巴斯德毕赤酵母表达系统

毕赤酵母表达零碎之相礼和热创作Mut+和Muts毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产品，甲醇可紧密调理、诱导AOX1基因的高程度表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上.AOX1基因调控分两步：抑制/往抑制机制加诱导机制.简单来说，在含葡萄糖的培育基中，即便加入诱导物甲醇转录仍受抑制.为此，用甲醇进行优化诱导时，引荐在甘油培育基中培育.留意即便在甘油中生长(往抑制)时，仍缺乏以使AOX1基因达到最低程度的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达程度所必须的.AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达.AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，经过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株.在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培育基中，不管是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的工夫大约为2h.Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的状况下生长速率是一样的，存在甲醇的状况下，Mut+在对数期增殖一倍的工夫大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的工夫大约为18个小时.菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或构成正确的折叠结构.GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有渐变，是组氨酸缺陷型，假如表达载体上携带有组氨酸基因，可抵偿宿主菌的组氨酸缺陷，因而可以在不含组氨酸的培育基上挑选转化子.这些受体菌自发渐变成组氨酸野生型的概率一样平常低于10-8.GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts(载体取代AXO1基因)，可以在MM和MD培育基上鉴定表型.SMD1168和GS115类似，但SMD1168基因组中的Pep4基因发生渐变，是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用.其中X-33由于是野生型，因而耐受性比较好，假如担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而X33与GS115一样都是属于MUT＋表示型，也就是说可以在含甲醇的培育基中快速生长，但是听说会对外源基因表达有影响，KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)有渐变，在不含精氨酸的培育基中不克不及生长.用野生型ARG4基因(约2kb)拔出到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密码子)及SalI(AOX1基因227/228密码子)位点，取代了AOX1基因16-227密码子，此结构转化至KM71亲本菌(arg4his4)中，分离发生KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+转化子遗传分析表现野生型AOX1被aox1::ARG4结构所取代，以是KM71全部转化子都是Muts表型.AOX1位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构经过基因取代方法更换aox1::ARG4结构，这样重组菌株的表型是His+MutsArg-，这意味偏重组菌株生长时需精氨酸.但仅添加精氨酸其实不克不及完全缓和arg4渐变的影响，arg4菌株在含精氨酸的最小培育基中不克不及很好地生长.因而不引荐在KM71中经过取代aox1::ARG4结构来获得His＋转化子.一样平常来说，假如是胞内表达，应尽量用Muts细胞，这样得到的蛋白产品中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量绝对较多，使卑鄙纯化更易进行.而对于分泌蛋白的表达，无论是甲醇利用慢(Muts)还是甲醇利用快(Mut+)的细胞都可运用.基因重组Pichia.pastoris酵母菌体内无自然质粒，以是表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以完成外源基因的表达，包含启动子、外源基因克隆位点、停止序列、挑选标识表记标帜等.细菌内同源重组被以为是重组质粒构建过程的难点，由于未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低，以是重组转移载体必须用特定的限定性内切酶进行线性化处理.这种处理的目的是防止随机拔出重组时质粒在功能区断开，形成目的基因表达失活，让同源重组以指定的方式发生.表达载体次要分为以下几类：(1)胞内表达载体次要有pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10，pGAPZ、pGAPZa(Invitrogen)等.该类载体可以将目的基因表达在胞内，可以防止毕赤酵母的糖基化，次要得当于那些不克不及被糖基化相关基因的表达；(2)分泌型表达载体次要有pPIC9、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P等.由于毕赤酵母本人的泌内源蛋白非常少，将外源蛋白分泌到胞外，非常有利于目的蛋白质的纯化及积存.经常运用的分泌的信号序列次要是由89个氨基酸组成的α交配因子(α-factor)的引导；(3)多拷贝拔出表达载体如pPIC9K，pPIC3.5K.在某些状况下，毕赤酵母中重组基因多拷贝整合可添加所需蛋白的表达量.该载体均可用于在体内(pPIC3.5K, pPIC9K)或体外(pAO815)发生并分离多拷贝拔出，同时可检测添加重组基因的拷贝数能否添加蛋白表达量.体内整合可经过高遗传霉素抗性挑选可能的多拷贝拔出，而体外整合可经过连接发生外源基因的串联拔出.在GS115中挑选His+Mut+转化子：用SalI或StuI线性化质粒转化GS115后，大多在His4位点上发生重组，大多数转化子是Mut+表型；但是由于质粒含有AOX1基因序列，有可能在AOX1位点发生重组，毁坏野生型AOX1基因，发生His+Muts转化子，则必要在MD及MM平板上检测可证明His+ Mut+转化子.毕赤酵母表达经常运用培育基10×YNB(13.4%的无氨基酸酵母氮源)，134gYNB固体溶于1L蒸馏水，过滤灭菌，4℃保管.YPD完全培育基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L(固体培育基含1.5%琼脂).转化培育基RDB：每100mL加入山梨醇18g(186 g/L)，琼脂糖2g(20g/L)121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃当前在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L)，100×AA 1mL.混匀，倒平板(灭菌时只加入80ml水即可).选择培育基MD(最小葡萄糖)：配100mL，向80mL水中加入琼脂糖2g(20 g/L)121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃当前在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L).选择培育基MM(最小甲醇)：配100mL，向90mL水中加入琼脂糖2g(20 g/L)121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃当前在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L)，0.5mL甲醇(0.5%).诱导表达培育基BMGY：配1L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至890mL，121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃当前在超净台上加入10×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甘油10mL.诱导表达培育基BMMY：酵母提取物10g/L，蛋白胨20 g/L，3g/LK2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至895mL，121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃当前在超净台上加入100×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甲醇5mL.BMGY/BMMY含酵母浸出物及蛋白胨，可波动分泌蛋白，制止或减少分泌蛋白的分解.假如目的蛋白对中性PH蛋白酶敏感的话，可在无缓冲培育基(MGY、MM)中表达.假如没有证据证明你的分泌蛋白对中性PH值蛋白酶敏感，建议开始表达时用BMMY.假如表达蛋白降解了，测验考试在无缓冲培育基中进行表达.假如以上条件仍不克不及无效防止蛋白降解，可将基因转入SMD1168中，该菌株表型是his4pep4，缺失了蛋白酶，转化与表达程序与GS115相反，也可用于大规模发酵.用考马斯亮蓝G-250测蛋白含量。

巴斯德毕赤酵母表达系统及其在饲料添加剂开发上的应用前景许英蕾;孙建义;刘明启
【期刊名称】《饲料工业》
【年(卷),期】2005(26)2
【摘要】经过近15年来的不断开发和完善,巴斯德毕赤酵母已经成为目前最成功
的酵母表达系统之一。

由于该酵母具有高水平表达的潜力和能进行高密度发酵,它
的大规模发酵可用于生产多种新的蛋白。

一些生长激素、酶、抗菌肽在毕赤酵母中的成功表达展示了该表达系统在饲料添加剂开发上的广阔应用前景。

【总页数】3页(P40-42)
【关键词】巴斯德毕赤酵母;酵母表达系统;抗菌肽;蛋白;高密度发酵;生长激素;展示;饲料添加剂;应用前景;生产
【作者】许英蕾;孙建义;刘明启
【作者单位】浙江大学饲料科学研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S816.7;Q786
【相关文献】
1.戊型肝炎病毒开读框架(ORF2)1.3 kb片断巴斯德毕毕赤酵母表达载体的构建 [J], 张春江;沈心亮;雷清;李启民
2.巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及应用 [J], 王清路;李俏俏;薛金艳;窦烨;王红艳;张玉军;张杰
3.巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展和前景展望 [J], 娄瑞娟;罗利龙;张霞;张瑞刚;宋水山
4.巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统及其在外源蛋白生产中的优势与应用前景 [J], 马兴元;谭建华;朱平;孙曼霁
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巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展和前景展望娄瑞娟;罗利龙;张霞;张瑞刚;宋水山【摘要】巴斯德毕赤酵母经过近二十来年的发展,已经成为表达外源基因的优秀表达系统之一,成功地表达了许多重组异源蛋白.从表达菌株,表达载体等方面详细综述了毕赤酵母表达系统的优点,如:营养要求低、可高密度发酵、遗传稳定性高等;分析了可能影响巴斯德毕赤酵母表达系统的相关因素,这些因素包括外源基因的特性、基因拷贝数、产物稳定性及发酵策略等,结合这些因素和具体实践经验,就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量进行了阐述;讨论了该表达系统存在的不足之处并且展望了其发展前景.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2010(027)005【总页数】4页(P73-76)【关键词】巴斯德毕赤酵母;表达系统;外源基因;高效表达【作者】娄瑞娟;罗利龙;张霞;张瑞刚;宋水山【作者单位】河北工业大学,化工学院,天津,300100;河北省生物研究所,石家庄,050051;河北工业大学,化工学院,天津,300100;河北省生物研究所,石家庄,050051;河北省生物研究所,石家庄,050051;石家庄市第二中学,石家庄,050051;河北省生物研究所,石家庄,050051【正文语种】中文【中图分类】Q935酵母作为一种表达外源基因的宿主菌,既具有操作简单,生长快等特点,又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。

在表达某些基因工程产品时,可以大规模生产,从而有效地降低成本。

常用的酵母表达系统有酿酒酵母表达系统,甲基营养型酵母表达系统和裂殖酵母表达系统。

其中,尤以甲基营养型酵母表达系统中的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统最为常用,它具有其他表达系统所无法比拟的特点:如自身分泌的背景蛋白少,糖基化程度低,对营养要求低,可采用廉价的培养基,易于高密度发酵等。

因此,巴斯德毕赤酵母作为一种现代分子生物学研究最重要的工具模型,越来越受到研究学者的关注。

摘要巴斯德毕赤酵母表达系统是分子学领域内被广泛应用于重组蛋白生产的主要系统之一，既具有操作简单，生长快等特点，又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。

在外源蛋白表达系统中，影响蛋白表达的一个主要因素是启动子活性。

启动子作为基因表达的重要调控元件，通过与转录因子相互作用控制基因转录的起始和表达水平，在转录水平上起重要作用，因而启动子活性的高低在很大程度上影响着蛋白的表达水平。

在毕赤酵母表达系统中，醇氧化酶基因的启动子P AOX1是最常用的启动子，已实现了各种外源蛋白的高效表达尤其是人源蛋白的表达。

但P AOX1是甲醇诱导型启动子，在食品、医药上的应用受到限制，且甲醇的储存和运输等存在火灾隐患，因此毕赤酵母非甲醇诱导的启动子在不断被开发。

根据本实验室对毕赤酵母转录组的研究数据，在以甘油为碳源的培养基中，转录水平最高的是被命名为GCW14(NCBI编号：XM_002490678) 的细胞壁蛋白基因，该基因为组成型表达，推断GCW14具有潜在的高活性启动子。

此外，根据已有的实验数据证明：敲除毕赤酵母基因组上的GCW14基因会降低以Gcw14p为锚定蛋白的CALB的表面展示酶活力，说明壁蛋白Gcw14p与外源蛋白表面展示的效果有关。

本研究将壁蛋白Gcw14p的启动子P GCW14应用于南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）的毕赤酵母表达中，并与启动子P AOX1、P GAP、P TEF1的活性进行比较；对P GCW14启动子进行突变，初步探索该启动子的作用元件；将活性提高的突变启动子应用于CALB的表达中，提高CALB的酶活力，也为提高毕赤酵母外源蛋白的表达奠定基础。

主要研究内容如下：(1)为了比较P GCW14和其他3种启动子P AOX1、P GAP、P TEF1表达CALB的能力，构建了4种不同启动子的CALB表面展示重组菌：X33/ pPG14-CALB、X33/pZαA-CALB、X33/pPGAP-CALB和X33/pPTEF1-CALB。

Man5GlcNAc2哺乳动物甘露糖型糖蛋白的毕赤酵母表达系统构建杨晓鹏1，刘波1，宋淼1,2，巩新1，唱韶红1，薛奎晶1,2，吴军1【摘要】摘要: 蛋白的糖基化对蛋白的活性、高级结构及功能都有重要的影响。

酵母表达的糖蛋白不同于哺乳动物表达的杂合型或复杂型糖蛋白，而是高甘露糖型或过度甘露糖化糖蛋白。

在前期成功敲除毕赤酵母α-1,6-甘露糖转移酶(Och1p)基因、阻断毕赤酵母过度糖基化，获得毕赤酵母过度糖基化缺陷菌株GJK01 (ura3、och1) 的基础上，通过表达不同物种来源的α-1,2-甘露糖苷酶I (MDSI) 的活性区与酵母自身定位信号的融合蛋白，并通过DSA-FACE (基于DNA测序仪的荧光辅助糖电泳) 分析筛选报告蛋白 HSA/GM-CSF (人血清白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白) 的糖基结构，发现当编码酿酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶(MnsI) 基因的内质网定位信号与带有完整C-端催化区的拟南芥MDSI基因融合表达时，毕赤酵母工程菌株能够合成Man5GlcNAc2哺乳动物甘露糖型糖蛋白。

这为在酵母体内合成类似于哺乳动物杂合型或复杂型糖基化修饰的糖蛋白奠定了基础。

【期刊名称】生物工程学报【年(卷),期】2011(027)001【总页数】10【关键词】关键词: α-1,2-甘露糖苷酶I，Man5GlcNAc2，糖基化，毕赤酵母，甘露糖型近年来，药用蛋白市场的需求越来越大，在这些蛋白中糖蛋白占绝大多数，例如各种治疗性抗体、细胞因子等。

糖蛋白是糖基与蛋白共价相连构成的结合蛋白，糖蛋白的糖基与蛋白的功能、稳定性均有着密切的联系[1]。

糖蛋白根据糖基和蛋白质的连接方式不同，可分为2大类，即O-连接和N-连接糖蛋白。

其中，对N-连接糖蛋白的糖基化修饰研究得比较透彻，其修饰序列极端保守，即在Asn-X-Thr/Ser (X为除Pro外的任意氨基酸) 的Asn残基上。

目前重组糖蛋白药物的生产主要是哺乳动物细胞表达系统。

毕赤酵母表达系统毕赤酵母表达系统前言：所用表达质粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。

抗性选择：最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。

毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115 及KM71 在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4 基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。

GS115 及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。

转化之前，GS115 及KM71 都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。

培养温度：毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。

在32 度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。

贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD 琼脂斜面1 挑取所需菌株单克隆在YPD 平板上划线生长；2 挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30 度2 天；3 细胞在4 度可放几周几月或几年，存于－80度1 挑取所需菌株单克隆在YPD 中过夜培养；2 收集细胞，在含15%甘油的YPD 中悬浮至终OD600 为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）；3 细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。

注意：在4 度或－80 度长期保存后，用之前建议在MM、MD 或MGY 平板上划线培养以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。

以质粒pPIC9K，酵母Pichia pastoris GS115为例说明做法。

载体pPIC9K酶切为点线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子，可能其中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。

如果只想得到Muts 重组子，使用KM71 菌株。

单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts 重组菌（例如：插入AOX1或his4 而不是取代AOX1）。

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展作者：方园园来源：《绿色大世界》2009年第12期摘要:经过近20年的不断开发和完善,巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)已经成为目前最成功的真核表达系统之一,被广泛用于医药生产、饲料添加剂开发和科学研究。

介绍了毕赤酵母的生物学特性、常用菌株和表达载体的特点及其研究进展,并阐述了其在外源蛋白的表达方面具有的独特优势。

关键词:毕赤酵母;表达载体;外源蛋白中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1005-569X(2009)12-0037-031 引言巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)是一类在缺乏葡萄糖或甘油时,能利用甲醇做为唯一碳源和能源的酵母菌,具有旺盛的生命力,可以在廉价的非选择性培养基中生长,有较宽的生长pH适应范围(3.0～8.0),有较好的发酵基础,非常有利于实现高密度发酵培养,菌体密度可高达100g干细胞/L,它们生长的适宜温度一般为28～30℃,是常用的外源蛋白表达系统。

2 巴斯德毕赤酵母宿主菌株根据对甲醇利用的情况,P.pastoris可划分为三种表型:第一型,即Mut+型,此型毕赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似,称为甲醇利用正表型。

绝大多数毕赤酵母为Mut+表型,如GS115和SMD1168;第二型,即MutS型,此型毕赤酵母的AOX1基因部分敲除,被酿酒酵母ARG4基因所取代,AOX2虽然与AOX1有97 %的同源性,但在含甲醇的培养基内该型毕赤酵母生长缓慢,称为甲醇利用慢表型,如KM71(his4 arg4 aox1::ARG4);第三型,即Mut-型,此型毕赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,细胞不能进行甲醇代谢,无法在甲醇中生长,为甲醇利用负表型,如MC100-3(his4 arg4 aox1::ARG4 aox2::Phis4)。

后两者表达外源蛋白有时优于野生株,且需甲醇较少,有时其表达量甚至高于Mut+型。