重组巴斯德毕赤酵母高密度培养中铵离子浓度的影响

毕赤酵母的培养巴斯德毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。

与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。

比赤酵母表达常用的培养基：1 LB培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠1% PH 7.0----------------大肠杆菌培养制作平板加入2%的琼脂粉，121摄氏度20分钟，可于室温保存。

用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / mL（博来霉素，抗菌素）宿主细胞His- -----------诱变造成的。

MD------------酵母转化筛选培养基（营养缺陷型His-）13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖用于表达的毕赤酵母都属于组氨酸缺陷型的只有染色体上成功整合入重组质粒载体基因的毕赤酵母菌株才能在组氨酸缺失的MD培养基生长，以此筛选出重组子。

MM--------------酵母转化进一步筛选培养基仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，成为基本培养基（minimal medium,MM），有时用符号“[ －]”来表示。

不同微生物的基本培养基是不相同的。

2 LLB 培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠0.5%PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。

121℃高压灭菌20min。

可于室温保存数月。

用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2 周.3 YPD培养基酵母粉1%，胰蛋白胨2%，葡萄糖2%，固体加2%的琼脂粉，YPD 培养基可常温保存,是毕赤酵母的最基本培养基，琼脂YPD 平板在4℃可保存几个月。

加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ 培养基，可以4℃条件下保存1～2 周。

4 BMGY培养基酵母粉1% 蛋白胨2%，磷酸钾缓冲溶液平PH 6 100mmol/L YNB（酵母氮源）1.34% 生物素（4×10 -5）%甘油1%，毕赤酵母诱导表达前培养基，YNB和Biotin过滤除菌。

毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展夏姗1,2，武福军2,3，赵洪亮2，薛冲2，刘志敏21.安徽大学生命科学学院，安徽合肥230039；2.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071；3.山西康宝生物制品股份有限公司，山西长治046000［摘要］近年来毕赤酵母已成为一种优越的异源蛋白表达系统。

而提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵已成为关键技术环节之一。

我们从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计，以及发酵工程过程控制等方面简要阐述毕赤酵母的高密度发酵，并提出了工程菌在高密度发酵过程中存在的问题。

［关键词］毕赤酵母工程菌；高密度发酵；培养基优化；发酵过程控制［中图分类号］Q78［文献标识码］A［文章编号］1009-0002（2013）01-0109-04Progess of Pichia pastoris Engineering Bacteria on High-Density Fer⁃mentationXIA Shan 1,2,WU Fu-Jun 2,3,ZHAO Hong-Liang 2,XUE Chong 2,LIU Zhi-Min 2*1.School of Life Science,Anhui Uniservity,Hefei 230039;2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;3.Shanxi Kangbao Biological Product Co.Ltd,Changzhi 046000;China*Corresponding author,E-mail:liuzhm@［Abstract ］Pichia pastoris has been utilized widely as an excellent heterologous gene expression system recently.High-density fermentation has been a key technique tache to improve the expression level of the protein of inter ⁃est.In this paper,we expounded the choose of engineering bacteria,designation and optimization of culture medi ⁃um,and control of fermentation course to increase P.pastoris on high-density fermentation.Moreover,the questionsexisting in industry high-density fermentation were put forward.［Key words ］Pichia pastoris ;high-density fermentation;optimization of culture medium;control of fermentationcourse综述doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2013.01.02620世纪80年代以来，随着生物技术药物在人类疾病治疗和预防中的广泛应用，大大加速了微生物细胞表达产品的产业化进程。

重组人血清白蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达摘要人血清白蛋白是一种在医学上应用广泛，需求量大的蛋白质药物。

而目前血浆提取生产的方式难以满足市场的要求，用基因工程方法生产人血清白蛋白无疑具有巨大的商业价值。

由于巴斯德毕赤酵母表达系统自身的许多优点，使得其在表达外源蛋白中具有十分大的优势。

本文的工作是用巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）构建并筛选分泌重组人血清白蛋白(rHSA)基因工程高产菌株，并对其发酵纯化条件进行初步研究。

在构建高产人血清白蛋白的基因工程菌时，采用了分泌型表达质粒pPIC9K构建成质粒pPIC9K-hsa。

构建的质粒经线性化后电转化整合进入毕赤酵母GS115染色体AOX1基因中，通过MD/MM平板筛选出his+Mut s型菌株。

在此基础上，用G418平板筛选出高拷贝表达子。

BMGY/BMMY摇瓶培养对不同的拷贝子进行筛选，发现随着拷贝子的增加表达量增加。

其中菌株GS115-rHSA-8表达量最高。

免疫印迹检测所表达的rHSA具有免疫原性。

采用工业基础盐培养基，用摇瓶对发酵条件进行了实验研究。

结果表明，组氨酸的加入量为0.15g/L时，蛋白表达量增加57.1%；加入0.10%体积比油酸时，蛋白量可增加43.4%；甲醇浓度控制在0.5％体积比左右时可以获得高产量，甲醇的加量超过1%体积比时，会对蛋白的分泌表达产生抑制，在2%时已经比较明显；甲醇诱导时添加甘油时可以提高产量，但当甘油添加量达到0.2%体积比时甘油已产生抑制表达作用；诱导表达时硫酸铵浓度为7g/L时蛋白浓度最高，高于9g/L时已开始出现抑制表达作用；改变培养时发酵液的pH为7.0，诱导表达时添加 1.5%的YP(Yeast extract,5g/L; Peptone, 10g/L)均可以有效的控制rHSA的降解，而温度对蛋白的降解没有显著性影响。

另外，添加100μm的PMSF也对降解有较好的控制作用，但因为毒性原因其安全性值得评价。

毕赤酵母蚓激酶重组体的高密度发酵与活性摘要一种用于重组蚓激酶（rPI239）的表达系统在巴斯德毕赤酵母的发展。

通过1L高密度发酵肉汤制得0.174g上清蛋白。

rPI239体外表现出纤溶活性。

在体内rPI239的活性是通过凝血酶原时间，高岭土部分凝血酶时间，凝血酶时间和纤溶活性测定。

这项工作显示通过巴斯德毕赤酵母和高密度发酵得到的rPI239重组蛋白在体内和体外都具有相似纤溶活性。

关键词蚓激酶；纤维蛋白溶解；毕赤酵母；发酵；活性传统中医学已经长期使用蚯蚓作为药物，因为它们的抗发热和利尿特性。

最近研究表明，在蚯蚓干燥粉末含有纤溶酶组分。

研究人员在日本，韩国和中国已经分离和研究蚯蚓中获得的蚓激酶。

目前的数据显示，在地龙F-Ⅲ-1和F-Ⅲ-2发现的6种同工酶。

1986年，Wu等人，从蚯蚓中分离出的一组蚓激酶组件并且证实他们有激活纤溶酶原的纤溶活性和降解纤维蛋白，而EFE-II证实是纤溶活性蚓激酶的基因。

该作者通过用I125标记患有肺血管阻塞症兔子血管中的内栓子并且显示口服药物EFE-II后有明显纤溶活性。

同工酶（PDBank1IJ7）通过晶体结构分析MIR（多同晶置换）表明它是一个特效弹性蛋白酶S1反应区，表现广泛的底物活性。

最近的研究已经表明蚓激酶是有潜力的溶栓药。

1999年，Sun等人，从地龙中单独分离出蚓激酶PI239，在纤维蛋白板上发现明显纤溶活性。

它的cDNA文库与F-Ⅲ-1/2和EFE-II有89.5％同源性。

该PI239蛋白与那些的的t-PA和u-PA具有相同的活性和底物位点。

在2001年，Manabu 和 Nobuyoshi通过蚓激酶FIII-2在巴斯德毕赤酵母首次表达。

随后的研究已经证明许多种类的重组蚓激酶可以在酵母和大肠杆菌中表达。

近年来，蚓激酶已经在山羊奶表达。

尽管一些报道表明，在制得有效的重组蛋白过程中，资料非常少，，表达条件（特别是高密度发酵条件）也很苛刻，但是在这项研究中，还是完成了一套完整实验过程关于蚓激酶的筛选，表达和在酵母菌中发酵。

中国生物工程杂志　China B i otechnol ogy,2009,29(5):120～125毕赤酵母高密度发酵工艺的研究林俊涵3(福建生物工程职业技术学院　福州　350002)摘要　高密度发酵是毕赤酵母提高蛋白表达量的一种重要策略,发酵工艺是高密度发酵的一个重要因素。

采用下列措施均可以有效地提高表达水平:调节基础培养基,采用变pH 和变温发酵,提高DO ,选择最适的诱导前菌体密度和比生长速率并降低甘油初始浓度和采用分段式指数流加进行调控。

选择合适的甲醇补料策略:甲醇限制补料(MLF B )、氧气限制补料(OLF B )、甲醇不限制补料(MNLF B )和温度限制补料(T LF B )。

采用两种方式调控补料:诱导阶段菌体生长时,甲醇比消耗速率(q M eOH )为0.02-0.03gg -1h -1,而菌体不生长时,q M eOH 采用较高值。

关键词　毕赤酵母　高密度发酵　发酵工艺中图分类号　Q815收稿日期:2008209216 修回日期:20082102173电子信箱:ljh047@ 巴斯德毕赤酵母(P ichia pastoris )是一种能高效表达外源蛋白的表达系统,具有遗传稳定、表达水平高、蛋白可翻译后加工、产物可分泌、可高密度发酵等许多优点[1],应用十分广泛,已有数百种外源蛋白在该系统中获得表达。

高密度发酵是基因工程菌提高外源蛋白表达水平的一种重要策略,迄今,已有许多蛋白通过高密度发酵获得高表达量,如巴西三叶胶腈水解酶的表达量高达22g/L[2],植酸酶表达量达12.2g/L[3],S AM 表达量达11.63g/L[4],1,321,42β2D 2葡聚糖酶表达量达3g/L[5]等。

但是,不同外源蛋白的表达水平相差很大,引起这种差异的重要因素有二:一是重组菌本身特性,如基因本身特性、基因拷贝数、密码子使用频率等,二是发酵工艺。

目前,针对甲醇毕赤酵母高密度发酵,业界已建立起较为成熟的补料分批发酵和连续发酵两种方式,主要针对补料分批发酵工艺的影响和调控进行阐述。

酵母工程菌细胞高密度发酵的研究进展用分子生物学技术将编码外源蛋白或多肽的基因引入酵母菌，构建重组酵母工程菌表达抗原或细胞因子等，用于制备相应的生物制品，是研究开发新生物制品的重要趋势之一。

20世纪80年代，默克和史克公司用重组酿酒酵母菌（Saccharomyces cere －visiae ）表达的乙型肝炎表面抗原（HBsAg ）制备乙型肝炎疫苗，是最早用重组酵母制备生物制品的成功范例。

现已用重组酵母工程菌制备乙型肝炎疫苗、HPV 疫苗、人血清白蛋白（HSA ）和细胞因子；近年来，用重组酵母工程菌，特别是甲醇营养型酵母工程菌高效表达外源蛋白或多肽已成为相关研究的热点之一。

用甲醇营养型酵母，主要是汉逊酵母（Hanse-nula polymorpha ）和毕赤酵母（Pichia postoris ）已实现了HBsAg 、HPV -VLP 、戊型肝炎病毒（HEV ）ORF2、sHSA 、水蛭素及多种细胞因子等的高表达。

由于装备技术与成本的限制及生物制品生产中对制品批次质量控制要求的综合考虑等，用于酵母工程菌培养的生产发酵罐容积一般小于1000L （葛兰素维康制备乙型肝炎疫苗的发酵罐容积为1500L ）。

在保持外源蛋白或多肽表达水平不降低的前提下，在容积有限的发酵罐中实现酵母工程菌的高密度发酵，是维持制品生产规模和控制成本的重要技术途径。

影响酵母细胞高密度发酵的主要因素有工程菌本身的生物学特性和发酵工艺特点、培养基种类与配方、发酵罐的结构和性能、发酵过程各项重要工艺参数或变量的控制等。

重要工艺参数或变量包括溶氧、pH 值、温度、培养基营养成分补料、压力、搅拌转速、通气流量、CO 2、有害代谢产物积累和发酵液流变学性质等。

培养基中甲醇含量、其消耗与补充流量的控制，是影响甲醇营养型酵母工程菌培养后期去阻遏和表达外源蛋白或多肽的表达效率的关键因素。

在确保工程菌表达产率不变和表达产物性质稳定的前提下，将众多因素及其相互影响整合优化为一项发酵工艺，实现酵母工程菌细胞的高密度发酵，是一项复杂的、综合性很强的研发工作；在实现酵母工程菌高密度发酵的同时，提高表达产物的产率和活性则更具挑战性，国内外学者及企业为实现上述目标进行了大量研究。

专利名称：重组毕赤酵母的高密度发酵工艺
专利类型：发明专利
发明人：才学鹏,侯俊玲,王颖,骆学农,丁军涛,张少华,郑亚东,赵松波
申请号：CN200810212868.2
申请日：20080908
公开号：CN101348820A
公开日：
20090121
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开一种重组毕赤酵母高密度发酵工艺，特别是采用全自动控制发酵罐进行发酵的工艺。

本发明的工艺方法是将工作种子接种于BSM培养基中，培养温度为28℃，并进行搅拌，加氨水或磷酸控制发酵体系的pH值为4.8，罐压为0.8个大气压，当发酵罐中的甘油耗尽后一次缓慢加入甘油溶液280ml，待甘油再次彻底耗尽后，分五次缓慢加入每升含PTM12ml的甲醇溶液进行甲醇诱导，诱导72小时后结束发酵。

申请人：中国农业科学院兰州兽医研究所
地址：730046 甘肃省兰州市城关区盐场路徐家坪1号
国籍：CN
代理机构：兰州振华专利代理有限责任公司
代理人：张晋
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毕赤酵母菌分泌表达重组抑肽酶的高密度发酵工艺研究刘振云;沈露;解凤立;谭树华【期刊名称】《东南大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(30)5【摘要】目的:对毕赤酵母高密度表达重组抑肽酶的发酵工艺进行探讨.方法:先通过摇瓶培养方法,确定表达抑肽酶的毕赤酵母在BSM培养基中生长所需的最佳配方.在此基础上,采用分批补料培养方法,对毕赤酵母pSA/GS115进行高密度发酵.紫外吸收法测定重组抑肽酶竞争性抑制胰蛋白酶对底物BAEE的水解活性.结果:BSM培养基中毕赤酵母生长必需的最佳配方为甘油40 g·L-1、氨水单次补加量0.1%、甲醇流加量1%.经过毕赤酵母高密度发酵,发酵液上清中蛋白的表达量为37.08 mg·L-1,目的蛋白活性达到4 450 BAEEU·ml-1,比摇瓶培养表达提高了8倍.结论:本发酵工艺可实现酵母工程菌的高密度表达发酵,其发酵产物具有较高的生物活性,为下一步大规模化制备抑肽酶奠定了基础.%Objective: To evaluate the fermentation process of high-density expressed recombinant aprotinin by Pichia pastoris. Methods: The most optimal formulation of BSM medium for Pichia pastoris to grow using flask culture methods were determined. Based on the study of fermentation in shake flask, the optimal conditions were used for scaling up in 7 L fermentor. Engineering bacteria pSA/GS115 was fermented in fed-batch high density fermentation. The biological activity was determined by ultraviolet absorption assay, and the recombinant aprotinin competitively inhibited the hydrolytic activity of trypsin against substrate BAEE. Results: The best technological parametersof fermentation to BSM medium were glycerol 40 g·L-1, ammonia water 0. 1％ , methanol 1％.Afterbeing optimized, the yield of protein could reach up to 37. 08 mg·ml -1 . The biological activity determined was 4 450 BAEEU·ml-1, 8 folds higher compared to that of shaking flask. Conclusion: The engineering bacteria is successfully fermented in fed-batch high-density fermentation and fermentation produce has a high biological activity, which established a foundation for the large-scale production of aprotinin.【总页数】5页(P744-748)【作者】刘振云;沈露;解凤立;谭树华【作者单位】中国药科大学生命科学与技术学院,分子生物学教研室,江苏,南京,210009;中国药科大学生命科学与技术学院,分子生物学教研室,江苏,南京,210009;中国药科大学,药物分析教研室,江苏,南京,21009;中国药科大学生命科学与技术学院,分子生物学教研室,江苏,南京,210009【正文语种】中文【中图分类】TQ920.6;TQ925.9【相关文献】1.重组毕赤酵母胸腺肽α1-人血清白蛋白基因工程菌高密度发酵及分离纯化 [J], 马娇颖;章成昌;仇黎鹏;姜玉涛;闫璐颖;陈菁;陈建华2.猪IFNα在毕赤酵母中分泌表达条件的优化及高密度发酵 [J], 蓝胜芝;于瑞嵩;俞明月;董世娟;曹祥荣;李震3.重组人胰腺α-淀粉酶在毕赤酵母菌中的分泌性表达 [J], 王天成;徐国宾;夏铁安4.重组牛乳铁蛋白功能片段在毕赤酵母中的表达及高密度发酵 [J], 魏春;任郑;吴涛;钱晓芬;孙杰;汪钊5.产鸡α干扰素的毕赤酵母菌高密度发酵工艺研究 [J], 曹丁; 李学优; 肖宏艳; 昝继清因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

毕赤酵母高密度发酵产β-甘露聚糖酶的工艺优化张晓龙;肖静;王瑞明【摘要】以表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌为研究对象,采用摇瓶发酵确定碳源、接种量、温度、pH基础条件,通过30 L发酵罐高密度发酵,探究菌体浓度、甲醇浓度、甲醇补料方式、溶氧量等条件对目的蛋白产量的影响,并通过正交试验优化发酵工艺条件.结果表明,最佳产酶条件为接种量10％,初始葡萄糖质量浓度30g/L,诱导温度28℃,pH 5.0,溶氧量10％～20％.在此发酵条件下,最终细胞干重135 g/L,目的蛋白表达量5.04 g/L,最高酶活力29 600 U/mL,较优化前提高24倍,已满足工业化要求.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2015(054)023【总页数】6页(P5978-5983)【关键词】β-甘露聚糖酶;巴斯德毕赤酵母;高密度培养;发酵优化【作者】张晓龙;肖静;王瑞明【作者单位】齐鲁工业大学生物工程学院/山东省微生物重点实验室,济南250353;齐鲁工业大学生物工程学院/山东省微生物重点实验室,济南250353;齐鲁工业大学生物工程学院/山东省微生物重点实验室,济南250353【正文语种】中文【中图分类】Q815β－甘露聚糖酶（β－1，4－D－mannan mannohydrolase，EC 3.2.1.78）是β－1，4 甘露聚糖甘露糖苷水解酶的简称，属于半纤维素酶类，广泛应用于食品、饲料、医药、纺织印染等方面［1］，在饲用酶制剂应用方面尤其重要［2］，添加β－甘露聚糖酶可以降解饲料中含有的β－甘露聚糖，有助于消除甘露聚糖对机体胰岛素分泌和胰岛素样生长因子（IGF）生成的抑制作用，提高葡萄糖吸收速率，促进碳水化合物代谢过程，提高日粮能量利用率，是一种良好的饲料添加剂，也是抗生素的理想代替品［3］。

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统既具有原核表达系统易于培养、繁殖快速、表达量高的优点，又具有真核表达系统外源蛋白翻译后再加工修饰等特点，目前已有超过500种外源蛋白在毕赤酵母中获得成功表达。