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第22卷 第3期 吉首大学学报(自然科学版)Vol.22 No.3 2001年9月J ournal of J ishou University(Natural Science Edi ti on)Sept.2001文章编号:1007-2985(2001)03-0040-05外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略聂东宋,梁宋平,李 敏(湖南师范大学生命科学院,湖南长沙 410081)摘 要:高效表达外源蛋白,在理论和实践上特别是在生物制药中具有重要意义,巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)是表达外源蛋白最理想的真核表达系统之一.影响外源蛋白在P.pas toris中表达的因素很多,主要包括外源基因自身的特性、载体、宿主细胞几个方面,了解和灵活运用它们的联系,有助于获得外源基因在P.pastoris中的高效表达.关键词:巴氏毕赤酵母;外源蛋白;高效表达中图分类号:Q75 文献标识码:A巴氏毕赤酵母(P.pastoris)是一种单细胞真核生物,基因工程菌近年来已被广泛用于商业化生产外源蛋白.与其它表达系统比较,该系统具有以下优点:(1)高表达.该表达系统利用醇氧化酶基因启动子很强,细胞生长速度快,所以该表达系统表达的外源蛋白产量很高,如破伤风毒素蛋白的产量高达12g/L[1],其它表达系统一般为毫克级.(2)高稳定.由于该表达系统的表达载体不是以自主复制的质粒形式存在,而是整合到酵母染色体上,所以构建的菌株十分稳定.(3)高分泌.P.pastoris中一些分泌信号和先导序列如a-因子的分子生物特性已研究得十分清楚,加之它身体的生物学特性,其分泌表达可达10g/L,这在已知的分泌表达系统中是十分罕见的.虽然已有许多蛋白在P.pastoris中实现了高效表达,但仍有一些蛋白表达量相对较低,如 -cryptogein表达量级为1~5mg/L[2],AFP在摇瓶中表达时最高水平不超过5mg/L[3],有些甚至不能表达,如HIV表面糖蛋白[4].此外,酵母表达系统的局限性还在于分泌表达产物的不均一性,如信号肽加工不完全,表达产物内部降解等现象[5] 其次,当利用该系统的载体将外源基因通过双交换整合到宿主体中AOX1基因位置时,AOX1基因被破坏,这样使细胞利用甲醇能力大大降低.从而大大延长了细胞培养发酵时间.这种外源蛋白表达的差异,一方面是由于外源基因本身的特性而引起的,另一方面,表达条件也对表达量起了极其重要的作用.笔者综述了影响甲醇酵母中外源基因高效表达的各种因素,并阐述了优化外源蛋白在P.pastoris中高效表达的策略.1 外源基因本身的特性对表达的影响1 1外源基因的A+T组成外源基因本身的4种核苷酸的组成对基因的表达起重要作用.许多高A+T含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录,共有序列ATTATTTTATAAA就是一个转录提前终止信号 Caro1A Scorer[6]在表达人免疫缺损病毒(HI V)包膜糖蛋白gp120时,这个信号造成了gp120的转录提前终止.提前终止被认为是一种具有种族特异性的现象,如在P.pastoris中不能表达的HIVE NV蛋白在酿酒酵母中表达良好.[4]因此,可以通过调整高A+T含量区的核苷酸的组成来避免提前终止的发生,使其A+T含量在30%~50%收稿日期:2001-08-05基金项目:国家自然科学基金资助项目(39670392)作者简介:聂东宋(1967-),男,湖南省衡阳县人,湖南师范大学硕士研究生,主要从事基因结构与功能研究.范围内,CareJJ [1]用这种方法使破伤风毒素C 片段得到高效表达.1 2密码子的选择在不改变氨基酸组成的前提下,通过修饰密码子序列也可以提高表达水平.目前公认的观点是:通过优化基因的密码子序列,可以适应tRNA 的同工受体及宿主的反义密码子摇摆位置处被修饰的核苷酸的丰度,同时也有利于翻译的二级结构的形成.在酵母中表达较高的基因往往是采用酵母本身所偏爱的密码子,研究也表明在所有61个密码子中有25个是酵母所偏爱的[7].赵翔[8]通过对Pichia pastoris 的28个蛋白编码基因的同义密码子的使用情况的分析,确定了P.pastoris 的19个高表达优先密码子.这些结果与已知的Saccharomyles Cervisiae 及Kluyveromyles lactis 的密码子基本相似,但在谷氨酸的密码选择上截然相反.谷氨酸以GAG 为高表达优越密码而不是以S.cerevisiae 和ctis 所偏爱的GAA 为优越密码.姚斌等[9]在P.Pastoris 中表达植酸酶时,把在酵母中使用频率为0的精氨酸的密码子突变为使用频率较高的密码子时,表达水平提高了37倍.1 3mRNA5 非翻译区(5 -UTR)核苷酸的序列和长度5 -UTR 的核苷的序列和长度影响外源基因的表达.由于UTR 太长或太短都会造成核糖体40S 亚基识别障碍,因此,一个适当长度的5 -UTR 有助于mRNA 进行有效的翻译.Aox1基因5 -UTR 长为114nt 且富余A+ ,因此,为了获得最佳蛋白表达量,维持外源基因mRNA5 -UTR 尽可能与Aox1mRNA5 -UTR 相似是十分必须的,最好二者保持一致.Sreekrishna 等[10]通过调整人体血清白蛋白的(HSA)的mRNA5 非翻译区使之与醇氧化酶Aox1的非翻译区保持一致后,HSA 的表达量提高50倍以上,肠组织蛋白酶E (C TSE)的表达水平通过5 -UTR 的调整亦极大地增加[11].此外5 -UTR 应避免AUG 序列,以确保mRNA 从实际翻译起始位点开始翻译,起始密码AUG 周围不应形成二级结构,可通过密码子的替换来达到目的.2 外源蛋白在P.pastoris 中的高效表达策略2 1优化表达载体系统1)载体的选择.应用甲醇酵母表达异源蛋白时有多种载体可供选择,既有胞内表达载体(如pPIC3),又有分泌表达载体,如pPIC9,PHI L-D,PA0804,Pa0815,Ppsc3K 等.一般而言,对于非分泌蛋白采用胞内表达方式,而对于正常分泌蛋白则选择分泌型载体,这样更有利于表达产物的分离纯化.2)选择强启动子.P.pastoris 载体中最常用的启动子为Aox1启动子(Aox1promoter P Aox1),它的甲醇诱导性很强,因此,由它控制的外源基因通常能得到高效表达.也有人曾用P Aox2和P DAS 启动子,但二者的强度大大低于PAox1.如果带有外源基因的载体通过双交换整合起P.pastoris 的Aox1基因位置时,Aox1基因将被破坏.虽然Aox2和Aox1基因的序列同源性高达97%,但Aox1基因表达产物在正常细胞中仅占总酶量的5%.这样就使细胞利用甲醇的能力大大下降,从而使表达量下降且延长了细胞发酵时间(150~200h).为了克服这一缺点,戴秀玉[12]等通过分离选择恢复利用甲醇能力的自发突变体,从Aox1基因缺陷菌株中分离得到Mut +的自发突变体.他们对突变体的Aox2基因上游区域经PCR 护增产物测序,确定了该突变体在-255和-529两个位置的碱基发生了改变,而这两个位置为阻遏蛋白结合区域.该区域发生点突变后阻遏蛋白便不能很好地与之结合,通过去阻遏作用使得转录效率增强,从而提高表达量和缩短发酵时间.最近一种无需甲醇诱导而能组成性表达外源基因的毕赤酵母载体pGAPB 和pGAPB 已经构建成功,这些载体利用了三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因启动子P GAP ,在它的控制下B-1acz 基因表达率比甲醇诱导下的以P Aox1启动子的产量更高[13].由于该组成型启动子不需甲醇诱导,发酵工艺更为简单,而且产量更高,所以成为替代PAox1的最强有力的启动子.Doring 等[14]分别用pGAPZB 和pPICZB 来生产兔肾肽载运蛋白(rPE PTZ)和小人肠肽转运蛋白(hpEPTZ),前者表达的这两种蛋白的产量均比后者高4倍,看来在生产哺乳动物膜转运蛋白时pGAP 比PAox1更理想.3)信号肽的选择.分泌表达是一种理想的蛋白质生产方式,既可以减轻宿主细胞代谢负荷,又可减少宿主细胞蛋白酶对外源蛋白的降解.利用外源蛋白自身信号肽与酵母信号肽表达外源蛋白均有成功报道.用自身信号肽在P.pastoris 中表达成功的例子如人血清白蛋白和牛凝血酶等.但如果自身的信号肽序列效41第3期 聂东宋,等:外源蛋白在巴氏毕赤酵母中的高效表达42吉首大学学报(自然科学版)第22卷果不佳则可尝试用甲醇酵母的信号肽.这些信号肽主要有酸性磷酸酶基因PHO1的信号肽、蔗糖酶基因SUC2的信号肽、间质金属蛋白酶(MMP)的信号肽及转化酶(invertase)的信号肽等.其中a-因子信号肽使用最广,尤其对于小分子物质如抑肽酶、表皮生长因子、凝血固子X 等[10].杨晟[15]等采用a-因子信号肽比利用人血清白蛋白天然前导肽作为分泌信号肽可使重组人血清白蛋白表达量高出10%左右.另外如果外源基因产物不能分泌到体外,还可将产物连上一个定向肽(peroxisome targeting singal,P TS),使其定向运输到过氧化物酶体中,以免产物积累对宿主细胞造成毒害,同时产物自身的稳定性会大大增强.Water-ham[16]等利用定向肽在P.pastoris中成功地将P GAP启动下的 -半乳糖苷酶定向运输到过氧物酶体中.但用P.pastoris表达基因工程产物的另一问题是信号肽加工不完全,其表达的外源基因产物常比设计的多几个氨基酸残基,这可能是酵母自身调节机制对外源基因高表达的应答反应[5].Singh[17]等通过定向缺失诱变MF a1和干扰素基因连接处寡核苷酸导致了含有天然N端的成熟干扰素的正确释放,可以成为解决这一问题的好办法.2 2 增加外源基因整合拷贝数巴氏毕赤酵母载体在宿主染色体上大多数为单拷贝整合,但由于P Aox1在甲醇诱导下的强启动性以及整合后常常稳定,所以即使单拷贝也能获得较高的产量.如乙肝表面抗原在P.pastoris中单拷贝产率可达0 4g/L(酿酒酵因至少需50拷贝才能达到此水平)[18].但在另一些例子中,提高拷贝数可大大增加表达水平,如鼠表皮生长因子(E GF)、人肿瘤坏死因子(TNF)和破伤风毒素片段C[10].目前提高整合拷贝数的方法主要有:(1)通过不同的转化方法提高拷贝数.P.pastoris的转化方法有电激法、原生质体法、氯化锂法等,其中以原生质法转化使细胞群中产生多拷贝转化子频率相对较高.但若使用G418检测拷贝数,则配合电激法转化的效果更好[19].(2)在体外载体上多次插入目的基因片段.但这种多拷贝整合不太稳定且拷贝数有限.(3)将载体中目的基因两端连上来自宿主或其它非必需高重复的基因片段,通过同源重组而达到高拷贝整合的目的.由于rDNA在酵母基因组中有100~200个重复单元,所以这是一种提高拷贝的理想方式.该策略已在酿酒酵母[20]、乳酸克鲁维酵母[21](K lactis)中得到成功应用,可惜在P.pastoris中尚未见实验报道.目前要快速高效地筛选高拷贝的转化子,传统方法有SDS-PAGE、免疫印迹、southern blotting 等,但这些方法费时费力.通过PC R法检测拷贝数既方便又快捷,另外还可通过提高G418的浓度来筛选高拷贝转化子.但是个别情况下,拷贝数增加对产量也会产生负效应[22],这可能是由于分泌效率低的蛋白在过高表达的情况下会对分泌途径形成负反馈抑制,因此基因拷贝数对表达量的影响是无法预测的.高表达菌株的筛选应以表达蛋白量为唯一标准.Jeffrey[23]等建立了一种双筛选膜筛选方法:首先将菌转至醋酸纤维素膜上,再与硝酸纤维素膜叠放在酵母固体培养基上,经过一段时间培养后分泌蛋白就印在硝酸纤维素膜上,接着用此蛋白的抗体检测,即可挑出最高蛋白量对应的克隆.用这种方法,每套滤膜可筛选出100 ~1000个克隆,从而快速地从大量重组子中筛选出高表达克隆.2 3优化发酵条件1)通过提高菌株的生物量来提高外源蛋白表达量.采用不同的培养基配方和不同的发酵参数,通过提高细胞的绝对总数来提高外源蛋白的产量.影响P.pastoris生长的外界因素主要包括:(1)培养基组成.目前主要有MGY/mm、B MG/Bmm、B MGY/B mmy3种培养基可用于培养P.pastoris.但由于BMGY/Bmmy既含有磷酸缓冲液又含蛋白胨和酵母提取物,因而菌株生长更好,大大增加了生物量,使表达量也相应大大提高.如在表达mEGF时,在B mmy培养基中单拷贝转化子表达量为20 g/L,而在不含蛋白胨和酵母提取物的基本培养基中表达量少于1 g/L[24].蛋白胨和酵母提取物中几乎不含大分子蛋白质,只有分子量低于3000Da的小分子多肽,因此对于大分子外源蛋白的分离纯化不会造成不便.(2)诱导前菌体OD值.P. pastoris中蛋白表达分2个阶段:一是生长阶段,在含甘油的培养基中生长菌体,待OD600达到2~6时再离心收集菌体;二是诱导表达阶段,将收集的菌体转入含甲醇的培养基中诱导表达.理论上而言,OD600值越高,生物量越大,则总的表达量亦应该越高.但是OD600值越高培养基中氧和营养供给越受限制,而且外源蛋白的溶解性、稳定性、毒性都会对菌体产生影响.因此,高密度并不一定意味着高表达.鉴于发酵罐培养较之摇瓶培养在溶解量、pH值、通气量营养补给方面的优越性,有人建议在筛选高表达菌种时,经初筛后的菌株应立即用发酵罐进行发酵条件的研究,从而大大提高表达量.如在表达mEGF时,发酵罐较之摇瓶培养提高10倍,从48mg/L 到447mg/L;在表达破伤风肠毒素C 片段时,发酵罐也提高表达量10~20倍.2)防止目的蛋白降解.外源蛋白的稳定性直接影响到基因表达的产量.几乎没有一种高表达蛋白是特别稳定的,宿主菌内蛋白酶水平决定着表达产物的降解速度.高密度培养酵母固然可以大大提高培养基上清中分泌外源蛋白的含量,但随着重组蛋白的分泌增加,其它一些细胞内物质如蛋白酶亦会分泌增多,在培养基中积累从而造成对重组蛋白的降解.此外酵母细胞膜上有一种KEX-2样蛋白水解酶,能专一性水解 -因子前体中羧基端的肽键,即连续的2个碱性氨基酸(如lysAry,lyslys,Arglys),从而使目的蛋白降解.为了提高外源蛋白在发酵液中的稳定性,免受蛋白酶降解,可采有以下几种方法:一是改造P.pastoris 表达宿主菌株,缺失基因组中主要蛋白水解酶的基因,使目的基因稳定.或使用已有的蛋白酶缺陷菌株如SMD1168(his4pep4)、SMD1165(his4,prb1)和SMD1163(his4,pep4,prb1)亦可避免产物降解的发生[10].二是在培养液中补加一些富含氨基酸的组分和酪蛋白水解物、胃蛋白水解物,提供给酵母细胞蛋白酶过量的底物,以减少目的蛋白的降解.三是由于P.Pastoris 能忍耐较宽的pH 范围(pH 3.0~7.0),因此可调节溶液pH 值抑制蛋白水解酶活性,防止目的蛋白降解.四是降低甲醇诱导表达时的培养温度,Mei M 等[25]通过将诱导表达时的温度由30 降至25 ,半乳糖氧化酶表达量提高4倍.总之,P.pastoris 表达系统由于具有表达量高、本身遗传稳定、具翻译后加工能力、产物可分泌发酵、工艺成熟、分离纯化简单、蛋白质产物糖基化方式更接近高等生物等优点,已成为目前国内外倍受青睐的真核表达系统.目前用该系统表达的外源基因已上百种,很多医药制品如人血清白蛋白、人白介素-2、乙肝表面抗原、水蛭素等在该系统中都已成功表达,有些即将进入市场[26].但影响外源基因在P.pastoris 中表达的因素非常复杂,建立稳定的高效表达外源蛋白的表达体系并非易事.笔者着重探讨了与遗传因素及发酵方面有关的因素,这些策略的灵活运用将不同程度改善外源蛋白在P pastoris 中的表达水平.外源蛋白在P.pastoris 的高效表达是一个涉及多学科的问题,尚需其它研究领域的共同合作探讨.参考文献:[1] CLARE J J,RAYMENT F B,B ALLANTINE S P,et al.Hihg-level Expression of T etanus Toxin Fragment C in Pichia Pastoris StrainsContaining Multiple T andem Integration of the Gene[J].Bio/Technology,1991,(9):455-460.[2] MIC HAEL J D.Over Expressi on in Pichia Pastoris and Crystallization of an Elicitor Protein Secreted by the Phytopathogenic Fungus[J].Protein expression and Purification,1996,(8):254-261.[3] LOEVEN M C.Biosyn thetic Production of Type Fi sh Anti freeze Protein:Fermen tation by Pichia Pastris[J].Appl Microbiol Bi tech -nol,1997,(48):480-486.[4] CLARE J,SCORERC,BUC KHOLZ R E xpression of EGF and HIV Envelope Glycoprotein[J].Methods Mol 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写一篇毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用的报
告，800字
毕赤酵母表达系统是一种高效、灵活的工具，可用于外源蛋白表达研究和应用。
它是一种重要的生物工程技术，可以实现外来基因的大规模表达，分子量可达到200 KD 以上。
目前，毕
赤酵母表达系统已成功地用于各类重要蛋白质的表达，并发挥了重要作用。
毕赤酵母表达系统的优势在于它能够表达复杂的蛋白质，而且不受细胞因子的限制，能够有效提高蛋白表达的效率。
此外，该系统还具有良好的原核性、容易稳定表达、灵活的改造等特点。
因此，毕赤酵母表达系统被广泛应用于外源蛋白表达和重组蛋白的研究中。
例如，已成功利用该系统彻底破解人工合成水稻Hsp70基因编码蛋白的结构，它同时也是人类在蛋白研
究中的有力工具。
毕赤酵母表达系统在医学研究中也得到了很大的发展。
比如，可以用毕赤酵母表达系统来研究和表达病毒血管瘤病毒(HPV)-695E5蛋白，而这种蛋白可能会加速病毒复制和细胞侵入，因
此有助于治疗HPV相关的癌症。
利用毕赤酵母表达系统还可
以大规模表达多肽，如α-肌动蛋白及其相关蛋白，从而探索
肌钙蛋白的生物学功能。
总的来说，毕赤酵母表达系统是一种重要的生物工程技术，它能够实现外来基因的大规模表达，受益于它的灵活性和稳定性，可以成功用于外源蛋白表达及其相关研究与应用中，是一项具有重大意义的研究。
毕赤酵母表达外源蛋白糖基化研究进展杨婕【摘要】Pichia pastoris as the host for the expression of recombinant proteins, has not only the advantages of prokaryotic expression system such as inexpensive in culture, ease of genetical manipulation, high levelsof protein expression, but also has post-translational protein processing capabilities like other higher eukaryotes such as protein folding, formation of disulfide bond and glycosylation. Gly-cosylation is an important form of posttranslational modification in secreted proteins and affects the structure and function of these pro-teins. In this review, we discuss protein glycosylation and humanized glycosylation engineering in Pichia pastoris.%毕赤酵母作为表达外源蛋白的宿主，不仅具有原核生物表达系统的优点，如培养成本低、遗传操作简单、表达效率高等，还可以对表达的外源蛋白进行翻译后修饰加工，如蛋白质折叠、二硫键形成和糖基化等，因而有其独特的优势。
在分泌蛋白修饰中，糖基化是一种重要修饰方式，影响蛋白的结构与功能。
毕赤酵母表达系统研究进展马银鹏;王玉文;党阿丽;孔祥辉;张介驰【摘要】毕赤酵母是外源蛋白表达的一种重要宿主.毕赤酵母表达系统既具有原核表达系统操作简单、价格低廉、生产率高的优点,又具有真核表达系统能对表达后的蛋白折叠、糖基化和形成二硫键等翻译后进行加工和修饰的功能,因此毕赤酵母表达系统具有广泛的应用前景和重要的研究价值.本研究对毕赤酵母表达系统的特点、组成、影响外源基因高效表达的影响因素等进行总结.【期刊名称】《黑龙江科学》【年(卷),期】2013(004)009【总页数】5页(P27-31)【关键词】毕赤酵母;表达系统;外源蛋白;甲醇【作者】马银鹏;王玉文;党阿丽;孔祥辉;张介驰【作者单位】黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院高技术研究院,哈尔滨150020;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院高技术研究院,哈尔滨150020【正文语种】中文【中图分类】Q815大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统由于其具有遗传背景和生化特性清楚、成本低廉、操作简便、生产效率高等优点最早被采用作为外源基因表达系统。
但大肠杆菌表达系统缺少真核生物的蛋白翻译后进行加工和修饰的功能，表达的蛋白大部分以包含体形式存在，且需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性以及背景杂蛋白较多[1］，为克服这些缺点，人们于1979年开发了酵母表达系统。
酵母是单细胞低等真核生物，既具有原核生物细胞生长速度快、容易培养、操作简单等优点，又具有真核生物表达时对蛋白质的加工和修饰等功能。
因此相对于原核表达系统表达出的不具有活性的蛋白，酵母表达出的蛋白是具有生物学活性的，而且酵母表达系统比其他真核表达系统如昆虫、哺乳动物组织等表达系统快速、简便、成本低[2］。
影响外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达和分泌的研究进展张丞斌;傅正伟
【期刊名称】《现代生物医学进展》
【年(卷),期】2008(008)007
【摘要】巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的外源蛋白表达系统.但外源基因在该系统中表达时,由于受自身特性及环境等诸多因素的影响,在表达过程中出现表达量不够稳定或较低,甚至不表达的情况.本文对影响巴斯德毕赤酵母表达的各种可能因素进行了分析,并就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的问题进行了简要的综述.
【总页数】3页(P1382-1384)
【作者】张丞斌;傅正伟
【作者单位】浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江,杭州,310032;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江,杭州,310032
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
【相关文献】
1.巴斯德毕赤酵母PEP4基因的剔除及对基因工程菌外源蛋白质表达的影响 [J], 杨扬;赵健;石军
2.巴斯德毕赤酵母PEP4基因的剔除及对基因工程菌外源蛋白质表达的影响 [J], 杨扬;赵健;石军
3.巴斯德毕赤酵母表达系统及其分泌型蛋白表达的研究进展 [J], 路蓉;安云庆
4.利用巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展 [J], 余祖华;王红宁
5.巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展 [J], 龙晶;杜立新
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巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展和前景展望娄瑞娟;罗利龙;张霞;张瑞刚;宋水山【摘要】巴斯德毕赤酵母经过近二十来年的发展,已经成为表达外源基因的优秀表达系统之一,成功地表达了许多重组异源蛋白.从表达菌株,表达载体等方面详细综述了毕赤酵母表达系统的优点,如:营养要求低、可高密度发酵、遗传稳定性高等;分析了可能影响巴斯德毕赤酵母表达系统的相关因素,这些因素包括外源基因的特性、基因拷贝数、产物稳定性及发酵策略等,结合这些因素和具体实践经验,就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量进行了阐述;讨论了该表达系统存在的不足之处并且展望了其发展前景.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2010(027)005【总页数】4页(P73-76)【关键词】巴斯德毕赤酵母;表达系统;外源基因;高效表达【作者】娄瑞娟;罗利龙;张霞;张瑞刚;宋水山【作者单位】河北工业大学,化工学院,天津,300100;河北省生物研究所,石家庄,050051;河北工业大学,化工学院,天津,300100;河北省生物研究所,石家庄,050051;河北省生物研究所,石家庄,050051;石家庄市第二中学,石家庄,050051;河北省生物研究所,石家庄,050051【正文语种】中文【中图分类】Q935酵母作为一种表达外源基因的宿主菌,既具有操作简单,生长快等特点,又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。
在表达某些基因工程产品时,可以大规模生产,从而有效地降低成本。
常用的酵母表达系统有酿酒酵母表达系统,甲基营养型酵母表达系统和裂殖酵母表达系统。
其中,尤以甲基营养型酵母表达系统中的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统最为常用,它具有其他表达系统所无法比拟的特点:如自身分泌的背景蛋白少,糖基化程度低,对营养要求低,可采用廉价的培养基,易于高密度发酵等。
因此,巴斯德毕赤酵母作为一种现代分子生物学研究最重要的工具模型,越来越受到研究学者的关注。
影响外源基因在巴斯德毕赤酵母中的表达摘要要在一种宿主表达系统中成功表达外源蛋白并获得较高产量，必须要较为全面地了解影响其表达的诸多因素。
影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素主要包括：外源基因的特性、表达框的染色体整合位点和方式、宿主菌的甲醇利用表型、基因剂量、分泌信号、产物稳定性和翻译后修饰等。
本文就这些因素进行分析，并提出一定的对策和建议。
酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。
几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichia pastoris, Pp)，因具有旺盛的生长力以及其它一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。
已有许多细菌、真菌和高等动植物的基因在Pp中成功表达(如破伤风毒素片段Ｃ，12g/L)，但也有许多蛋白的表达量并不理想(如多瘤病毒大T抗原，0.5mg/L)，甚至不能表达(如HIV表面糖蛋白)。
另外，酵母表达系统的局限性还在于分泌产物的不均一性，包括聚合体的存在、信号肽加工不完全以及内部降解等现象。
所有这些都提醒我们在Pp中表达外源蛋白时，应周密考虑影响其表达的各个因素。
1、外源基因特性外源基因在Pp中表达时，其自身就是影响表达水平的重要因素。
不同的培养基配方、发酵参数和饲养方案主要是通过提高细胞绝对总数而并非单个细胞产率来提高外源蛋白的产量。
Fahnestock等发现随着外源的蛛牵拉丝蛋白基因拷贝数的增加，其生产效率会相对有所降低。
另外，许多高A+T含量的基因常会由于提前终止而不能有效转录引;不合适的mRNA5'非翻译区的核苛酸序列和长度也可能会便基因的表达不尽如人意。
提前终止被认为是一种具有种属特异性的现象，譬如在Pp中不能表达的HIV ENV蛋白在啤酒酵母中却表达良好。
因此，可以通过调整高A+T含量区的核甘酸组成来避免提前终止的发生。
而Sreekrishna 等通过调整人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的mRNA5'非翻译区与醇氧化酶(alcohol oxidase 1，AOX1)的5'非翻译区相同后，HSA的表达量可以提高50倍以上。
毕赤酵母中外源蛋白表达量的提升策略
茹扎·也里扎提;杨宇
【期刊名称】《生物技术通报》
【年(卷),期】2024(40)3
【摘要】利用异源重组表达系统表达外源蛋白是基因工程研究的重点。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种甲基营养型酵母,由于其易于遗传操作、高水平分泌外源蛋白、翻译后修饰等特点,已成为工业应用中蛋白质生产的重要菌株,常被用于酶制剂的生产。
然而,部分外源蛋白在毕赤酵母系统中的表达水平较低,仍有待提升的空间。
因此,进一步探索提升毕赤酵母中外源蛋白表达量的原理和方法,将对降低毕赤酵母表达系统工业化生产成本,提高经济效益,具有重要的意义。
本文主要从基因水平、转录水平、翻译水平、折叠分泌水平、抗逆水平、发酵工艺六个方面归纳总结了近年来毕赤酵母提高外源蛋白表达的优化策略的研究进展,旨在为提高外源蛋白在毕赤酵母表达系统中的表达水平提供有益参考。
【总页数】17页(P118-134)
【作者】茹扎·也里扎提;杨宇
【作者单位】北京理工大学生命学院
【正文语种】中文
【中图分类】TS2
【相关文献】
1.外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达策略
2.巴斯德毕赤酵母高效表达外源蛋白的策略
3.巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的优化策略
4.基于提高蛋白在内质网中折叠效率的策略促进外源蛋白在毕赤酵母中表达水平的研究进展
5.毕赤酵母高效表达外源蛋白的分子水平策略
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巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展作者：方园园来源：《绿色大世界》2009年第12期摘要:经过近20年的不断开发和完善,巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)已经成为目前最成功的真核表达系统之一,被广泛用于医药生产、饲料添加剂开发和科学研究。
介绍了毕赤酵母的生物学特性、常用菌株和表达载体的特点及其研究进展,并阐述了其在外源蛋白的表达方面具有的独特优势。
关键词:毕赤酵母;表达载体;外源蛋白中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1005-569X(2009)12-0037-031 引言巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)是一类在缺乏葡萄糖或甘油时,能利用甲醇做为唯一碳源和能源的酵母菌,具有旺盛的生命力,可以在廉价的非选择性培养基中生长,有较宽的生长pH适应范围(3.0～8.0),有较好的发酵基础,非常有利于实现高密度发酵培养,菌体密度可高达100g干细胞/L,它们生长的适宜温度一般为28～30℃,是常用的外源蛋白表达系统。
2 巴斯德毕赤酵母宿主菌株根据对甲醇利用的情况,P.pastoris可划分为三种表型:第一型,即Mut+型,此型毕赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似,称为甲醇利用正表型。
绝大多数毕赤酵母为Mut+表型,如GS115和SMD1168;第二型,即MutS型,此型毕赤酵母的AOX1基因部分敲除,被酿酒酵母ARG4基因所取代,AOX2虽然与AOX1有97 %的同源性,但在含甲醇的培养基内该型毕赤酵母生长缓慢,称为甲醇利用慢表型,如KM71(his4 arg4 aox1::ARG4);第三型,即Mut-型,此型毕赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,细胞不能进行甲醇代谢,无法在甲醇中生长,为甲醇利用负表型,如MC100-3(his4 arg4 aox1::ARG4 aox2::Phis4)。
后两者表达外源蛋白有时优于野生株,且需甲醇较少,有时其表达量甚至高于Mut+型。
利用强效可调控启动子AOX，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因1工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］11. 彭毅，杨希才，康良仪。
影响甲醇酵母外源蛋白表达的因素。
生物技术通报2000，4：33-3612. 11 3 Cregg JM . Tschopp JF Stillman C, et al .High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast pichia.pastoris Bio/Technology,1987,5:479-48513. Sreekrishma K , Nelles L ，Potenz R，et al .High-level expression ,purification ,and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized and characterization in the methylotrophic yeast pichia .pastoris ,Biochemistry ,1989,28:4117-412514. Siegel RS , Buckholz RG, Thill GP , et al .Production of epider growth factor in methylotrophic yeast cells, International Patent Application ,1990 ,Publication No:WO90/10697毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
第28卷第1期 农业科学研究2007年3月 Vol.28No.1 Journal of Agricultural Sciences Mar.2007文章编号:167320747(2007)0120068204巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展魏凡华1,2,3,曹瑞兵3,吴 润1,陈溥言3(1.宁夏大学农学院,宁夏银川 750021; 2.甘肃农业大学,甘肃兰州 730071;3.南京农业大学农业部疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏南京 210095)摘 要:巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统,对Pichia pasto2 ris基因结构、载体元件以及影响外源基因表达的因素等进行了较为全面的综述.关键词:巴斯德毕赤酵母;基因表达系统;研究进展中图分类号:TQ926.1 文献标志码:A 目前,大肠杆菌类原核表达系统虽然较为成熟,但表达产物以包含体形式存在,无翻译后的糖基化等修饰加工过程,并且可能还会有细菌毒素.昆虫细胞表达存在不正确的糖基化,产物复杂,不易纯化,而哺乳动物细胞表达成本高,产量低.甲基营养型巴斯德毕赤酵母(Pichi a p astoris)已发展成为能够生成多种外源蛋白的卓越表达系统.1 巴斯德毕赤酵母菌株一般用于外源基因表达的Pichi a p astoris菌株有Y211430,M2C10023,GS115,KM71,SMD1168等.根据利用甲醇的能力,可将巴斯德毕赤酵母分为3型[1]:①Mut+型为甲醇快利用型,此型毕赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,绝大多数毕赤酵母为Mut+表型.②Muts型,此型毕赤酵母(如KM71)菌细胞AOX2基因编码的醇氧化酶可依赖15%AOX活性,为甲醇慢利用型.③Mut2型(如M2G10023),此型毕赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,为甲醇不利用型.研究发现,蛋白酶缺陷型毕赤酵母,如SMD1163, SMD1165和SMD1168可有效降低外源目的蛋白的酶解.一般说来,蛋白胞内表达时,优先考虑用Muts表型,对于分泌表达,Mut+和Muts都可使用.甲醇慢利用型有时比Mut+型菌株能够达到更高的表达量[2].2 Pichi a p astoris表达载体载体是由许多元件构成的,包括启动子、终止子、选择标记、报告基因、复制起点和信号肽序列等,典型的表达载体含有乙醇氧化酶基因5′AOX1启动子和3′AOX1终止子,其中含有供外源基因插入的多克隆位点,以组氨醇脱氢酶基因HIS4作为互补筛选标志或ZeocinR作为筛选标志.2.1 启动子Pichia pastoris含有两个基因编码醇氧化酶: AOX1和AOX2,二者序列有92%同源性,但是AOX1表达水平高于AOX2.AOX1启动子的表达受甲醇严格调控[3].以甲醇为碳源生长时,约5%的mRNA 由AOX1基因转录.P GA P(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是最近在毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,GA P启动子不需甲醇诱导,发酵工艺更为简单.Vassilen利用GA P启动子表达乙肝表面抗原获得高表达[4],Genzyme也利用GA P启动子表达人几丁质酶,不仅获得高表达,而且还可以避免蛋白酶水解[5].Phongdara在H ansenul a pol y mor p ha克隆到酸性磷酸酶(p HO1)基因启动子[6].这些启动子丰富了甲醇酵母对启动子的选择.2.2 选择标记选择标记一般为对应于营养缺陷型受体的野生型基因,常用HIS4,也可用来源于酿酒酵母的AR G4基因和SUC2基因.kanr基因和Shbler基因能够作为细菌和酵母菌的选择标记,因此较其他表达载体更易于筛选.2.3 信号肽序列可供毕赤酵母选择的信号肽有外源蛋白自身的收稿日期:2006205220作者简介:魏凡华(19802),男,宁夏隆德人,硕士研究生,主要从事微生物学与免疫学研究.信号肽和酵母本身的信号肽.有些蛋白的自身信号肽不能被毕赤酵母有效利用,可试用甲醇酵母信号肽.目前可供选择的酵母信号肽有α2交配因子的前导肽序列、酸性磷酸酶信号肽和蔗糖酶信号肽等.其中酿酒酵母α2交配因子前导肽序列的使用最为广泛.酶切割位点周围氨基酸序列及外源蛋白的3级结构可以影响信号肽的加工效率.Waterham 等也利用定向肽在巴斯德毕赤酵母中成功地将PG AP 启动下的β2半乳糖苷酶定向输送到过氧化物酶体[7].2.4 表达载体的种类Invit rogen 公司开发出了若干系列的表达载体可供选择.当前常用的巴斯德毕赤酵母表达载体可分为2类.①胞内表达载体.如p HIL 2D2,p AO815,p PIC3K ,PICZ ,p HWO10,p GA PZ.②分泌表达载体.如p HIL 2S1,p PIC9K ,p PICZα,p GA PZ α[8].目前主要采用酵母内源性的信号肽来引导外源基因表达产物的分泌,常用A2因子信号肽.许多蛋白的正确构像和翻译后加工(如糖基化等)都是在分泌途中完成的.3 基因整合证明表达载体构建正确后,转入巴斯德毕赤酵母中诱导表达.毕赤酵母转化方法最常用的是电转化法和原生质体法,其中电转化法最为方便,转化效率最高,最容易产生多拷贝整合.ZeocinR 抑制细胞壁的形成,因此PICZ 系列不能使用原生质体法进行转化.转化时,载体DNA 必须切成线状才能与染色体进行同源重组,将整个载体连同外源基因整入宿主染色体.通常有以下几种整合方式:①双位点互换.发生在染色体AOX1位点和表达质粒中的P AOX1及转录终止区,产生的表达菌的表型为His +Mut -[9].②AOX1单位点互换.发生在染色体和表达质粒的AOX1区.产生的表型是His +Mut +.③His 单位点置换.发生在染色体His 位点和表达质粒的His 位点,使得1个或多个表达单位插入在His 位点,产生的表型也是His +Mut +.巴斯德毕赤酵母载体在宿主染色体上大多为单拷贝整合,由于PAOX1的强启动性和整合后的稳定性,所以单拷贝也能获得较高的产量.4 重组蛋白翻译后修饰Pichi a p astoris 能进行与高等真核细胞相似的许多翻译后修饰,包括二硫键形成、信号序列加工、折叠、O 2连接和N 2连接糖基化等.巴斯德毕赤酵母对分泌的外源蛋白的糖基化已成为研究的热点.巴斯德毕赤酵母对外源目的蛋白的糖基化作用具有2个主要特征:①极少出现过度糖基化.一般情况下Pp 能产生较酿酒酵母明显要短的高甘露糖型寡糖链,且较均一,长度在8～14个之间,使产物更加稳定.②糖链中不含具有潜在致敏作用的α21,32甘露糖[10].然而,一些在天然分泌时不被糖基化的蛋白,由巴斯德毕赤酵母表达时却可能发生糖基化.如人体内合成的胰岛素样生长因子I 为非糖基化蛋白,而由巴斯德毕赤酵母表达时,却有15%发生了糖基化作用[11].不合适的糖基化和寡聚体可能会在机体内产生免疫反应或毒副作用,解决这一问题的可能方法主要是尝试胞内表达,利用基因工程改造糖基化位点[12],用糖苷酶进行处理,降低抗原性[13].5 影响外源基因表达的因素影响外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达的因素主要包括:外源基因自身的特性、表达框的拷贝数、染色体整合位点和方式、宿主菌的甲醇利用表型、基因剂量、分泌信号、产物稳定性、翻译后修饰以及培养条件等[14].5.1 外源基因自身的特性外源基因在P.p 中表达时,其自身就是影响表达水平的重要因素.许多高A +T 质量分数的基因常会由于提前终止而不能有效转录,不合适的mRNA 5′非翻译区的核苷酸序列和长度也可能会影响基因的正常表达.Sreekrishna 等通过调整人血清白蛋白的mRNA5′非翻译区与醇氧化酶的5′非翻译区相同后,HSA 的表达量可以提高50倍以上[15].赵翔等研究证明,Pichia pastoris 有密码子偏爱倾向[16].所以一般需要进行全基因合成,使编码序列符合毕赤酵母偏爱密码子用法和具有更高的G +C 质量分数.5.2 表达框染色体整合位点巴斯德毕赤酵母中的稳定高效表达主要通过整合性载体实现.整合性载体的表达盒稳定,可以多位点整合而获得多拷贝以及进行不同整合方式.AOX1和组氨酸脱氢酶(HIS4)基因位点都已被成功用于表达外源蛋白.Sreekrishna 等认为,由于表达框中his4染色体突变拷贝与完好的his4基因能够发生基因转换,所以首选aox 1位点作为整合位点.5.3 宿主菌的甲醇利用表型原则上,如果是胞内表达,应尽量用Mut -细胞,这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而蛋白纯化更易进行.现在无需甲醇诱导的组成性表达载体p GA PZ 和p GA PZα已经构建成功,它们常能生产比诱导型载体p PICZ 和p PICZα更高的外源96 第1期 魏凡华等:巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展蛋白.Doring等研究表明,在生产哺乳动物膜转运蛋白时,p GA P比pAOX1更理想.5.4 基因剂量一般来说,高拷贝整合可以提高表达量,但许多实例表明,含单拷贝表达框的宿主菌足以得到最佳产量.Jeffrey等发现,重组CD40L的最高产量是在有8个以上表达框的菌株中获得的[17].不过个别情况下拷贝数增加对产量也会产生负效应,原因可能在于过高表达会对分泌途径产生负反馈抑制.因此,高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准,基因剂量与表达水平的关系取决于特定的外源蛋白.Jeffrey等建立了一种双滤膜筛查方法,可以快速地从大量重组菌株中筛选出高表达克隆.5.5 分泌信号不适合的信号肽可导致信号肽加工不完全,或者蛋白分泌水平低,甚至不能分泌.尝试不同的信号肽,对信号肽进行突变改造或人工全合成信号肽等策略可用于实现信号肽正确加工和提高分泌水平[18].韦宇拓等利用菊粉酶的信号肽序列来构建巴斯德毕赤酵母分泌载体并表达了B2葡聚糖酶,结果表明ISP信号肽序列分泌效率不低于利用A因子信号肽的表达载体p P IC9K.Singh等通过定向缺失诱变导致了含有天然N端的成熟干扰素的正确释放,可以成为解决这一问题的一种好方法.5.6 发酵系统培养巴斯德毕赤酵母在发酵系统中外源基因的转录水平是过量甲醇诱导时的3～5倍.可有效监控p H、通气量和碳源浓度并及时排出代谢产物,控制维持产物稳定性的因素,可达到最优化发酵条件,使蛋白产量在标准以上水平.现在已建立了较成熟的补料分批培养制度和连续灌注培养方法.5.7 产物稳定性酵母细胞膜上有一种KEXO2样蛋白水解酶,能专一性水解α因子前体中羧基端的肽键.改变培养基的p H值,推荐范围为2.8～6.5,加入适量的酵母提取物和蛋白胨,都能够提高外源蛋白的稳定性,而某些酶抑制剂在增加其稳定性的同时会使一些原先并不明显的蛋白变得非常明显,影响其使用效果.另外,使用蛋白酶缺陷株如SMD1163, SMD1165或SMD1168亦可避免产物降解的发生.在另外一种情况下,如果基因工程产物会影响宿主菌生长代谢活性的话,也可能出现高度降解的情况.6 结束语巴斯德毕赤酵母(Pichi a p astoris)表达系统是近年发展起来的一种新型真核表达系统,具有发酵工艺成熟,易于工业化,培养成本低廉,又具有真核表达系统,可进行蛋白翻译后的修饰、加工和折叠等优点,而得到广泛应用,目前许多诊断用的抗原及治疗用的疫苗都有在P Pichi a p astoris中得到表达.巴斯德毕赤酵母表达系统具有极好的生产应用前景,其主要优势如下:①巴斯德毕赤酵母表达载体整合后具有高稳定性.②可进行胞外表达和胞内表达,胞外分泌表达更有利于蛋白纯化.③发酵培养适合进一步大规模生产.④表达蛋白的加工修饰适中.但巴斯德毕赤酵母的更广泛应用,还有待于对此体系进行进一步的研究和开发.参考文献:[1] CREGG J M,CEREGHINO J L,SHI J,et al.Re2combinant protein expression in Pichia pastoris:a re2view[J].Molecular Biotechnology,2000,16(1):23252.[2] CREGG J M,V EDV IC K T S,RASCH KE W C.Re2cent Advances in the expression of foreign genes inPichia pastoris[J].Teclmology,1993,11(8):9052910.[3] CREGG J M,MADDEN K R,BARRIN GER K J,etal.Functional characterization of the two alcoholoxi2dase genes f rom the yeast Pichia pastoris[J].MolCell Biol,1989,9:131621323.[4] VASSIL EVA A,GHU GH D A,SWAMINA T HANS,et al.Expression of hepatitis B surface antigen inthe methylotrophic yeast Pichia pastoris using theGAP promoter[J].J Biotechnol,2001,88:21235. 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巴斯德毕赤酵母表达系统及其分泌型蛋白表达的研究进展路蓉;安云庆
【期刊名称】《临床和实验医学杂志》
【年(卷),期】2004(003)001
【摘要】巴斯德毕赤酵母表达系统可使用强效的醇氧化酶1(AOX1)启动子,在甲醇诱导下实现外源基因的高效表达.外源基因整合入酵母的染色体基因组后,通过营养缺陷型基因或抗性基因进行阳性转化子的筛选.将外源基因阅读框架与信号肽相融合即可得到被修饰的分泌型外源目的蛋白.现已有多种方法可进一步提高外源目的蛋白的表达量.
【总页数】5页(P43-47)
【作者】路蓉;安云庆
【作者单位】首都医科大学免疫学系,北京,100054;首都医科大学免疫学系,北京,100054
【正文语种】中文
【中图分类】R9
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1.巴斯德毕赤酵母真核蛋白表达系统的研究进展 [J], 杨湘越;兰小鹏;孙树汉
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5.巴斯德毕赤酵母表达系统在动物传染病防制中应用的研究进展 [J], 孙静;孙惠玲;张培君
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提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展肖生科1,2 王磊2 陈毓荃1(1西北农林科技大学生命科学学院,杨凌 712100;2中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081)摘 要: 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统,与现有的其它表达系统相比,巴斯德毕赤酵母在表达产物的糖基化修饰、折叠、加工、外分泌及表达量等方面有明显的优势。
外源基因在该系统中表达时,由于受基因内部的结构、分泌信号、甲醇诱导的浓度及诱导时间、培养温度、启动子、表达环境的p H值等诸多因素的影响,一些外源蛋白的表达也存在着表达不够稳定、表达量较低,甚至不表达的情况。
对影响巴斯德毕赤酵母表达的各种可能因素进行了分析,结合具体实践经验,就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的问题进行了综述。
关键词: 巴斯德毕赤酵母 酵母表达系统 基因表达The Study on Improving Expression Levels of H eterologousG ene in Pichia pastorisXiao Shengke1,2 Wang Lei2 Chen Yuquan1(1College of L if e Sciences,Northwest Sci2Tech U niversity of A gricult ure and Forest ry,Yangli ng 712100;2Biotechnology Research Instit ute,Chi nese Academy of A gricult ural Sciences,Beiji ng 100081)Abstract: As a eukaryote expression system,Pichia pastoris has been widely used in genetic engineering,which has many merits in the gene expression,protein process and secretion.The gene expression is influenced by a number of factors,such as the structure of gene,secretion signal peptides,methanol concentration,induction phase,temperature, PH,and promoter etc.These factors make some heterologous genes express unstably or express a little.This article ana2 lyzes these factors and reviews how to im prove expression levels of heterologous genes in Pichia pastoris.K ey words: Pichia pastoris Y east expression system G ene expression 动物、植物、微生物作为生物反应器为外源基因的表达提供了理想的环境,是基因工程及生物制药研究和应用的重要内容,也是生命科学研究领域的热点之一[1]。
大肠杆菌被誉为是外源蛋白质表达的“工厂”,其具有易操作性,生长速度快,培养条件简单等优势。
但是,大肠杆菌是低等的原核生物,不具有真核生物中mRNA翻译后修饰、加工的场所———内质网和高尔基体。
虽然许多真核生物基因在大肠杆菌中可以表达,但有些表达的产物缺乏天然的生物活性或结构。
哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统虽然能够表达结构复杂的真核细胞蛋白,但操作复杂,表达水平低,产业化生产造价昂贵,不易普遍推广使用[2]。
酵母是单细胞低等真核生物,它既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性,同时又具有真核生物基因产物正确折叠所需的细胞内环境和糖链加工系统,还能分泌外源蛋白到培养液中,利于纯化[3]。
1 利用巴斯德毕赤酵母表达外源基因的优缺点酿酒酵母(S.cerevisiae)是首先被用来作为外源基因表达的宿主菌,然而其表达重组蛋白有一定的局限性,使其产业化应用受到了限制[1]。
出芽酵母(Kl uyverom yces lactis)表达外源基因时与酿酒酵母相似,但表达量偏低,也不利于推广应用和规模化生产。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是甲基营养型酵母,其乙醇氧化酶启动子(AOX)已被分离、克隆,这种酵母已经发展成为外源蛋白表达非常成功的宿主[4]。
人们已在巴斯德毕赤酵母中已成功表达了多种外源蛋白,如IGF21和人血清蛋白已通过临生物技术通报・综述与专论・ B IO TECHNOL O G Y BULL ETIN 2004年第2期床试验;乙肝表面抗原在南非已作为小单元疫苗投放市场[4];人重组白细胞介素11(rhL211)[5]、人血管内皮生长因子受体Flt2l胞外区223loop[6]、血管生成抑制因子(K4K5)[7]、抗Ⅳ型胶原酶单链抗体[8]等医药用蛋白均成功表达。
与其他表达系统相比,巴斯德毕赤酵母有以下诸多方面的优点:①在蛋白质诱导表达的过程中虽然以甲醇作为唯一的碳源,但不存在象细菌、动物细胞培养中的内毒残留问题[9]。
②在缺少葡萄糖的情况下,巴斯德毕赤酵母以甲醇作为唯一的碳源生长[10]。
表达实际上是利用甲醇诱导乙醇氧化酶启动子,从而启动乙醇氧化酶的表达,在有乙醇氧化酶存在的条件下进一步催化甲醇的代谢,进行重组蛋白质的表达。
③具有真核生物翻译后的糖基化修饰、折叠、加工和外分泌的环境,使生产的蛋白具有天然的高级结构及生物学活性。
④有两个基因编码乙醇氧化酶基因———A O X1、A O X2。
其中A O X1基因的表达主要受较高水平的甲醇诱导和调节。
巴斯德毕赤酵母既保持了酿酒酵母的优点,还能大幅度提高外源蛋白的产量[9]。
⑤许多在大肠杆菌中不能表达的蛋白质在巴斯德毕赤酵母中得到了有效的表达,其方便的操作和低廉的成本使毕赤酵母表达系统极具市场潜力。
⑥表达分泌的蛋白质常被O2糖基化或N2糖基化,其中主要是在蛋白质氨基酸序列的Asn2X2SerΠThr位点处进行N2糖基化,以高甘露糖型的糖基化形式存在,寡糖链的长度一般为8～14个甘露糖残基[9]。
与酿酒酵母相比较,巴斯德毕赤酵母在表达蛋白质过程中是适度的糖基化修饰,使所表达的外源蛋白结构与构象更接近于天然蛋白。
此外,如果是糖蛋白,还经高尔基复合体对糖链的进一步剪切,使表达蛋白的糖链不含α123甘露糖,避免了酿酒酵母中的免疫原性问题,使表达的糖蛋白更适于治疗用途[10]。
尽管巴斯德毕赤酵母在表达外源蛋白有以上优势,但是外源基因在表达过程中受基因内部的结构、分泌信号、甲醇诱导的浓度及诱导时间、培养温度、启动子、表达环境的p H值等诸多因素的影响,使外源蛋白的表达随环境条件的变化而不稳定,甚至一些蛋白的表达量会很低或不表达。
因此,通过对这些可能影响外源基因表达的各种因素进行系统的分析,得出提高外源蛋白表达量的可能途径就具有重要的理论和实践意义。
2 提高外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达量的途径2.1 优化基因内部结构外源基因在巴斯德毕赤酵母中能否表达或表达量高低首先受到外源基因的内部结构的影响,也是表达成败的首要因素。
可以通过以下几种途径优化基因内部结构以实现外源蛋白的表达。
①优化mRNA5′端非翻译区(5′U TR)的核苷酸序列和长度,mRNA的非翻译区对蛋白表达的影响主要表现在mRNA的翻译水平上。
A O X1mRNA的5′U TR 长114nt,富含A+U。
目的蛋白mRNA应尽可能具有与A O X1mRNA相近,最好是相同的5′U TR。
一般地,目的基因编码序列的第一个A TG应尽可能接近,最好处于A O X1A TG的位置[11]。
Sreekrishna等通过调整人血清白蛋白mRNA与AOX1mRNA的5′U TR相同后表达水平提高50倍以上[12]。
同时,一个适当长度的5′U TR可极大地促进mRNA有效地翻译。
②起始密码子旁侧序列改造:如果起始密码子周围容易形成RNA二级结构序列,将会阻止翻译的进行,通过RNA折叠分析可找到可能阻碍翻译正常起始的二级结构,然后利用替代密码子重新设计并调整翻译起始区及其旁侧序列,对基因进行改造[13]。
③A2T序列改造:目的基因的特性对表达的影响被认为是一种种属特异性的现象[14]。
有些基因内部富含A2T序列,可在转录的过程中提前终止而导致仅产生低水平或截短的mRNA[11],给基因的表达带来困难,因此在不改变翻译蛋白质密码子的条件下去掉A2T序列,除去mRNA中可能形成终止结构的区域,使目标蛋白得到表达。
④基因人工合成:在不改变氨基酸组成的前提下,将编码外源蛋白的密码子优化为酵母的偏爱密码子,可以实现外源蛋白在酵母体内表达或表达量的显著提高。
在酵母中表达量较高的基因往往是采用酵母本身所偏爱的密码子[15]。
在巴斯德毕赤酵母中表达植酸酶时,把在酵母中使用频率为0的精氨酸的密码子突变为使用频率较高的密码子时,表达水平提高了37倍[16]。
⑤氨基酸序列改造:蛋白质氨基酸序列中如果含有高度复杂的胱氨酸结42 生物技术通报Biotechnology Bulletin 2004年第2期构基序,这种结构可能是影响合成效率的因素之一,因此可改变这部分的碱基,消除复杂的胱氨酸结构基序[17]。
2.2 分泌信号的改造外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达分为胞外和胞内两种表达情况,表达的蛋白要分泌到胞外必须经过信号序列的引导[17]。
信号肽与目标蛋白相融合,从而在蛋白质加工折叠后引导其分泌到胞外。
最常用的信号肽是来源于酿酒酵母的A因子信号肽和巴斯德毕赤酵母酸性磷酸酶信号肽,其中以A 因子信号肽最为成功,也是使用最广泛的信号肽,它能促进多种异源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达[4]。
但有时在表达一些蛋白的过程中,A因子信号肽用就不能引导外源蛋白分泌或不能有效地分泌到胞外,而使胞外目标蛋白的浓度极低,给后面的分析和检测带来不便。
因此,改造信号序列,引导目标蛋白高效的胞外分泌也可提高目的蛋白的表达量。
信号肽对不同的异源蛋白分泌效率会有很大的差异,有些外源蛋白甚至不能被A因子和酸性磷酸酶信号肽分泌,需要新的信号肽才能使外源蛋白分泌[18]。
有些信号肽的分泌效率还受胞内mRNA的积累水平、培养条件和诱导条件的影响[19]。
在A因子中间插入EEAEAEAEP K共10个氨基酸的新信号肽序列可使胰岛素在毕赤酵母中的分泌效率提高2倍以上[10]。
