巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展
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第28卷第1期 农业科学研究2007年3月 Vol.28No.1 JournalofAgriculturalSciencesMar.2007
文章编号:167320747(2007)0120068204
巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展
魏凡华1,2,3,曹瑞兵3,吴 润1,陈溥言3
(1.宁夏大学农学院,宁夏银川 750021; 2.甘肃农业大学,甘肃兰州 730071;
3.南京农业大学农业部疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏南京 210095)
摘 要:巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统,对Pichiapasto2
ris基因结构、载体元件以及影响外源基因表达的因素等进行了较为全面的综述.
关键词:巴斯德毕赤酵母;基因表达系统;研究进展
中图分类号:TQ926.1 文献标志码:A
目前,大肠杆菌类原核表达系统虽然较为成熟,
但表达产物以包含体形式存在,无翻译后的糖基化
等修饰加工过程,并且可能还会有细菌毒素.昆虫细
胞表达存在不正确的糖基化,产物复杂,不易纯化,
而哺乳动物细胞表达成本高,产量低.甲基营养型巴
斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)已发展成为能够生
成多种外源蛋白的卓越表达系统.
1 巴斯德毕赤酵母菌株
一般用于外源基因表达的Pichiapastoris菌
株有Y211430,M2C10023,GS115,KM71,SMD1168
等.根据利用甲醇的能力,可将巴斯德毕赤酵母分为
3型[1]:①Mut+型为甲醇快利用型,此型毕赤酵母具
有完整的AOX1和AOX2基因,绝大多数毕赤酵母为
Mut+表型.②Muts型,此型毕赤酵母(如KM71)菌细
胞AOX2基因编码的醇氧化酶可依赖15%AOX活性,
为甲醇慢利用型.③Mut2型(如M2G10023),此型毕
赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,为甲醇不利用
型.研究发现,蛋白酶缺陷型毕赤酵母,如SMD1163,
SMD1165和SMD1168可有效降低外源目的蛋白的酶
解.一般说来,蛋白胞内表达时,优先考虑用Muts表
型,对于分泌表达,Mut+和Muts都可使用.甲醇慢利
用型有时比Mut+型菌株能够达到更高的表达量[2].
2 Pichiapastoris表达载体
载体是由许多元件构成的,包括启动子、终止子、选择标记、报告基因、复制起点和信号肽序列等,
典型的表达载体含有乙醇氧化酶基因5′AOX1启动
子和3′AOX1终止子,其中含有供外源基因插入的
多克隆位点,以组氨醇脱氢酶基因HIS4作为互补
筛选标志或ZeocinR作为筛选标志.
2.1 启动子
Pichiapastoris含有两个基因编码醇氧化酶:
AOX1和AOX2,二者序列有92%同源性,但是AOX1
表达水平高于AOX2.AOX1启动子的表达受甲醇
严格调控[3].以甲醇为碳源生长时,约5%的mRNA
由AOX1基因转录.PGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启
动子)是最近在毕赤酵母中克隆到的一个组成型启
动子,GAP启动子不需甲醇诱导,发酵工艺更为简
单.Vassilen利用GAP启动子表达乙肝表面抗原获
得高表达[4],Genzyme也利用GAP启动子表达人
几丁质酶,不仅获得高表达,而且还可以避免蛋白酶
水解[5].Phongdara在Hansenulapolymorpha克隆
到酸性磷酸酶(pHO1)基因启动子[6].这些启动子
丰富了甲醇酵母对启动子的选择.
2.2 选择标记
选择标记一般为对应于营养缺陷型受体的野生
型基因,常用HIS4,也可用来源于酿酒酵母的
ARG4基因和SUC2基因.kanr基因和Shbler基因
能够作为细菌和酵母菌的选择标记,因此较其他表
达载体更易于筛选.
2.3 信号肽序列可供毕赤酵母选择的信号肽有外源蛋白自身的
收稿日期:2006205220作者简介:魏凡华(19802),男,宁夏隆德人,硕士研究生,主要从事微生物学与免疫学研究.
© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net信号肽和酵母本身的信号肽.有些蛋白的自身信号肽不能被毕赤酵母有效利用,可试用甲醇酵母信号
肽.目前可供选择的酵母信号肽有α2交配因子的前
导肽序列、酸性磷酸酶信号肽和蔗糖酶信号肽等.其
中酿酒酵母α2交配因子前导肽序列的使用最为广
泛.酶切割位点周围氨基酸序列及外源蛋白的3级
结构可以影响信号肽的加工效率.Waterham等也
利用定向肽在巴斯德毕赤酵母中成功地将PGAP启动
下的β2半乳糖苷酶定向输送到过氧化物酶体[7].
2.4 表达载体的种类
Invitrogen公司开发出了若干系列的表达载体
可供选择.当前常用的巴斯德毕赤酵母表达载体可
分为2类.①胞内表达载体.如pHIL2D2,pAO815,
pPIC3K,PICZ,pHWO10,pGAPZ.②分泌表达载
体.如pHIL2S1,pPIC9K,pPICZα,pGAPZα[8].目前
主要采用酵母内源性的信号肽来引导外源基因表达
产物的分泌,常用A2因子信号肽.许多蛋白的正确
构像和翻译后加工(如糖基化等)都是在分泌途中
完成的.
3 基因整合
证明表达载体构建正确后,转入巴斯德毕赤酵
母中诱导表达.毕赤酵母转化方法最常用的是电转
化法和原生质体法,其中电转化法最为方便,转化效
率最高,最容易产生多拷贝整合.ZeocinR抑制细胞
壁的形成,因此PICZ系列不能使用原生质体法进
行转化.转化时,载体DNA必须切成线状才能与染
色体进行同源重组,将整个载体连同外源基因整入
宿主染色体.通常有以下几种整合方式:①双位点互
换.发生在染色体AOX1位点和表达质粒中的
PAOX1及转录终止区,产生的表达菌的表型为His+
Mut-[9].②AOX1单位点互换.发生在染色体和表
达质粒的AOX1区.产生的表型是His+Mut+.③
His单位点置换.发生在染色体His位点和表达质
粒的His位点,使得1个或多个表达单位插入在
His位点,产生的表型也是His+Mut+.巴斯德毕
赤酵母载体在宿主染色体上大多为单拷贝整合,由
于PAOX1的强启动性和整合后的稳定性,所以单
拷贝也能获得较高的产量.
4 重组蛋白翻译后修饰
Pichiapastoris能进行与高等真核细胞相似的
许多翻译后修饰,包括二硫键形成、信号序列加工、
折叠、O2连接和N2连接糖基化等.巴斯德毕赤酵母
对分泌的外源蛋白的糖基化已成为研究的热点.巴斯德毕赤酵母对外源目的蛋白的糖基化作用具有2
个主要特征:①极少出现过度糖基化.一般情况下
Pp能产生较酿酒酵母明显要短的高甘露糖型寡糖
链,且较均一,长度在8～14个之间,使产物更加稳
定.②糖链中不含具有潜在致敏作用的α21,32甘露
糖[10].然而,一些在天然分泌时不被糖基化的蛋白,
由巴斯德毕赤酵母表达时却可能发生糖基化.如人
体内合成的胰岛素样生长因子I为非糖基化蛋白,
而由巴斯德毕赤酵母表达时,却有15%发生了糖基
化作用[11].不合适的糖基化和寡聚体可能会在机体
内产生免疫反应或毒副作用,解决这一问题的可能
方法主要是尝试胞内表达,利用基因工程改造糖基
化位点[12],用糖苷酶进行处理,降低抗原性[13].
5 影响外源基因表达的因素
影响外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达的因素
主要包括:外源基因自身的特性、表达框的拷贝数、
染色体整合位点和方式、宿主菌的甲醇利用表型、基
因剂量、分泌信号、产物稳定性、翻译后修饰以及培
养条件等[14].
5.1 外源基因自身的特性
外源基因在P.p中表达时,其自身就是影响表
达水平的重要因素.许多高A+T质量分数的基因常
会由于提前终止而不能有效转录,不合适的mRNA
5′非翻译区的核苷酸序列和长度也可能会影响基因
的正常表达.Sreekrishna等通过调整人血清白蛋白的
mRNA5′非翻译区与醇氧化酶的5′非翻译区相同后,
HSA的表达量可以提高50倍以上[15].赵翔等研究证
明,Pichiapastoris有密码子偏爱倾向[16].所以一般需
要进行全基因合成,使编码序列符合毕赤酵母偏爱密
码子用法和具有更高的G+C质量分数.
5.2 表达框染色体整合位点
巴斯德毕赤酵母中的稳定高效表达主要通过整
合性载体实现.整合性载体的表达盒稳定,可以多位
点整合而获得多拷贝以及进行不同整合方式.AOX1
和组氨酸脱氢酶(HIS4)基因位点都已被成功用于表
达外源蛋白.Sreekrishna等认为,由于表达框中his4
染色体突变拷贝与完好的his4基因能够发生基因转
换,所以首选aox1位点作为整合位点.
5.3 宿主菌的甲醇利用表型
原则上,如果是胞内表达,应尽量用Mut-细
胞,这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而
蛋白纯化更易进行.现在无需甲醇诱导的组成性表
达载体pGAPZ和pGAPZα已经构建成功,它们常
能生产比诱导型载体pPICZ和pPICZα更高的外源96 第1期 魏凡华等:巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展
© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net蛋白.Doring等研究表明,在生产哺乳动物膜转运
蛋白时,pGAP比pAOX1更理想.
5.4 基因剂量
一般来说,高拷贝整合可以提高表达量,但许
多实例表明,含单拷贝表达框的宿主菌足以得到
最佳产量.Jeffrey等发现,重组CD40L的最高产
量是在有8个以上表达框的菌株中获得的[17].不过个
别情况下拷贝数增加对产量也会产生负效应,原因可
能在于过高表达会对分泌途径产生负反馈抑制.因
此,高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标
准,基因剂量与表达水平的关系取决于特定的外源蛋
白.Jeffrey等建立了一种双滤膜筛查方法,可以快速
地从大量重组菌株中筛选出高表达克隆.
5.5 分泌信号
不适合的信号肽可导致信号肽加工不完全,或
者蛋白分泌水平低,甚至不能分泌.尝试不同的信号
肽,对信号肽进行突变改造或人工全合成信号肽等
策略可用于实现信号肽正确加工和提高分泌水
平[18].韦宇拓等利用菊粉酶的信号肽序列来构建巴
斯德毕赤酵母分泌载体并表达了B2葡聚糖酶,结果
表明ISP信号肽序列分泌效率不低于利用A因子
信号肽的表达载体pPIC9K.Singh等通过定向缺
失诱变导致了含有天然N端的成熟干扰素的正确
释放,可以成为解决这一问题的一种好方法.
5.6 发酵系统培养
巴斯德毕赤酵母在发酵系统中外源基因的转录
水平是过量甲醇诱导时的3～5倍.可有效监控
pH、通气量和碳源浓度并及时排出代谢产物,控制
维持产物稳定性的因素,可达到最优化发酵条件,使
蛋白产量在标准以上水平.现在已建立了较成熟的
补料分批培养制度和连续灌注培养方法.
5.7 产物稳定性
酵母细胞膜上有一种KEXO2样蛋白水解酶,
能专一性水解α因子前体中羧基端的肽键.改变培
养基的pH值,推荐范围为2.8～6.5,加入适量的
酵母提取物和蛋白胨,都能够提高外源蛋白的稳定
性,而某些酶抑制剂在增加其稳定性的同时会使一
些原先并不明显的蛋白变得非常明显,影响其使用
效果.另外,使用蛋白酶缺陷株如SMD1163,
SMD1165或SMD1168亦可避免产物降解的发生.
