盒，加适量自来水，制成冰水后，将变性
好的PCR管从PCR仪中取出（在取出的过程中，应保持仪器持续运行
95℃），立即放入冰水中，放置时间应不少于2min。
8.4.4.4 开泵，排出预杂交的杂交液，关泵。
8.4.4.5 水浴锅中取出预热到45℃的杂交液，吸取0.8ml预热的杂交液，加到
反应槽每个孔中。
8.4.4.6 按照样本编号，将冰水浴中同一编号的两管PCR产物（A组和B组PCR
产物）取出，全部吸取加入到同一个反应槽孔中，用枪头轻力混匀（此
步骤的移液枪头均要求每加不同编号的样本需换一次枪头，并且不要用
力吹打，以免移液枪受污染）。依次按照样品编号执行以上步骤，直到
所有实验样本的PCR产物均加入到杂交孔中,然后盖上盖板，45℃条件
下杂交20min。将杂交液重新放入水浴锅中。
8.4.4.7 杂交20min后，开泵进行导流杂交，将杂交膜上的溶液排净，关泵。8.4.4.8 从水浴锅中取出预热到45℃的WB1溶液，吸取0.8ml冲洗膜，加完后
停留5-10S左右，开泵将杂交膜上的溶液排净，关泵；此步骤重复4次。
8.4.5 显色过程：
8.4.5.1 按[取消]键进入温度修改界面，设定杂交仪温度为25℃后按[确认]。
8.4.5.2 加入0.5ml封阻液封闭膜，当温度降至30℃时，开泵排净所有预封阻的封阻液，关泵。
8.4.5.3 再加入0.5ml封阻液封闭膜，盖上盖板封闭5 min(此步不必降到25℃
就可进行)；开泵，完全排净0.5ml封阻液，关泵。
8.4.5.4 在温度为25℃时, 加入0.5ml酶标液，盖上盖板温育5分钟；开泵，
将0.5ml酶标液彻底排净，关泵。
8.4.5.5 按[取消]键进入温度修改界面，设定杂交仪温度为36℃后按[确认]键
确认。
8.4.5.6 吸取0.8ml溶液A冲洗膜，开泵将杂交膜上的溶液彻底排净，关泵；重复清洗四次。
8.4.5.7 将NBT/BCIP溶液棕色小瓶（显色液）取出，摇匀，加入0.5ml NBT/BCIP
溶液，盖上盖板显色，显色反应5min。
8.4.5.8 开泵，泵出所有NBT/BCIP溶液。
8.4.5.9 吸取0.8ml杂交液冲洗膜，开泵将杂交膜上的溶液排净，关泵；重复清洗三次。
8.4.5.10 吸取2ml左右蒸馏水冲洗膜，开泵将杂交膜上的溶液排净，关泵。8.4.5.11 按[取消]键两次，退出到开机界面。按[7]键升降平台下降，便可取出反
应室内的配件。拿走分隔室，用镊子取出杂交膜并放在吸水纸上吸干杂
交膜上的水分；根据记录本记录样本所放顺序，将样本编号写在杂交
膜左下方。
8.4.6 试验后处理
8.4.6.1 用蒸馏水充满反应室，开泵泵出所有蒸馏水，再加入蒸馏水充满反应室，
用软毛刷清理反应室，开泵泵出所有蒸馏水。
8.4.6.2 将多孔板、塑料薄膜、分隔硅胶圈及分隔室用自来水清洗一遍，并用蒸
馏水冲洗一遍。
8.4.6.3 清理盛废枪头的废品缸，将所有废品取出到远离杂交工作台的地方，倒
入塑料袋中，封口后丢弃。
8.4.6.4 将所用剩余的杂交试剂放回4℃冰箱中保存。
8.4.6.5 关闭杂交仪电源，用纸巾擦净反应室内残留水珠。
8.4.6.6 将清洗干净的杂交用多孔板、塑料薄膜、分隔硅胶圈及分隔室，用纸巾
擦净，摆放在反应室上，开着盖板，使其自然风干。
8.4.6.7 用软布沾清水或稀释的中性清洗剂拧干后擦拭，勿用酒精或其他有机溶
剂清洁仪器表面，特别是显示屏部分。
8.4.6.8 需对仪器和附件消毒时，用紫外照射30分钟即可，勿长时间照射，以
免加速附件老化（硅胶圈及实验后的杂交膜应避免紫外照射）。
8.4.6.9 结果记录
8.4.6.9.1 对实验中一些突发性问题（不包括在杂交标准操作规程）及实验结果记录。
8.4.6.9.2 撰写具体实验结果报告。
8.4.6.10 记录使用情况。
9.质量控制
9.1室内质控
9.1.1质控品的来源：
耳聋项目室内阳性质控品：由实验室自行收集阳性样本制作为阳性质控品，监控实验结果质量。
9.1.2 室内质控品的有效期
自制的质控品的有效期为半年，每半年更换一次，并填写室内质控品登记记录表。
9.1.3结果分析
9.1.3.1室内质控品：包括试剂空白（三蒸水）和自制阳性质控品。
9.1.3.2室内质控规则：严格按照操作程序对质控品按标本对待。
9.1.3.3质控品的检测：取1支空白和1支阳性对照随机放置样本中，与样本同步进行检测，观察实验的准确性。
9.1.3.4失控情况处理：如发现质控数据违背了质控规则，应在室内质控记录表上填写，由科室负责人做出是否发出与质控品相关的患者标本检验报告的决定。
9.1.3.5失控原因分析及操作处理.
试剂空白出现阳性结果；
9.1.3.5.1如所有样本以及试剂空白都同时出现同一型阳性结果则可能是试剂污染，应更换试剂重新进行阴性对照和试剂对照的测定，如无污染后再进行样本检测。
9.1.3.5.2如试剂空白出现阳性结果，样本不是全为阳性但阳性率比以前有所增加，则可能是气溶胶污染。应对实验室进行充分消毒和紫外线照射后进行阴性对照和试剂空白对照的检测，如无污染后再进行样本检测。
9.1.3.5.3如只有试剂空白出现阳性结果，标本不是全为阳性，而且阳性率和以
前一
样，则可能是交叉污染。应把加样枪进行高压消毒后重新对样本和对照进仔细的检测。
9.1.3.5.4若阳性质控的结果不符合要求,则结果不可发出。应重新取另阳性对照品重新进行检测，若结果正常则可能是操作误差引起的；若结果检测再次仍不正常则可能是试剂有误差。重新拆新试剂盒进行检测，若结果正常，则可行。若三次测定结果还是不正常，可能是仪器或者其他问题。立即跟厂家联系，请求支援解决问题。或者考虑剩余的质控品失效的情况。
9.1.3.6 每月月初，应对当月的所有质控数据进行汇总和统计处理，按每月室内质控总结的格式进行总结上报科室主任，室内质控总结报告至少保留5年。
9.2 室间质评
9.2.1每年在规定的时间内参加卫生部的室间质评计划，并在规定的时间内完成该项目质评物的检测，在室内质控符合要求的情况下读取室间质评物的检测结果，并填入时间质评回报表。
9.2.2在规定时间内将室间质评回报表寄回组织单位或在网上填报结果。
9.2.3质评成绩回来后，对质评结果分析，并于15个工作日内上交质评总结报告，同时对本实验室存在的质量问题进行整改。
9.2.4原始成绩、质评证书按顺序保存5年。
10.方法性能
10.1检验方法的局限性
10.1.1可检测中国人群常见的4种耳聋易感基因中9个突变类型（mtDNA1494、mtDNA1555、SLC26A-IVS7(-2)、SLC26A-2168、GJB2-35、GJB2-176、GJB2-235、GJB2-299、GJB3-538），并未涵盖耳聋基因相关的全部突变类型。因此当本试剂盒检测结果为野生型时，不能排除被检者带有耳聋相关的其它突变类型。
10.1.2 本试剂盒检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据，为达到诊断目的，此检测结果要与临床检查，病史和其它的检查结果结合使用。
10.2性能指标
10.2.1 准确性：以13份相对应突变位点的阳性参考品检测试剂盒，检测结果均为阳性。
10.2.2特异性：
以正常人基因组DNA样本，非人类基因组DNA样本（淋球菌DNA样本，解脲支原体DNA样本）以及试剂盒检测范围外耳聋基因DNA样本（1174A>G,GJB2 512insAACG突变，GJB3 547G>A突变）作为阴性参考品检测试剂盒，结果均为阴性。
10.2.3最低检出量：
以
GJB2-35,GJB2-176,GJB2-235,GJB2-299,GJB3-538,SLC2614-IVS7,SLC26-2168 (杂合子浓度为15-20ng/ul)及mtDNA1494、mtDNA1555（突变DNA含量为10%）作为最低检出量参考检测试剂盒，检测结果均为阳性。
11.2.4重复性：
以235M杂合，ISV7-2M杂合（浓度为20-40ng/ul）以及mtDNA1494、mtDNA1555（突变DNA含量为50%）作为重复性参考品分别对同一批试剂盒平行测10次，10次检测结果一致。
11.2.5批间测定结果的一致性：
以4份重复性参考品分别对3个批次试剂盒平行检测10次，3个批次同一参考品10检测结果均一致。
11.生物参考区间
本试剂盒只能对检测对象进行定性分析，以检测位点出现信号与否来进行判断，信号点的强弱不能提供定量方面的参考。膜条上各正常对照检测位点有信号，各突变检测位点无信号，说明未检测出试剂盒耳聋基因位点突变；突变检测位点有信号，说明有检测出试剂盒相应耳聋基因位点突变。
12.结果报告
注：上表中各突变点相对应的“N”是指各耳聋易感基因的正常对照；“M”是指各耳聋易感基因的突变位点；Biotin为杂交反应对照。
12.2结果判读：
12.2.1空白对照：仅在生物素点出现蓝紫色斑点。
12.2.2 正常样本：在生物素点及所有正常探针处出现蓝紫色斑点。
12.2.3 阳性样本：正常探针及对应的突变探针位点都出现蓝紫色斑点，为该位点的杂合突变或异质突变；突变探针位点出现蓝紫色斑点，而对应的正常探针位点没有出现蓝紫色斑点，为该位点的纯合突变或均质突变。
12.2.4 其它：若某个检测位点的正常探针和突变探针都未出现蓝紫色斑点，可能是该检测位点出现新的突变类型，建议做进一步的分析，如测序等。
13.注意事项
13.1实验前应仔细阅读说明书，并严格按说明书进行。
13.2 实验室应按临床基因扩增检验实验室管理规范进行管理，每个区域配有专用的仪器和设备。
13.3PCR试剂在使用前应解冻，8000rpm离心1分钟。
13.4显色液（NBT/BCIP）含有毒物质，可能对未出生婴儿造成损害，通过吸入和皮肤接触是有害的，会对眼睛产生刺激作用。请带手套在通风良好的地方使用。
13.5实验前应该对实验室进行紫外线消毒，并用75%乙醇清洗工作台和微量加样器。
13.6实验所用移液器的移液吸头不应重复使用，并戴一次性手套。
13.7操作人员应受过专业培训和具有操作经验。
13.8本试剂盒仅用于体外诊断。
14.临床意义
耳聋是临床上最常见的遗传性疾病之一，由遗传性因素导致的约占60% 左右。遗传性耳聋基因检测，就是通过分析被检者的DNA，确认与耳聋相关的基因是否存在缺陷，从而为耳聋的临床诊断提供依据。对致聋基因的寻找和检测具有重大临床价值，通过对基因突变的识别不仅可用于耳聋患者的病因诊断、遗传咨询、产前诊断和新生儿听力筛查，还可以帮助和提醒医生慎重使用特定种类的抗生素以避免造成携带基因突变的儿童致聋。在我国，每年由于抗生素的应用发生大量的药物性聋的病例，其中有很大比例与线粒体基因突变有关，迫切需要相关技术进行相关基因突变的新生儿筛查或用药前检测以预防耳聋的发生。
由于导致语前聋的环境因素的存在，有时无法判断患者是否为遗传性聋，同时耳蜗结构复杂，耳聋听力表现难以区分，常规的电生理检测或生化检测均不能从病因学上给出满意的解释。这一切，都决定了遗传性耳聋基因检测是目前最为有效的病因学分析方法之一。通过基因检测可以做到早发现，这对于语前聋患者尤为重要，可以尽早利用残余听力佩戴助听器或植入电子耳蜗，防止患儿变哑，对于语后聋患者，可以部分预测以后发病的风险和发病的年龄阶段，从而尽早预防，并对患者的婚配、生育提供遗传信息。基因检测比传统检查拥有更高的准确性、更远的前瞻性，它首次使人们面对耳聋从只能患病后被动治疗，而转为可以提前主动的预防和干预。
综上所述，耳聋基因检测作为耳科领域出现的新技术、新方法，它具有几个重要的特征：
(1)基因检测技术可以对一定比例的耳聋患者进行准确的分子病因分析，而以往非综合征性感音神经性耳聋诊断只能通过病史和排除法推测病因；
(2)基因检测技术可以早于症状以及常规测听技术或影像技术发现耳聋易感人群；
(3)基因检测可以作为部分病例常规测听或影像技术的辅助和补充检测技术，并实现远程检测；
(4)基因检测配合筛查技术和产前诊断可以减少聋病发生、避免聋儿出生。因此，耳聋基因检测技术应用于遗传性耳聋的诊断和预防性筛查，将对中国人聋病的诊
断、治疗和预防产生深远的影响。
15.参考文献
15.1 尚红，王毓三，申子瑜．全国临床检验操作规程[M].北京：人民卫生出版社，2015：892-901．
15.2耳聋易感基因检测试剂盒（PCR+导流杂交法）说明书
耳聋易感基因检测试剂盒实验标准操作程序 1.项目概述 耳聋是一种严重影响人类生活质量的常见先天性疾病，它可以由单一基因突变或不同基因的复合突变引起，也可由环境因素（如医疗因素，环境暴露，创伤，药物等）或基因和环境两者共同作用而致。在世界范围内，每1000名新生儿中就有1名先天性耳聋患儿，50% 患儿的耳聋与遗传因素有关。70%的遗传性耳聋不伴有其他症状，称为非综合征性耳聋 ( nonsyndromic hearing impairment, NSHI)。非综合征耳聋是最常见的感音神经性聋，可以分为常染色体显性（DFNA，15％~ 20%）、常染色体隐性（DFNB，80%）、性连锁（DFN X-linked，1%）和线粒体遗传性耳聋（1%）四类。迄今为止，共有114个耳聋位点见诸报道（54个为常染色体显性位点，60个为常染色体隐性位点）。40余个感音神经性耳聋基因和更多的综合征耳聋基因被克隆。据中国残疾人联合会网站统计，中国6000万残疾人口中2100万为听力残疾者。听力言语残疾者中7岁以下的聋儿达80万人并以每年新增3万聋儿的速度在增长。研究表明，大量的迟发性听力下降患者中，亦有许多患者也是由自身的基因缺陷致病，或由于基因缺陷和多态性造成对致聋环境因素易感性增加而致病。因此，需要开展耳聋基因检测，对于由明确检测到的基因缺陷致病的患者及早进行干预治疗与预防措施，提高患者的生活质量，降低患耳聋的风险度。 2.测定原理 本试剂盒采用了PCR体外扩增和DNA反向点杂交相结合的DNA芯片技术。 采用生物素标记的引物分别对耳聋易感基因突变区域进行特异性扩增，将扩增产物 与标记不同突变类型耳聋易感基因探针的尼龙膜在导流杂交仪上进行导流杂交，然后通过化学显色对结果进行判读。 3.样品采集和制备 3.1. 标本采集： ①成人男性和女性及患儿：采用无菌抗凝管(添加抗凝剂)，抽取静脉血2ml
目录 申报文件 一、临床基因扩增检验实验室技术验收申请表 二、《医疗机构执业许可证复印件》 三、拟设置基因扩增检验实验室医院的医疗卫生资源状况对临床基因扩增检验的需求情况以及实验室 运行的预测分析 四、拟设基因扩增检验实验室的设置平面图 五、实验室主要负责人简历表 六、实验室工作人员一览表 七、主要仪器设备表 八、拟开展的临床基因诊断项目 九、几点说明 质量手册 一、管理性程序： 程序文件的管理和维护 (1) PCR实验室管理制度 (2) 生物安全准则 (4) 实验室生物防护措施 (7) 实验室传染性废弃物管理制度 (9) PCR实验室的人员配置及管理制度 (12) PCR实验室的人员培训计划及措施 (14) PCR实验记录管理制度 (15) 惠安县医院PCR检验报告单保密制度 (17) 检验结果的传送管理制度 (19) 实验室的清洁制度 (20) 化学试剂的管理程序 (22) 实验室消耗品购买、验收和贮存程序 (23) 新项目审批程序 (25) 仪器设备的管理制度 (26) 仪器设备的使用制度 (28) 仪器设备的标准操作制度 (29) 仪器设备的维护保养程序和制度 (31) 仪器设备的校准制度 (34) 仪器设备发生故障的应急处理制度 (35) PCR检测的标本管理制度 (36) 二、检测项目操作程序： 标本、样本编号唯一性程序 (38) 临床标本的采集、运送和接收程序 (39) 临床标本的保存程序 (41) 临床标本的处理（核酸纯化）程序 (42) 核酸扩增及产物分析检测的标准操作程序 (43) I
消毒液的配制程序 (45) 室内质量控制操作程序 (46) 实验室室间质量评价的操作程序 (49) 试剂的质检操作程序 (50) 带滤塞吸头的质检操作程序 (52) 人员流动程序 (53) 抱怨处理程序 (54) 应急处理程序 (55) 生物污染废弃物处理标准操作程序 (57) 乙型肝炎病毒DNA-荧光定量PCR测定 (59) 沙眼衣原体DNA-荧光PCR测定 (61) 结核菌DNA-荧光定量PCR测定 (63) 三、仪器设备标准操作程序： GeneLight 9800实时跟踪荧光PCR仪操作程序 (66) Reactor4800加热仪标准操作程序 (67) FX 1200-Ⅱ- B2型生物安全柜操作程序 (68) SpanStar2418台式高速离心机标准操作程序 (70) 加样器的操作程序 (71) 医用低温冷冻冰箱标准操作程序 (73) 移动紫外灯操作程序 (74) 四、仪器设备维护保养程序 GeneLight 9800实时跟踪荧光PCR仪维护保养程序 (75) Reactor4800器加热仪维护保养程序 (76) FX 1200-Ⅱ- B2型生物安全柜维护保养程序 (77) SpanStar2418台式高速离心机的维护保养程序 (78) 医用低温冷冻冰箱保养程序 (79) XW-80A型旋涡混合器的保养程序 (80) 移动紫外灯维护保养程序 (81) 五、仪器设备校准程序： GeneLight 9800实时跟踪荧光PCR仪校准程序 (82) Reactor4800器加热仪校准程序 (83) FX 1200-Ⅱ- B2型生物安全柜校准操作程序 (84) 加样器的校准程序 (85) SpanStar2418台式高速离心机的校准程序 (87) 温湿度表的校准程序 (88) 六、附相关图表 附表001 送检标本接收记录表 附表002 送检标本拒收记录表 附表003 标本超低温保存及处置记录表 附表004 室内质量控制登记表 附表005 试剂验收记录表 附表006 试剂质检记录表 附表007 紫外灯强度监测表 附表008 消耗品验收记录表 附表009 消耗品质检记录表 II
B-raf基因突变检测试剂盒(荧光PCR-毛细管电泳法) 标准化操作流程 1、预期用途 该产品用于定性检测确诊的结直肠癌患者石蜡包埋病理组织切片DNA的B-rafV600E 基因突变。B-raf 基因是一种癌基因，编码一种丝/ 苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK 通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。B-raf 基因位于7p34，长约190kb，转录mRNA 长2.5kb，编码783 氨基酸的蛋白，相对分子质量为94000-95000 Da。 研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的B-raf 突变，B-raf 突变主要发生在Exon15 上的激活区的第1799 氨基酸上(T 突变为A)，导致编码的氨基酸由谷氨酸变成缬氨酸(V600E)，该突变能使B-raf 激酶活性提高，V600E 突变能模拟T598 和S601 两个位点磷酸化作用，使BRAF 蛋白激活。近来研究表明，对于野生型Kras、但存在B-raf 基因V600E 突变患者，抗EGFR 单抗治疗无效。2010 年版《NCCN 结直肠癌临床实践指南》中已明确指出“如K-ras 基因无突变时，需检测B-raf 基因突变，如果后者存在V600E突变，则不应该给予抗EGFR 单抗治疗。” 2、仪器配置要求 移液器，振荡器，微型离心机，生物安全柜，高速冷冻离心机，定性PCR仪，荧光定量PCR仪（ABI7500，LightCycler? 480，MX3000P，CFX-96等），微量紫外分光光度计，基因分析仪（ABI3130，ABI3500DX）。 3、耗材要求 无菌带滤芯吸头、吸水纸，离心管（1.5ml，0.5ml，0.2ml）、PCR反应管（配套荧光定量PCR仪型号）及无粉一次性乳胶手套，基因分析板。 4、责任人 基因扩增实验室室长负责技术指导和质量监督。 5、执行人 操作人员应经过专业培训，具有合格的操作技能的检验专业技术人员。 6、检测原理 本产品选取人类基因组B-raf 基因Exon 15 上设计特异性引物和探针，对扩增后的PCR 产物片段进行测序分析。使用尿苷酶(UNG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止先前PCR 扩增产物的污染。 7、试剂来源 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 8、样本要求 8.1用量：每例标本切5张(10μm)白片，连续切片，不漂洗脱蜡，直接封存于1.5ml EP管中； 8.2质量：为确保DNA提取成功率，必须选择2年以内的石蜡标本； 8.3标本收集方法：石蜡包埋病理切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，为了保证切片组织中
室内质量控制程序 1 目的: 随时监测和控制本实验室检测的精密度的变化，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，指导当日结果能否发出，评价检验结果是否可靠，以及排除质量环节中所有阶段导致不满意的原因而制定本程序 2 范围: 临床基因扩增检验实验室 3内容： 3.1 开展室内质控前的准备工作 3.1.1 培训实验室工作人员（人员培训） 在开展质控前，为保证每个实验室工作人员都对质控的重要性、基础知识、一般方法有充分的了解，应在质控的实际过程中定期培训。 3.1.2 建立标准操作规程（操作文件的建立） 实施室内质控需要建立一套完整的标准操作规程文件（SOP），室内质控的实施包括仪器的使用、维护操作规程，试剂、质控品、校准品等的使用操作规程等。 3.1.3 仪器的检定与校准（仪器的校准和保养） 对所用移液器等量具要定期进行计量检定，PCR仪等定期校准和保养。 3.1.4 质控品 HPV21分型检测项目，实验应设置阴性、阳性质控物并参与提取过程，阳性质控物为HPV16、18型别，质控物由潮州凯普生物化学有限公司提供。耳聋易感基因检测项目，实验应设置阴性质控物，为正常无突变核酸，阴性质控物由潮州凯普生物化学有限公司提供，医院检测过程中收集的阳性样本保留作为阳性质控物。 定量检测项目，每次实验应设置阴性、弱阳性和强阳性质控物，质控物由各试剂盒生产厂家提供。 3.1.5 质控品的保存：分装后的项目质控品1个月内使用的于-20℃保存，1个月后使用 的于-70℃保存。 3.2室内质控实施细则 3.2.1检测必须有原始记录，记录上至少应注明检测日期、方法、试剂品牌、批号、阴阳性对照孔。原始记录应保持完整、清晰、有序，便于查阅。 3.2.2开展项目使用的试剂盒应具有生产批准文号、注册证和检定证书（符合国家或地方法律法规）。
ALDH2基因检测DNA提取标准操作规程 1目的 为保证本实验室检测ALDH2基因型时DNA提取实验操作的标准化,确保检测结果的准确性、重复性,制定本规程。 2范围 本规程适用于血液样本基因组DNA的提取。 3职责 3.1检验操作人员 负责血液样本的处理和血液中基因组DNA的提取。 3.2检验项目负责人 负责血液基因组DNA提取过程的监督实施,负责整个实验的质控。 4所需试剂和设备 台式高速离心机:离心速度能够达到12,000rpm(9,500×g 恒温金属浴或水浴箱(温度范围至少应包括56℃
涡旋振荡器 移液器:规格为1ml、200μl及100μl 紫外分光光度计:检测波长范围至少应涵盖260nm及280nm 血液基因组DNA提取试剂盒(这里以BaiO? DNA提取纯化试剂盒为例 5试剂的准备和储藏 样本DNA的提取应在一相对独立试验区域内进行,可与PCR反应的加样在一个区域内进行,实验进行时所需设备和试剂均应存于该区。PCR、芯片杂交显色、扫描,及相关仪器试剂的存放应在另一个相对独立区中进行。各区的移液器、枪头、离心管不可互换使用,防止交叉污染。进入杂交区的人员应避免再次进入DNA 提取及PCR加样区。 血液基因组DNA提取试剂在室温(15-25℃干燥条件下,可保存12个月;更长时间的保存可置于2-8℃。若缓冲液BL中有沉淀,可在56℃水浴中重新溶解,摇匀后使用。使用前请先在缓冲液BW1和缓冲液BW2中加入适量无水乙醇,加入体积请参照瓶上标签。提取的基因组DNA应保存在-20℃。 血液样本的要求:EDTA抗凝全血,室温保存不超过7天,2~8℃不超过1个月,-20℃不超过7周,反复冻融不超过5次。全血的运输必须遵守国家相关规定。
长沙健路医学检验所有限公司九项遗传性耳聋基因检测试剂性能验证报告
目录 一、验证目的 二、验证内容和方法 1.对象 2.内容与方法 3.设备 4.实验要求 5.操作程序 三、验证结果 1.阳性符合率 2.阴性符合率 3.空白验证 4.检测重复性 5.检测灵敏度 四、结果说明 五、验证结论
一、验证目的 本实验室计划使用北京博奥生物集团有限公司晶芯®九项遗传性耳聋基因检测试剂盒（微阵列芯片法）[国食药监械（准）字 2013 第 3401518 号]开展相关检测项目，根据《ISO15189：医学实验室-质量和能力的专用要求》，为保证实验室按照厂家所提供的试剂盒或检测系统说明书使用时，能复现生产厂家所宣称的检测性能，按照实验室质量管理计划，对生产厂家提供的试剂盒和检测系统进行了性能验证，报告如下。 二、验证内容与方法 1.对象 1.1晶芯®九项遗传性耳聋基因检测试剂盒（微阵列芯片法） 1.2基因组 DNA 提取试剂盒为北京康为世纪有限公司血液基因组非柱式提取试剂盒（CW0544） 1.3样本：人全血，适用抗凝剂为 EDTA 或枸橼酸钠等，不得以肝素抗凝。不分病种、检测目的、性别、年龄。 1.4质控品：该试剂盒中均包含正常野生型质控品，同时实验室提供4个已知突变的阳性质控品，以保证结果的准确可靠。 2.内容与方法 根据产品说明书标示的性能指标，验证以下内容： 1.1阳性符合率：已经测序确定为特定突变的核酸4（4例，每种类型突变一例）例，由本实验室使用待评价试剂盒进行测试，结果应与已知结果一致，阳性符合率应达到100%。 1.2阴性符合率：已经测序确定为野生型的核酸2（2例，正常人）例，由本实验室使用待评价试剂盒进行测试，结果应与已知结果一致，阳性符合率应达到100%。
线粒体耳聋基因(mtDNA) 突变检测标准操作程序 1 检验目的 保证受检者线粒体(mtDNA)耳聋基因突变检测的准确、可靠。 2 检验原理 采用 PCR 扩增和基因测序方法检测 mtDNA A1555G、C1494T 两个位点基因突变情况。 3 性能参数 3.1 敏感性：PCR 测序所需模板的量较少，一般 PCR 产物需 30~90ng，单链 DNA 需 50~100ng，双链 DNA 需 200~500ng； 3.2 特异性：采用 BigDye 荧光标记终止底物循环测序试剂盒，一般可测 DNA 长度为 650bp 左右； 3.3 精确度：DNA 测序精确度为(98.5±0.5) %； 3.4 简便安全：采用 ABI3130 自动化测序仪，能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等。 3.5 快速：每组基因测序可在 40min 完成。 4 原始样品系统 外周血。 5 容器和添加剂类型 EDTA 抗凝管(血常规管)。 6 所需设备和试剂 6.1 仪器设备 ABI9700 PCR 仪，ABI3130 测序仪，凝胶成像系统。 6.2 试剂盒 6.2.1 提取外周血DNA：采用上海赛百盛试剂盒快速提取外周血 DNA； 6.2.2 Axygen 公司提供的胶回收试剂盒； 6.2.3 ABI 公司提供的 BigDye 测序反应试剂盒：主要试剂是BigDye Mix，内含 PE 专利四色荧光标记的 ddNTP 和普通 dNTP ，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等； 6.2.4 测序反应产物纯化：醋酸钠/乙醇法纯化 PCR 产物。 7 校准程序 厂家工程师完成。 8 程序步骤 8.1 全血 DNA 提取试剂盒提取 DNA 8.1.1 GN 结合液预热澄清后使用；
1.实验室设置规章 1.1.基因检测实验室分为试剂准备区、标本处理区、基因扩增区、基因检测区. 1.2.进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序,顺序为：试剂准备区→标本处 理区→基因扩增区→基因检测区. 1.3.各区(de)实验物品（含移液器、试管架、吸头、记录纸、笔等）,不得混用,须 贴上不同颜色标签予以区别.试剂准备区为白色标识,标本制备区为红色标识,扩增区为黄色标识. 1.4.各区(de)特殊要求： 1.4.1.试剂准备区： 1.4.1.1.物品可以拿到其它区,其它区(de)物品严禁拿到试剂准备区.试剂准备区可 以放置成品试剂盒,能进行无潜在污染源(de)试剂操作过程.未处理(de)标本、处理(de)标本,阴阳对照品、定量参考品等有潜在污染源(de)物品不能在本区打开. 1.4. 2.样品处理区： 1.4. 2.1.处理企业质控参考品、阴阳对照品、定量参考品等潜在污染源物品时使用 生物安全柜,生物安全柜操作遵照生物安全柜操作规程执行. 1.4. 2.2.进行模板加样时在加样工作台进行. 1.4. 2. 3.进行企业参考品制备和样本(de)处理时,废弃物要进行原位灭菌并填写灭菌 记录. 1.4.3.基因扩增区： 1.4.3.1.进行PCR(de)扩增反应.严格按照相关标准操作程序进行操作. 1.4.3. 2.PCR荧光定量检测在该区进行. 1.4.4.基因检测区： 1.4.4.1.所有扩增后(de)离心管只能在本区打开,打开后不能拿到其它区,使用后要 及时盖上管盖, 浸泡在消毒液中.严禁扩增管敞口放置. 1.5.基因检测实验室废弃物在该区进行灭菌处理. 2.人员行为规章 2.1.实验人员须保持仪表整洁,语言有礼貌、举止讲文明. 2.2.进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序,顺序为：试剂准备区→标本处 理区→基因扩增区→基因检测区. 2.3.进入每个工作区(de)缓冲间穿戴该区(de)工作衣、工作鞋、帽子、口罩.离开该 区在缓冲间脱掉工作衣、工作鞋、帽子、口罩. 2.4.实验室技术人员必须严格按照实验操作程序进行,包括实验室擦洗、台面消毒, 离心管、吸头(de)准备,仪器使用和废弃物处理等. 2.5.非本室工作人员未经允许不得进入实验室.进入本实验室(de)外来人员需进行 登记,并由本实验室人员陪同. 2.6.实验室内不得用餐. 3.清洁卫生规章
Q-PCR实验流程 一、①实验前准备，每天早上到实验室后,先把超净工作台的紫外灯打开 15-20分钟。②超净台前做实验,需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套,RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子,不可以用使用过的手套直接取用.取完EP管/枪头后,袋子及时封好.④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话. 二、总RNA抽提 1)细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后,用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP 管中使细胞充分裂解，室温静置5min； 组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol (Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称） 2）加入200μl氯仿,剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min;（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致） 3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相,移至另一个新的RNase free EP管；（用20—200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清,枪头不可碰到、吸到中间层） 4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)（不应用振荡器混匀），室温静置10min； 5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在—80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g 离心10min，收集RNA沉淀），去上清； 6）用75%乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀)，超净台风干;沉淀不能过干或过湿,过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
β-地中海贫血基因检测试剂盒（荧光PCR法）说明书 【产品名称】 通用名称:β-地中海贫血基因检测试剂盒（荧光PCR法） 【包装规格】24人份/盒 【预期用途】 本试剂盒用于定性检测β-地中海贫血基因突变情况，以EDTA抗凝全血为检测样本，适用于临床β-地中海贫血基因突变的诊断。 β-地中海贫血是一组遗传性疾病，其临床表现多样，由轻到重，甚至危及生命，导致患者在未成年即夭折甚至胎死腹中，给家庭和社会带来巨大的负担。且目前尚无根治手段，国内外都没有疗效标准。因此控制和降低β-地中海贫血患儿的出生率才能有效地监控该病的发生，通过人群筛查和遗传咨询，对有携带β地贫基因的孕龄夫妇所孕胎儿实施产前诊断，是目前最有效的控制重症β-地中海贫血患儿出生的方法。 【检验原理】 本试剂盒能够检测24种β-地中海贫血基因类型（具体信息见附表1），采用八联PCR管进行检测，12管一人份，共12支扩增液（扩增液检测突变类型及对应的荧光通道信息详见附表2），每个反应管检测两种突变型和两种野生型，分别通过四个不同的荧光通道读取信息。根据文献，我们参照人类β-地中海贫血基因情况以包括突变情况的一段基因序列作为靶序列，设计特异性突变检测引物探针、特异性野生型检测引物探针，采用基因扩增技术对核酸特异性基因进行检测。突变型情况由FAM、HEX指示，野生型情况由ROX、CY5指示，对β-地中海贫血基因进行特异性检测，为临床检验提供实验室辅助诊断的依据。本试剂盒使用核酸提取试剂提取基因组DNA。试剂盒添加了防污染成分UNG酶，UNG酶可将反应体系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下DNA链断裂,消除由于污染DNA产生的扩增，保证扩增结果的特异性，准确性。【主要组成成分】 试剂盒1： 编号扩增液类型规格数量引物探针类型 1 β地贫1 扩增液24人份/支1支41-42M引物探针，IVS-Ⅱ-5M引物探针 2 β地贫2扩增液24人份/支1支654M引物探针，43M引物探针 3 β地贫3扩增液24人份/支1支26M引物探针，30M引物探针 4 β地贫4扩增液24人份/支1支27-28M引物探针，IVS-1-1M(T)引物探针 5 β地贫5扩增液24人份/支1支31M引物探针，-28M引物探针 6 β地贫6扩增液24人份/支1支17M引物探针，-29M引物探针 7 β地贫7扩增液24人份/支1支IVS-1-1M(A)引物探针，71-72M（A）引物探针 8 β地贫8扩增液24人份/支1支14-15M引物探针，41M引物探针 9 β地贫9扩增液24人份/支1支IVS-1-5M引物探针，71-72M（T）引物探针 10 β地贫10扩增液24人份/支1支-31M引物探针，CAP40-43M引物探针 11 β地贫11扩增液24人份/支1支IntM引物探针，-32M引物探针 12 β地贫12扩增液24人份/支1支CAP-1M引物探针，-30M引物探针 组成成分生化组成规格数量 H-2应缓冲液4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钾、氯化镁、硫酸铵、 甲酰胺、脱氧核糖核苷三磷酸 1.5mL/支4支 A酶混合液Taq DNA聚合酶、尿嘧啶糖基化酶、酶储存液A 50μL /支3支稀释缓冲液三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、三羟甲基氨基甲烷 1.5mL/支6支 TE缓冲液三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、三羟甲基氨基甲烷、 乙二胺四乙酸二钠盐 1.5mL/支2支 石蜡油 1.5mL/支5支试剂盒2： 组成成分生化组成规格数量 β地贫阴性对照生理盐水500μL/支1支 β地贫阳性对照质粒500μL/支1支
为使基因扩增检验技术有效地应用于临床，更好地为疾病的预防、诊断和治 疗服务，保证检验质量，特制定本规范。 临床基因扩增检验实验室的规范化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理 暂行办法》(卫医发[2002]10 号文)附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》 .为避免污染，必须严格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置临 床基因扩增检验实验室. 临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪 器设备.各区域都必须有明确的标记,以避免设备物品如加样器或者试剂等从其 各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。进入各个工 作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区，避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或者有明显区别标志的工作服,以便于鉴别。 此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。 清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮 存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用 具以防止交叉污染。 下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备. 贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物 分析区。在打开含有反应混合液的离心管或者试管前,应将其快速离心数秒。试 剂原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂 溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于时常打开反应管吸液而造成 污染。含反应混合液的离心管或者试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用 于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定 所需的扩增反应数来决定。
HER-2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）标准化操作流程 1、预期用途 用于检测乳腺癌组织细胞中的HER-2基因扩增情况° 1.1临床适用人群：临床上确诊为乳腺癌的患者。 1.2不适用的情况：未患有乳腺癌的患者。 1.3临床应用定位：用于检测患者乳腺癌组织细胞中的HER-2基因扩增情况，为乳腺癌的临床治疗和预后评估提供参考 2、仪器配置要求 荧光显微镜的配置包括：10x目镜，10x. 40x物镜和100x油镜。 建议顾客使用探针前向滤片组供应商了解所使用的滤片组的详细情况，以便选择与标记荧光染料相适应的滤片组。 绿色荧光：激发波长为490nm,发散波长为516nm,与FITC类似 橘红色荧光：激发波长为551nm,发散波长为572nm,与rhodamine类似。 移液器，振荡器，微型离心机，分析天平，高压灭菌锅， 3、耗材要求 玻片，染缸，保子，无菌带滤芯吸头、离心管，无粉一次性乳胶手套。 4、责任人 基因扩增实验室室长负责技术指导和质量监督。 5、执行人 操作人员应经过专业培训，具有合格的操作技能的检验专业技术人员 6、检测原理 乳腺癌组织样本，经处理后可用于荧光原位杂交分析。 杂交操作流程包括：细胞核中核酸DNA与探针位点特异性荧光原位杂交探针在高温下变性成单链脱氧核糖核酸，在37C环境中，这些己变性成单链的样本及探针核酸根据碱基互补的原则进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸，洗涤非特异性杂交后，探针上标记的荧光信号既可在荧光显微镜下被检测。 本试剂盒包含一组探针：HER2（绿色）位点和CEN17 （红色）位点及FTSH操作配套试剂。 正常细胞信号方式：每个细胞显示两个绿色信号及两个红色信号。 异常细胞信号方式：细胞中若出现三个及以上绿色信号且红色信号不小于两个，则提示HER2基因扩增。 7、试剂来源 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 8、样本要求 福尔马林固定、石蜡包理的乳腺癌组织和细胞。 9、标准操作程序 9.1乙醇溶液（70%乙醇、90%乙醇） 将700ml、900ml无水乙醇用去离子水分别稀释至1L,使用期间2-8°C储存。试剂配制1个月后或用于20张玻片杂交后应丢弃，若试剂出现混浊或污染应丢弃。 9.2预处理液 称取Tris-HCL 12.11g加400ml水使其溶解另称取EDTA 18.61g加400ml水使其溶解, 将两溶解的溶液混合均匀，用HCL调节PH至7.0±0.2后，定容至1000ml,为无色澄明溶液，无味；使用期间2-8°C储存。有效期6个月，若试剂出现混浊或污染应丢弃。 9.3SSC洗液 20xSSC贮备液：称取氯化钠88g、柠檬酸钠44g,充分溶解，室温下HCL调节PH 值到7.0±0.2,用纯化水定容至500rnl,高压灭菌121C15分钟，室温下应为无色无味透明澄清液体，使
人民医院基因扩增实验室ABI7500实时荧光定量PCR仪操作、维护及校准操作规程 1 ABI7500实时荧光定量PCR仪概述 7500型荧光定量PCR仪是特异性靶基因检测与定量的一体化平台。7500型将PCR热循环，荧光检测和各种应用分析软件结合在一起，可实时定量观察PCR每一循环各反应管中PCR扩增产物的情况。PCR实验结束后即刻得到定量结果，无需凝胶电泳分析，无需纯化PCR产物，无需进行任何实验操作。7500型实时荧光定量PCR仪具有节省时间，灵敏度高，准确性好和避免产物污染等优点。 2 主要技术参数 样品孔数：96孔样品基座， 温度范围：4.0-99.9℃ 温度显示：经计算机计算的实际样品温度，精确到0.1℃加热冷却速度：平均温度变化速度1℃/秒 温度准确性：正负0.25℃，35－100℃范围 升降温重现性：任意温度达到时间误差小于5秒 3 操作说明 3.1 实验程序运行：
3.1.1 首先打开电脑，进入操作系统后，打开7500仪器电源； 3.1.2 双击桌面上的7500快捷方式，进入以下界面： 3.1.3 点击，进入以下操作界面，按照默认设置，直接点击“完成”（Finish）：
3.1.4 在96孔板中选择所放置样本对应的区域，如下图： 3.1.5 点击按钮，在弹出的对话框中选择FAM-TAMRA荧光-淬灭基团，点击“Add To Plate Document”： 3.1.6 点击按钮，如图所示，在弹出的对话框中勾选FAM荧光
，内参荧光选择，点击“Close”： 3.1.7 在选项下，逐个双击所选样本，设置样本类型和标准点定量值： 3.1.8 点击选项，按照试剂盒说明书设置相应的扩增程序：
临床基因扩增检验实验室工作规范 为使基因扩增检验技术有效地应用于临床，更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务，保证检验质量，特制定本规范。 一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理 临床基因扩增检验实验室的规范化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》 （卫医发[2002]10号文）附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。为避免污染，必须严格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置临床基因扩增检验实验室。 临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。各区 域都必须有明确的标记，以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简称扩增区）至产物分析区，避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。 清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区 至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。 （一）试剂贮存和准备区 下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。 贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。 在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。 含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增的试剂都应 冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。 主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查，评价结果 必须有书面报告。对于"热启动"技术（在第一个高温变性步骤后加入酶），聚合酶也可不包含在主反应混合液中。 在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一 次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。 严禁用嘴吸取液体，加样器和吸头等必须经高压处理。
乙醛脱氢酶多态性检测标准操作规程 一、检验目的 为保证本实验室检测乙醛脱氢酶基因型时DNA提取、PCR扩增及扩增产物杂交、显色、芯片扫描实验操作的标准化，确保检测结果的准确性、重复性，制定本规程。 二、适用范围 适用于血液样本基因组DNA的提取、PCR扩增、杂交显色及报告。 三、方法原理 采用基因芯片技术，测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG,与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列，据此可重组出靶核酸的序列. 乙醛脱氢酶2（ALDH2）在硝酸甘油的代谢过程中发挥着重要的作用，是硝酸甘油的有效代谢物一氧化氮形成的关键，除此之外，还与酒精在人体内的分解代谢有关。ALDH2（Glu504Lys）基因突变使乙醛脱氢酶活性也降低10倍以上，使酒精在体内从乙醇→乙醛→乙酸→水、二氧化碳的代谢过程受阻，大量乙醛滞留在体内，给身体造成伤害。除了损伤肝脏导致脂肪肝、肝硬化，甚至肝癌外，还与食道癌、口咽癌和胃癌、冠心病、心肌梗死等风险相关。通过对ALDH2基因的检测，将为硝酸甘油的用药、饮酒指导及相关高风险疾病的预测提供有效的参考依据。 四、性能指标 1. 最低检出限：20ng。 2. 准确度：以3种ALDH2（Glu504Lys）基因型的DNA样品分别检测试剂盒，结果符合相应型别；以10份企业标化的阴性质控品进行平行两次检测，结果一致且均为阴性；以浓度为8ng/ul的基因组DNA样品分别检测试剂盒，结果符合相应型别。 2. 精密度：以3种ALDH2（Glu504Lys）基因型的DNA样品分别对同一批试剂盒平行检测20次，每天4次，分为5天，检测结果一致。 五、标本收集 1. 标本类型：静脉血的全血标本作为检测标本(抗凝剂为EDTA，抗凝剂的质量应符合化 试药品要求——化学纯或分析纯，使用的比例以厂家推荐为准)。 2. 标本保存室温保存不超过7天，2～8℃不超过1个月，-20℃不超过7周，反复冻融不超过5次，全血的运输必须遵守国家相关规定。 3. 标本拒收与1、2所述不符的标本，检验人员应向临床或就诊者说明拒收标本的原因，并提出解决方案或建议，并做好相关记录。 试剂的分装：扩增液融溶后，将其分装到0.2ml离心管中，22μl/管。 -1
NGS实验室建设标准与要求 一、高通量测序（NGS）实验室简介 1.1NGS实验室又叫高通量测序检测实验室。NGS是下一代测序技术(N EXT G ENERATION S EQUENCING)即高通量测序技术的简称。高通量测序技术是对传 统S ANGER测序（称为一代测序技术）革命性的改变,可同时对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,也称为深度测序(D EEP SEQUENCING)。 1.2由于NGS技术对所检测的核酸模板进行大量扩增，容易出现实验室污染 导致检测结果准确性下降；另外NGS技术要求高、影响因素多，实验过程处理不当易导致检测结果准确性下降或检测失败。因此临床基因扩增检验实验室技术验收和规范化管理是NGS技术本身需要，也是在临床上顺利应用该技术前提。 二、NGS实验室临床应用的基本条件 2.1必须拥有符合临检中心相关规定的标准NGS实验室。 2.2检测设备必须符合标准NGS实验室设置要求：高通量测序仪及配套服务 器；高通量测序检测试剂盒；通用电脑；自动分析软件，实验室样本信息管理系统等。 2.3检测人员必须通过专门的技能培训，并获得省级以上卫生计生行政部门 颁发的临床基因扩增检验技术上岗证书。NGS实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序（SOP）、建立系列质量管理文件等，确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求，确保检测结果准确、确保实验室卫生安全，确保实验室长期稳定运行。 2.4NGS临床应用必须在无菌无尘环境下进行操作。 三、NGS实验室建设基本要求 1/ 13
PCR检测实验室操作规范 一、PCR 实验室的设置及管理 1．目的：建立实验室的合理设置和科学管理，防止实验污染，保证检测结果的可靠性。2．适用范围：本程序适用于分子诊断室的设置、工作流程和日常管理等。 3．负责人： 4．细则： 4．1流感实验室为急传所的专业实验室，从事临床标本的基因扩增检测及相关科研工作等。4．2 本实验室采用实时荧光定量（定性）PCR 技术作为病毒基因诊断的主要手段，实验室分为三个区：试剂准备区（第一区）、标本处理区（第二区）、扩增分析区（第三区）。每一工作区配备专用的设备、仪器、辅助设施、耗材、清洁用品、办公用品、专用工作服，并有明显的区分标识。标本的接收则在检验科标本接收处进行。 4．3 各工作区专用的仪器设备、办公用品、工作服、实验耗材和清洁用具等，不可混用。4．4 各工作区配置、功能和内务管理见各相关SOP 文件。 4．5 严格遵守从“试剂准备区→标本处理区→扩增分析区”的单一流向制度，不得逆向进入前一工作区。 4．6 非本实验室工作人员，未经许可不得入内；进修、实习或其他科室人员因科研活动需要，进入实验区域（试剂准备区、标本处理区、扩增分析区）需首先熟悉本程序的各项规定并严格遵守执行，在本实验室人员监督指导下进行。 4．7 实验完毕后做好清洁消毒工作。 二、PCR 实验室工作制度 1．目的：保持良好的工作环境，以确保检测结果的可靠性，防止交叉污染，防止差错、事故及纠纷的发生。 2．适用范围：所有本实验室人员。 3．负责人： 4．细则：
4．1 本实验室进行临床基因扩增检测及相关实验工作，不得进行其它实验操作。 4．2 各区的用品不得混用。 4．3 在各区的实验操作过程中，操作者必须戴手套和帽子，严格按照操作规程。 4．4 试剂准备区只能进行试剂的贮存及配制等相关操作（见相关SOP 文件）。 4．5 标本处理区只能进行临床标本的保存，核酸提取、保存及其加入至扩增反应管和测定RNA 时cDNA 的合成（见相关SOP 文件）。 4．6 扩增分析区只能进行DNA 或cDNA 的扩增、实时荧光PCR 扩增产物的分析（见相关SOP 文件）。 4．7 进行实验时严格执行本实验室的各项操作规程，及时做好各种操作记录，力求准确、可靠。实验完毕，做好清洁、整理及分析统计等工作。 4．8 室内仪器由专人负责，未经许可，不得随意使用或挪用；爱护使用仪器，定期进行保养与维修。 4．9 爱护科室财产，注意安全；离开实验室前应关好门窗，检查水、电等。 三、PCR 实验室内务管理制度 1．目的：保证实验室日常内务管理及清洁工作顺利进行。 2．适用范围：实验室相关人员及相关清洁工人。 3．负责人： 4．细则： 4．1 非本室工作人员未经允许不得进入实验室。 4．2 各区的用品不得混用。 4．3 实验人员要有强烈的时间观念，按时上下班，不迟到、早退。 4．4 进入实验室的工作人员必须遵守实验室的单一流向的规定，禁止逆向走动。 4．5 所有仪器（如PCR 扩增仪）须有专人负责，并有使用维护记录；实验人员必须熟悉仪器性能后方允许操作，并严格遵守操作规程。 4．6 所有试剂进购、配制、质检、使用均要有记录，未经允许不得随意带出本实验室。 4．7 每天了解仪器运转情况及试剂使用情况，确保仪器整洁安全，试剂合格使用。 4．8 各区的各种清洁消毒均应有记录，工作衣消毒时注意各区应分开进行处理。 4．9 注意保持实验室卫生整洁，严禁在室内抽烟、吃零食，非实验操作人员应尽量少入。4. 10下班前检查门、窗、水、电，节假日应指定人员负责检查实验室的仪器、设备。
XX市第二人民医院基因扩增实验室质量体系文件 WEY-JYK-PCR-CXWJ 程序文件 编制: 审核: 批准： 受控状态：在控 编号：WEY-JYK-PCR-CXWJ 实施日期：2020.07.28 颁布日期：2020.07.28 XX市第二人民医院检验科
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目录 基因扩增实验室设置与管理程序 (1) 实验室医疗废弃物物管理程序 (3) 实验室记录管理程序 (5) 实验室生物防护程序................................ .7仪器设备管理程序. (10) 仪器设备校准程序 (13) 实验室防污染程序 (15) 试剂耗材管理程序 (19) 标本的管理程序 (22) 实验室检测结果报告程序 (24) 实验室质量控制管理程序 (26) 实验室检测结果报告程序 (28) 抱怨处理程序 (30) 检验过程中发生故障时的应急处理程序 (31) 实验室清洁消毒程序 (33)
基因扩增实验室设置与管理程序 1.目的：规范PCR实验室管理制度。 2.适用范围：PCR实验室布局设置、仪器设备、日常操作。 3.具体内容： 3.1.基因扩增实验室分试剂准备、标本制备、基因扩增分析三 个区，各区实验物品应有明显的标示，严禁混用。 3.2.实验室审核人员须有卫生部临检中心或其授权机构颁发的 培训上岗证方能进行基因扩增检测工作。 3.3.实验室工作人员必须严格按照核酸扩增实验操作程序进 行。 3.4.实验开始前必须先做好实验室内和工作台的清洁消毒，以 及离心管、吸头等一次性用品的高压灭菌处理。 3.5.工作人员应遵循单项走动的原则：试剂准备区一标本制备T 区一扩增分析区。 3.6.严格遵守室内质控，每批标本进行检测时都必须附上阴、 阳性对照，必要时绘制质控图。实验结束后若对照品结果出现异常时应立即暂扣本次结果，及时寻找原因并加以纠正后，才能发出报告。 3.7.非本室工作人员未经允许不得进入基因扩增实验室，工作 人员在工作时也不能随意进出，以免造成不应有的污染。
程序文件的管理和维护制度 1. 目的：基因诊断程序文件是指导临床基因扩增检验活动的法规性文件，属内部受 控文件，不得擅自修改、涂改，不得遗失、外借翻印。为保持其现行有效和持续适应性，并确立因条件变化进行修改的程序。 2．编写依据： 2.1 ISO/IEC170250－1999《检测和校准实验室能力的通用要求》因卫生部《临床基 因扩增检验实验室技术验收表（check list）》是根据ISO/IEC17025而设计2.2 卫生部《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》及《临床基因扩增检验实验 室工作规范》 3．适应范围：临床检验标本 4．内容 5．编制及职责：程序文件由PCR实验室负责人主持编写、修订、审核并保持它的现行有效性。由科主任批准和颁布实施，并负责解释。 6．发放与持有者责任：程序文件由科主任批准发放，发放与回收要登记签字，由PCR实验室负责人保管，并组织全室工作人员认真学习，了解内容，熟悉其中各项规定，程序文件执行情况纳入实验室目标管理，与奖惩挂钩。持有者调任时，要收回该程序文件。 7．修订：科室任何工作人员均可提出对程序文件的修改建议，文件修改须经有关人员讨论，PCR实验室负责人根据条件变化提出是否修改的决定，如作小的修改则可在修改页上进行，修改文件经科主任审核批准后，并填写入程序文件修改页。 如果文件须作重大修改，PCR实验室负责人可进行改版。新版程序文件经科主任批准后生效，收回旧版，并予以销毁，登记签字后发出新版，保证工作现场只有唯一的，最新的使用版本。
实验室内务管理及清洁制度 1 目的：保证实验室日常内务管理及清洁工作顺利进行。 2 范围：实验室相关人员及医院清洁工人。 3 内务管理及清洁制度 3.1 内务管理制度 a.实验人员要有强烈的时间观念，按时上下班，不迟到、早退。 b.进入实验室的工作人员必须遵守实验室的单一流向的规定，禁止逆向走动。 c.非本室工作人员未经允许不得进入实验室。 d..实验室工作人员应严格遵守各项规章制度和操作规程。 f..实验结束后，做好实验室的清洁卫生和消毒工作。 g..确保实验室的安全。工作人员每天下班前应认真检查实验室的门窗、水电，节假日应指定人员负责检查实验室的仪器、设备，确保安全。 h.实验室为工作学习场所，非实验相关物品不得放置在实验室内，落实实验区和生活区分离的原则，严禁在室内抽烟，吃零食. i.在实验室内不得从事读报、看小说等非实验性工作。 j.实验室人员应自觉遵守以上规定，如有违反按科有关规定处罚。 3.2 内务清洁制度 实验室人员： a．实验室地面必须平整、干净，通道要利于通行，没有无用的物品阻碍。 b.．合理规划实验室内物品，做到摆放整齐、有序，无用的或使用效率低的物品放置到储存处，常用的物品要容易寻找到。 c.．抽屉、柜子、文件类物品要作好标记，以方便识别。 d.实验结束后用4%“84”消毒液对台面进行清洁，并经紫外灯进行消毒。 e.每天对使用过的移液器用75%的酒精进行擦拭，并经紫外灯进行消毒30分钟。 f.实验过程中如发生标本或试剂外溅，应立即用4%“84”消毒液滴上，卫生纸盖上半小时，然后用酒精擦洗，并经紫外灯消毒。 g.每天实验前通过缓冲区上的开关，开启各区的通风系统，各区实验结束后打开该区移动紫外灯消毒实验台面，紫外灯每天开启 30～60分钟。 h.每天下班前要关门、关窗、检查空调和仪器的电源是否关闭。 医院清洁人员： a.每天实验结束，待紫外灯消毒时间足够后，依次关闭各区紫外灯并记录。 b.依次用4%“84”消毒液清洁三个区的实验台面和地面。各区清洁消毒工具均专用，不可混用，注意按照单一方向流程的原则来进行清洁。 c.收集好各区废弃物，交医院集中处理。 d.每周一，四将工作服交院洗衣房洗涤消毒，不同实验区的工作服隔开洗涤。4．引用表格： 附表18: PCR实验室出入人员登记表