毕赤酵母从入门到提高

毕赤酵母表达知识归纳1a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。

在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。

天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。

b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中。

说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。

Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。

过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。

然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。

4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。

该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。

都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。

invitrogen手册上可以灭菌的。

1.基因的内在特性主要包括mRNA 5’端非翻译区(5’2 U TR)、基因的A +T 组成和密码子的使用频率3 个方面。

由于巴斯德毕赤酵母中乙醇氧化酶的表达量极高(占胞内可溶蛋白的30% 以上) 因此为了有高的蛋白表达量,维持外源基因mRNA 5’－U TR。

尽可能和AOXlmRNA 5’－U TR 相似是必需的, 最好是保持两者一致。

A + T 含量高的基因在巴斯德毕赤酵母中表达时偶尔会造成转录提前终止,这是因为A T 丰富区可能存在转录提前终止信号。

因此对A T 含量丰富的基因最好是重新设计序列, 使其A + T 含量在30%～55% 范围内。

巴斯德毕赤酵母也有特殊的密码子偏好趋向。

（赵翔,霍克克,李育阳. 毕赤酵母的密码子用法分析[J ] . 生物工程学报,2000 ,16(3) :308 - 311.）外源蛋白自身的理化特点也影响其表达和分泌。

外源蛋白的加工修饰都会影响蛋白的表达量。

2．选择强启动子启动子在转录水平上调控基因的表达最常用的启动子是AOXI 启动子。

PGAG(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子) 是最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,在它的控制下β- LabZ 基因表达率比甲醇诱导下的PAOX驱动的产量更高,由于该组成型启动子不需要甲醇诱导,发酵工艺应该更简单,同时其产量更高,所以成为代替PAOX1 最有潜力的启动子。

通过分离选择恢复利用甲醇能力的自发突变体, 从AOX1 基因缺陷菌株中分离M ut+ 的自发突变体，从中筛选提高表达量的突变体。

（戴秀玉, 王恂, 周坚1 毕赤氏酵母PAOX2 突变化序列分析〔J 〕1微生物学报, 1999, 39 (6) : 559～5611）3．增加外源基因整合拷贝数（1）Invitrogen 公司最新发展的质粒pPIC9K上带有G418 的抗性基因,可以通过转化子对G418抗性水平快速筛选高拷贝转化子（配合电激法转化的效果更好）。

（2）在体外载体上多次插入目的基因片段。

毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。

不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。

它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。

同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。

这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。

例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。

为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。

而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。

两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。

细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。

甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。

AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码的目的基因的表达。

AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株表达：AOX1基因的表达在转录水平受调控。

毕赤酵母表达蛋白步骤一、引言毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种常用的真菌表达系统，被广泛应用于蛋白质的表达和生物技术研究中。

其优势包括高表达水平、易于培养和操作、能够正确折叠复杂蛋白等。

本文将介绍毕赤酵母表达蛋白的步骤。

二、构建表达载体毕赤酵母表达系统的关键是表达载体的构建。

首先，需要选择适合的表达载体，常用的有pPIC6、pPICZα等。

然后，在载体上选择合适的启动子和信号序列，以确保蛋白质能够被正确表达和分泌。

同时，还需要在表达载体上加入选择标记，如His标签、FLAG标签等，以便后续的蛋白质纯化和检测。

三、转化毕赤酵母将构建好的表达载体转化入毕赤酵母中，使其成为表达宿主。

转化方法包括电击转化、化学转化等。

其中，电击转化是常用的方法，通过电击脉冲使毕赤酵母细胞膜发生破裂，使表达载体进入细胞内。

转化后，将细胞培养在选择性培养基上，筛选出带有表达载体的毕赤酵母克隆。

四、表达蛋白经过转化筛选后，得到含有目标蛋白表达载体的毕赤酵母克隆。

接下来，需要将克隆进行培养，在适当的条件下诱导蛋白的表达。

常用的诱导剂包括甲醇、巯基乙醇等，通过加入适量的诱导剂，可以使目标蛋白得到高效表达。

五、蛋白纯化在蛋白表达后，需要进行蛋白纯化，以获得纯度较高的目标蛋白。

常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。

在选择纯化方法时，需要根据目标蛋白的性质和需求进行合理选择。

同时，可以利用加入的选择标记，如His标签，通过亲和层析纯化进行快速高效的纯化。

六、蛋白鉴定和功能分析蛋白纯化后，需要进行蛋白的鉴定和功能分析。

常用的鉴定方法包括SDS-PAGE、Western blot等，可以确定蛋白的分子量和纯度。

功能分析则可以通过生物学实验来进行，如酶活测定、结合实验等，以验证目标蛋白的功能。

七、应用和展望毕赤酵母表达系统在生物技术和蛋白质研究领域有着广泛的应用。

通过该系统，可以高效表达各种蛋白，包括抗体、酶和重组蛋白等。

毕赤酵母转化方法
实验概要
本实验介绍了毕赤酵母电转化方法。

该方法无需产生去壁细胞，是产生毕赤酵母重组子的简便方法。

与去壁细胞效率相似。

实验步骤
1. 细胞准备：
1) 在含5mlYPD 的50ml 离心管中，培养毕赤酵母，30 度过夜。

2) 取0.1-0.5ml 过夜培养物，接种含500ml 新鲜培养基的2L 摇瓶，过夜生长至OD600＝1.3-1.5。

3) 在4 度，1500g离心5min收集细胞，用500ml预冷的灭菌水悬浮细胞。

4) 如上离心，用250 ml预冷的灭菌水悬浮细胞。

5) 如上离心，用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞。

6) 如上离心，用1 ml 预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml。

注意：可冻存80ul 等量的电感受态细胞，但转化效率会下降很多。

2. 转化：
1) 取80ul上述细胞与5-20ug线性化DNA(溶于5-10ulTE)混合，转入预冷的0.2cm 电转杯中。

2) 在冰上放置5min。

3) 根据所使用装置推荐的酿酒酵母参数进行电击。

4) 立即加入1ml 预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中。

5) 分成200-600ul等份，涂于MD 或RDB平板上。

6) 在30 度孵育平板至克隆产生，筛选Mut /Muts表型。

毕赤酵母表达经验总结甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。

虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。

不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。

其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。

甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。

+++=4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。

=+5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低+++++ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。

毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。

毕赤酵母表达系统前言：所用表达质粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。

抗性选择：最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。

毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115 及KM71 在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4 基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。

GS115 及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。

转化之前，GS115 及KM71 都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。

培养温度：毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。

在32 度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。

贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD 琼脂斜面1 挑取所需菌株单克隆在YPD 平板上划线生长；2 挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30 度2 天；3 细胞在4 度可放几周几月或几年，存于－80度1 挑取所需菌株单克隆在YPD 中过夜培养；2 收集细胞，在含15%甘油的YPD 中悬浮至终OD600 为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）；3 细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。

注意：在4 度或－80 度长期保存后，用之前建议在MM、MD 或MGY 平板上划线培养以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。

以质粒pPIC9K，酵母Pichia pastoris GS115为例说明做法。

载体pPIC9K酶切为点线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子，可能其中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。

如果只想得到Muts重组子，使用KM71 菌株。

单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts重组菌（例如：插入AOX1或his4 而不是取代AOX1）。

毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。

不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。

它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。

同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。

这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。

例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。

为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。

而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。

两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。

细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。

甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。

AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。

AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。

表达：AOX1基因的表达在转录水平受调控。

1.电转化相关事项①在电转完毕涂MD平板时，我是不加抗生素的，因为MD平板本身就有组氨酸营养缺陷的筛选标记，据说再加抗生素很容易压力过大，不长菌。

20度培养48-55h后，酵母长出来，挑单菌落，到YPD液体培养基（刚筛选时我一般只加0.5mg/ml的G418），菌长好后，提基因组，验证插入基因和拷贝数，拷贝数这时也可以通过添加不同浓度G418的平板来验证。

如果基因插入没问题，再培养诱导，测活。

②YPD可以直接灭菌，刚开始我葡萄糖单灭，后来发现酵母粉蛋白胨葡萄糖一起加也没问题。

③.温度方面，毕赤酵母最常用的是30度，只要不长时间超过32度就没有问题，诱导温度与表达的蛋白是否被降解有关，但通常30度。

④.生物素方面，只要用到酵母粉的培养基都可以不用。

⑤. MD是的氮源是无机氮，没有组氨酸，空的毕赤酵母不在它上面不会长，长的有99％都是重组菌⑥可以用G418 YPD平板筛选高考贝菌，一般情况下拷贝数高的表达量就高（但有些蛋白酶不一定表达量高就好），一般情况下MD平板上长出的菌可以直接用牙签挑到1.5mg/ml或2mg/ml G418的平板上，这个时候一般培养三天时间，长的大的菌落可能就没有几个了，这几个大的获得高表达的可能性是最大的。

⑦灭菌温度方面，只要有葡萄糖的都115度20分钟，没有的都可以121度20分钟。

⑧甲醇诱导方面，一天加一次终浓度1％的甲醇即可，前提条件是第一次一定要换掉培养基。

⑨蛋白降解方面，在发酵上一般通过调整pH,收获时间来解决，通过诱导温度是不理想的；从宿主上可以选用SMD1168，SMD1165,SMD1163,SMD1168用的最多，从分子上，可以突变掉目标蛋白的酶切位点。

可以通过不同的载体不同的线性化位点对已有的高表达酵母进行再转化，以获得更高表达的菌株；些方法也可以进行两种不同蛋白的共表达。

⑩电击之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度摇床低速培养1h，再涂板。

很好，需要好好研究一下原文地址：毕赤酵母表达知识01转载于丁香作者：思时尔非a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。

在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。

天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。

b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP 管中。

说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。

Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。

过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。

然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。

4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。

该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。

都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。

巴斯德毕赤酵母生物过程
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种广泛用于重组蛋白生产的生物表达系统。

巴斯德毕赤酵母的生物过程涉及以下几个关键步骤：
1. 基因插入：通过同源重组将目标基因插入到巴斯德毕赤酵母的基因组中，通常插入到甲醇氧化酶（AOX1）基因的位置，利用其强启动子来实现高效表达。

2. 蛋白质表达：在甲醇的存在下，巴斯德毕赤酵母会被诱导产生大量的重组蛋白。

甲醇氧化酶是巴斯德毕赤酵母代谢甲醇的关键酶，其在细胞中的含量会随着甲醇的加入而显著增加，从而带动目标蛋白的表达。

3. 蛋白质折叠和修饰：巴斯德毕赤酵母具有真核生物的翻译后修饰能力，包括糖基化、二硫键形成等，这对于许多蛋白质的功能至关重要。

4. 蛋白质分泌：巴斯德毕赤酵母能够将重组蛋白分泌到培养基中，这有助于简化后续的纯化过程。

由于其内源分泌蛋白的产生有限，重组蛋白的纯化相对容易。

5. 过程优化：为了实现目标蛋白质的最大产量，需要对培养条件进行优化，包括甲醇和山梨糖醇的浓度、菌株的形式（Mut表型）、温度和孵育时间等因素的调整。

巴斯德毕赤酵母作为一种高效的表达系统，不仅操作简便，而且能够提供适当的蛋白质折叠和翻译后修饰，使其成为生产重组蛋白的理想选择。

一种库德里阿兹威氏毕赤酵母菌在土壤中的应用及其方法

哎呀，这话题听起来有点专业，不过别担心，我尽量用大白话给你讲讲这个库德里阿兹威氏毕赤酵母菌是个啥玩意儿，还有它在土壤里怎么用。

首先，这个库德里阿兹威氏毕赤酵母菌，名字挺拗口的，不过它其实是一种微生物，属于酵母菌的一种。这种酵母菌在自然界里挺常见的，尤其是在土壤里。你可能会问，这玩意儿有啥用？嘿，这你就问到点子上了。

这库德里阿兹威氏毕赤酵母菌，它在土壤里的作用可不小。首先，它能分解土壤中的有机物质，帮助土壤保持肥力。就像你家里的厨余垃圾，扔进堆肥箱里，过一段时间就能变成肥料一样，这酵母菌就是土壤里的“堆肥工”。

然后，这酵母菌还能帮助植物吸收营养。就像你吃饭需要维生素和矿物质一样，植物也需要这些营养来生长。这酵母菌就能帮助植物更好地吸收这些营养，让植物长得更壮实。

那怎么用这酵母菌呢？其实也不难。首先，你得准备一些酵母菌的培养液。这个培养液就是酵母菌的“食物”，能让它们繁殖。然后，你把这培养液和水混合，稀释一下，就可以直接浇到土壤里了。 浇的时候，记得要均匀一些，让土壤的每一部分都能接触到酵母菌。这样，酵母菌就能在土壤里繁殖，开始它们的工作了。

不过，这酵母菌也不是万能的。你得定期检查土壤的情况，看看酵母菌的效果怎么样。如果土壤还是不够肥，或者植物长得不够好，你可能需要调整酵母菌的用量，或者试试其他的土壤改良方法。

总之，这库德里阿兹威氏毕赤酵母菌在土壤里还是挺有用的。它就像土壤里的小精灵，默默地帮助植物生长。虽然听起来有点神奇，但其实它们就在我们身边，每天都在默默地工作。下次你看到土壤，不妨想想，这里面可能就有很多这样的小精灵在忙碌呢。

优化易错PCR条件以提高毕赤酵母GAP启动子文库突变效率秦秀林;钱江潮;储炬【摘要】高效的随机突变策略对于构建含有丰富突变体的启动子文库至关重要。

为了建立一个突变率适中并能获得较多有益突变子的易错PCR（error-prone PCR，EP-PCR）条件，实现毕赤酵母GAP启动子的高效突变，对EP-PCR反应条件进行了优化。

考察了模板浓度、反应循环数和Mg2+浓度对EP-PCR的产物得率和突变率的影响后，确定了适于GAP启动子突变的EP-PCR条件：模板浓度、反应循环数和Mg2+浓度分别为1 ng/μL、25和10 mmol/L。

优化EP-PCR条件后，GAP启动子突变率为1.1%，连续进行3轮EP-PCR后突变率可达到4.0%。

利用优化后EP-PCR对GAP启动子进行随机突变，筛选了250个突变子，获得5个启动子强度高于野生型GAP启动子的突变体，有益突变达到了2%，可用于构建GAP启动子文库。

%The first important step toward a successful preparation of large and diverse promoter library with desired complexity, is to select a suitable mutagenesis strategy. To generate a promoter library of GAP promoter(pGAP)variants, mutations were introduced using error-prone PCR. After optimization of the conditions for EP-PCR random mutagenes, high mutation(error rate 1.1%)frequence was obtained using 1 ng/μL template and 10 mmol/L Mg2+, in combination with 25 thermal cycles. To increase mutational diversity and reach an appropriate error rate, three consecutive rounds of EP-PCR were carried out under the same conditions. After random sequencing of 10 clones from each round, an overall range of mutation rates from 1.1%to 4.0%was observed. Then, 250clones containing pGAP variants were screened using the highthroughput screening approach in 48-deep-well plates. Among them, 5 mutants exhibited higher fluorescent intensity compared to the wild-type promoter.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】7页(P211-217)【关键词】易错PCR;突变效率;随机突变;毕赤酵母;GAP启动子【作者】秦秀林;钱江潮;储炬【作者单位】广西大学生命科学与技术学院，南宁 530004;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237【正文语种】中文利用易错PCR（Error prone PCR，EP-PCR）或DNA改组（DNA shuffling）等基因突变技术对基因启动子区进行改造构建启动子文库，并已在原核和真核微生物的代谢工程、功能基因组学和合成生物学中得到了成功应用［1-3］。

-毕赤酵母高效表达策略概述1.基因的内在特性主要包括mRNA 5’端非翻译区(5’2 U TR)、基因的A +T 组成和密码子的使用频率3 个方面。

由于巴斯德毕赤酵母中乙醇氧化酶的表达量极高(占胞内可溶蛋白的30% 以上) 因此为了有高的蛋白表达量,维持外源基因mRNA 5’-U TR。

尽可能和AOXlmRNA 5’-U TR 相似是必需的, 最好是保持两者一致。

A + T 含量高的基因在巴斯德毕赤酵母中表达时偶尔会造成转录提前终止,这是因为A T 丰富区可能存在转录提前终止信号。

因此对A T 含量丰富的基因最好是重新设计序列, 使其A + T 含量在30%~55% 范围内。

巴斯德毕赤酵母也有特殊的密码子偏好趋向。

(赵翔,霍克克,李育阳. 毕赤酵母的密码子用法分析[J ] . 生物工程学报,2000 ,16(3) :308 - 311.)外源蛋白自身的理化特点也影响其表达和分泌。

外源蛋白的加工修饰都会影响蛋白的表达量。

2.选择强启动子启动子在转录水平上调控基因的表达最常用的启动子是AOXI 启动子。

PGAG(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子) 是最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,在它的控制下β- LabZ 基因表达率比甲醇诱导下的PAOX驱动的产量更高,由于该组成型启动子不需要甲醇诱导,发酵工艺应该更简单,同时其产量更高,所以成为代替PAOX1 最有潜力的启动子。

通过分离选择恢复利用甲醇能力的自发突变体, 从AOX1 基因缺陷菌株中分离M ut+ 的自发突变体,从中筛选提高表达量的突变体。

(戴秀玉, 王恂, 周坚1毕赤氏酵母PAOX2 突变化序列分析〔J 〕1微生物学报, 1999, 39 (6) :559~5611)3.增加外源基因整合拷贝数(1)Invitrogen 公司最新发展的质粒pPIC9K上带有G418 的抗性基因,可以通过转化子对G418抗性水平快速筛选高拷贝转化子(配合电激法转化的效果更好)。

一、概述毕赤酵母是一种常见的真菌，它在生物技术和分子生物学领域有着广泛的应用。

在这些领域，研究人员经常需要对蛋白质进行糖基化修饰的研究，而毕赤酵母表达系统正是其中的一种重要工具。

本文将就毕赤酵母表达蛋白糖基化位点的方法进行介绍。

二、毕赤酵母表达系统简介1. 毕赤酵母表达系统的原理毕赤酵母表达系统是指利用毕赤酵母表达载体，将目标蛋白基因导入毕赤酵母中，使其在毕赤酵母中进行表达。

该系统具有高度的复制和表达效率，能够在较短的时间内高效地产生目标蛋白。

2. 毕赤酵母表达系统的优势和应用毕赤酵母表达系统具有许多优势，例如能够进行大规模的表达，提高了蛋白质的产量；同时也能够实现正常的翻译后修饰以及蛋白折叠功能。

在生物技术和分子生物学领域有着广泛的应用，如药物开发、生物能源等领域。

三、毕赤酵母表达蛋白糖基化位点的方法1. 利用质粒表达毕赤酵母表达载体中含有丰富的糖基化因子，对于糖基化位点的研究提供了便利。

研究人员可以将目标蛋白基因克隆至毕赤酵母表达载体中，通过大规模的表达筛选，筛选出糖基化位点进行研究。

2. 利用质粒诱导表达研究人员还可以通过对毕赤酵母进行质粒诱导，使其表达特定的糖基化酶，从而实现对特定蛋白质的糖基化位点的研究。

这种方法能够有效地降低研究成本，是当前常用的研究手段之一。

3. 基因敲除或过表达最近，基因敲除或过表达技术在毕赤酵母的研究中得到了广泛的应用。

研究人员可以通过敲除特定的糖基化酶基因或过表达其基因，从而实现对糖基化位点的研究。

这种方法能够帮助研究人员更深入地了解糖基化位点在蛋白质功能中的作用。

四、毕赤酵母表达蛋白糖基化位点研究的意义1. 为蛋白质功能研究提供重要依据研究糖基化位点能够帮助人们更深入地了解蛋白质的结构和功能。

糖基化位点通常与蛋白质的功能密切相关，通过研究糖基化位点，可以为蛋白质功能的研究提供重要的依据。

2. 为药物研发提供理论支持糖基化位点在药物研发中也有着重要的意义。

许多药物的研发过程中需要考虑蛋白质的糖基化修饰，因此对糖基化位点进行研究能够为药物研发提供理论支持。

毕赤酵母生长ph范围毕赤酵母，这个名字听起来就像某种神秘的生物，实际上它是个小家伙，在酿酒和发酵方面可是个高手。

它对pH值的要求真是个“挑剔”的家伙，毕竟谁不想在最舒服的环境中茁壮成长呢？一般来说，毕赤酵母喜欢的pH范围大概在4到6之间。

哎，别小看这小小的数字，它可是决定这位小生物能否快乐成长的关键。

想象一下，毕赤酵母就像个爱挑食的孩子，四五岁的时候总爱吃糖果，而这个pH范围就像是它的糖果世界，过低或者过高，立马就不乐意了，甚至会生病。

这种“挑剔”的性格在微生物界并不少见，它们都有自己的小脾气。

可你别看它们小，但在发酵过程中，毕赤酵母可是能干得很，发酵的速度快得让你眼花缭乱。

就像一位赛车手，在合适的条件下，它们飞驰而过，转眼间一桶美酒就酿好了，真是神奇。

咱们再聊聊这个pH的影响吧，pH值太低，毕赤酵母会觉得环境酸得受不了，简直就像是被送到了一座酸酸的监狱。

而pH值太高呢，它们又会觉得“哎呀，我这是在哪儿啊，跟喝水似的，根本没劲！”所以，找对这个pH范围，才是保证它们生长的“秘诀”。

如果想要它们工作得更加高效，那就得在这个合适的范围内调控环境。

就像给孩子提供一个舒适的玩耍空间，让他们能尽情释放能量。

毕赤酵母也很擅长适应环境，稍微调节一下，它们也能在不同的pH条件下找到自己的生存之道。

可这可不是说它们在极端环境下就能轻松应对，没那么简单！如果条件过于苛刻，可能会导致酵母的死亡，哎，真是悲剧呀。

所以，细致入微的调控就显得格外重要。

这就好比说，给孩子买衣服，不能太紧也不能太松，刚刚好才是最好的选择。

咱们说了那么多，怎么能少了毕赤酵母的应用呢？这种小家伙在酿酒、烘焙等领域可是一把好手，能把简单的原料变得美味无比。

想想看，酿酒的时候，如果pH值适合，酒精发酵顺利，出来的酒就会香醇可口，仿佛在舌尖跳舞，让人陶醉。

而在烘焙时，毕赤酵母的表现同样出色，面包蓬松的秘诀大概也与它分不开吧。

说到这里，许多人可能会想，如何才能精确控制这个pH值呢？其实也不难，市场上有很多工具，比如pH计，轻松就能测量出环境的酸碱度。