淀粉酶米氏常数的测定

淀粉酶活性的测定一、原理淀粉酶（amylase）包括几种催化特点不同的成员，其中α－淀粉酶随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶；β－淀粉酶每次从淀粉的非还端切下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶；葡萄糖淀粉酶则从淀粉的非还原端每次切下一个葡萄糖。

淀粉酶产生的这些还原糖能使3，5－二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3－氨基－5－硝基水杨酸。

淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。

可以用麦芽糖制作标准曲线，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。

几乎所有植物中都存在有淀粉酶，特别是萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强，主要是α－和β－淀粉酶。

Α－淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；而β－淀粉酶不耐热，在70℃15min则被钝化。

根据它们的这种特性，在测定时钝化其中之一，就可测出另一个的活力。

本实验采用加热钝化β－淀粉酶测出α－淀粉酶的活力，再与非钝化条件下测定的总活力（α＋β）比较，求出β－淀粉酶的活力。

二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：萌发的小麦种子（芽长约1cm）。

（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 离心机；3. 恒温水浴（37℃，70℃，100℃）；4.具塞刻度试管；5. 刻度吸管；6. 容量瓶。

（三）试剂（均为分析纯）：1. 标准麦芽糖溶液（1mg/ml）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100ml；2. 3，5－二硝基水杨酸试剂：精确称取1g3，5－二硝基水杨酸，溶于20ml2mol/L NaOH溶液中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml。

盖紧瓶塞，勿使CO2进入。

若溶液混浊可过滤后使用；3.01mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7.H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（0.1mol/L 柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7.2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。

一、实验目的1. 掌握淀粉酶活性测定的原理和方法；2. 了解淀粉酶在生物体内的作用及其影响因素；3. 通过实验验证不同条件下淀粉酶活性的变化。

二、实验原理淀粉酶是一种能够水解淀粉的酶，主要分为α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。

本实验采用α-淀粉酶作为研究对象，通过测定其在特定条件下催化淀粉水解的速率，来评价淀粉酶的活性。

实验原理如下：1. 淀粉酶能够将淀粉水解成葡萄糖，反应式如下：淀粉 + 水酶→ 葡萄糖2. 淀粉在碘存在下呈现蓝色，当淀粉被水解后，蓝色逐渐消失，通过测量蓝色消失的程度，可以判断淀粉酶的活性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：淀粉酶、淀粉、碘液、蒸馏水、pH缓冲液、比色皿等；2. 实验仪器：恒温水浴锅、移液器、比色计、天平等。

四、实验步骤1. 准备淀粉酶溶液：将淀粉酶用pH缓冲液稀释至一定浓度；2. 准备淀粉溶液：将淀粉用蒸馏水配制成一定浓度的溶液；3. 配制碘液：将碘液用蒸馏水稀释至一定浓度；4. 设置实验组：将淀粉溶液和淀粉酶溶液按照一定比例混合，置于恒温水浴锅中，在一定温度下反应；5. 设置对照组：将淀粉溶液和蒸馏水按照一定比例混合，置于恒温水浴锅中，在一定温度下反应；6. 取样：在反应一定时间后，取出实验组和对照组的溶液，加入碘液；7. 比色：将实验组和对照组的溶液在比色计上测定吸光度；8. 计算淀粉酶活性：根据实验组和对照组的吸光度差值，计算淀粉酶活性。

五、实验结果与分析1. 实验结果：实验组吸光度：A1对照组吸光度：A22. 结果分析：根据实验结果，计算淀粉酶活性：淀粉酶活性 = (A1 - A2) / A2淀粉酶活性越高，表示淀粉酶的催化能力越强。

六、实验讨论与心得1. 实验过程中，需要注意温度、pH值等因素对淀粉酶活性的影响，以保证实验结果的准确性；2. 实验结果表明，淀粉酶活性受到多种因素的影响，如温度、pH值、底物浓度等；3. 通过本实验，加深了对淀粉酶活性的理解，为后续研究提供了实验基础。

淀粉酶(AMS)测定试剂盒说明书(碘-淀粉比色法)一、 原理：淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物浓度已知并且过量的情况下，家人碘液与未水解的淀粉结合生成蓝色复合物，根据蓝色的深浅可推算出水解的淀粉量，从而计算出AMS 的活力。

二、 试剂组成与配制：（100T ）1、0.4mg/ml 底物缓冲液：60ml ×1瓶，4℃冰箱保存6个月。

2、0.1mol/L 碘贮备液：7ml ×1瓶，4℃避光保存6个月。

0.01mol/L 碘应用液的配制：将碘贮备液：蒸馏水=1:9稀释，现用现配4℃避光保存。

三、 操作表： 测定管（u 管） 空白管（0管）底物缓冲液（ml ）37℃预温5分钟0.5 0.5 待测样本（ml ） 0.1混匀，37℃水浴，准确反应7.5分钟 碘应用液（ml ） 0.5 0.5蒸馏水（ml ）3.0 3.1 混匀，660nm 波长，1cm 光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。

*注：不同样本批量测试前需要做预实验，确定最佳取样浓度，将 （空白OD-测定OD 控制在0.05～0.150之间） 四、 计算：1、 单位定义：100ml 血清（浆）中的AMS ，在37℃与底物作用30分钟，水解10mg 淀粉为1个单位。

2、公式：样本测试前稀释倍数空白管吸光度测定管吸光度空白管吸光度样本测试前稀释倍数分钟分钟空白管吸光度测定管吸光度空白管吸光度⨯⨯-=⨯⨯⨯⨯⨯-=801.01005.730105.04.0dl AMSu（此公式适用于测定血清中淀粉酶）血清淀粉酶的含量测定一、实验准备：1、实验器材：移液枪（100~1000ul、10~100ul、1000~5000ul、2~20ul）、5mlEP管、0.5mlEP管、比色皿、100ml烧杯、漩涡仪、水浴箱，分光光度计、计时器。

2、实验药品：NaCl、蒸馏水、0.4mg/ml底物缓冲液、0.1mol/L碘贮备液。

二、实验步骤：1、0.01mol/L碘应用液的配制：将碘贮备液：蒸馏水=1:9稀释，现用现配4℃避光保存。

淀粉酶活力的测定方法淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。

不同来源的淀粉酶，性质有所不同。

植物中最重要的淀粉酶是α -淀粉酶和β-淀粉酶。

α -淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α -1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。

Ca 2+能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH 3.6 以下可使其钝化。

β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α -1,6键时停止。

单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。

β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca 2+ 及Cl —等辅助因子，最适pH偏酸，与α -淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，60 ℃保温15min 可使其钝化。

通常提取液中α -淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。

可以先测定（α + β）淀粉酶总活力，然后在60 ℃加热15 min ，钝化β-淀粉酶，测出α -淀粉酶活力，用总活力减去α - 淀粉酶活力，就可求出β- 淀粉酶活力。

淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5- 二硝基水杨酸的显色反应来测定。

还原糖作用于黄色的3,5- 二硝基水杨酸生成棕红色的3- 氨基-5- 硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。

以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。

1 酶活测定方法（1）标准曲线的制作(见下表)①取7支20 ml具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥,编号,按表加入试剂。

②摇匀,至沸水浴中煮沸5 min。

取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20 ml,以1号管作为空白调零点,在520 nm的波长下比色测定吸光度值。

并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。

表1 标准麦芽糖溶液成分表及OD测定值试剂 1 2 3 4 5 6 7 麦芽糖标准液（mL）0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 H2O（mL） 2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 0 3,5-二硝基水杨酸（mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 麦芽糖含量（mg）0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 OD520(2)粗酶液淀粉酶活力测定①待测粗酶液的制备：发酵24 h后发酵液4000 r/ min离心10 min,去除菌体，在上清液中加入65％饱和度的硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于4℃盐析2h，然后5000r/min离心20min，得到初步纯化的淀粉酶。