凝胶过滤层析脱盐共52页

目前使用较多的是葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶，其商品为生物凝胶-P（Bio-Gel P）组成单位是丙烯酰胺（CH2=CH-CONH2）与 甲叉双丙稀酰胺，共聚交联成聚丙烯酰胺。 优点：全惰性的，适宜作为凝胶层析的载体。 缺点：不耐酸，遇酸时酰胺键会水解成羧基，使凝 胶带有一定的离子交换基团，一般只在pH为11范 围内使用。 交联葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex）。 优点：具有良好的化学稳定性等优点。目前最常用。
原理
● 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每 个颗粒犹如一个筛子。 ● 当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子 质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙， 随着溶剂流动，首先流出层析柱； ● 相对分子质量较小的物质可自由地进出 凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率 慢而最后流出层析柱。 ● 中等大小的分子在大分子物质与小分子 物质之间被洗脱。 ● 这样，经过层析柱，混合物中的各物质 按其分子大小不同而被分离。
3、样品的加入 吸取1ml血红蛋白——核黄素混合液，加到凝胶床的表面上， 不要沿柱壁加样品，注意加样时勿将床冲起。 打开出口管，用少量水流一下，接触过样品的管壁，再加水扩 展洗脱，用试管将洗脱液。 4、洗脱： 加0.1mol/l的Nacl溶液洗脱，流速为每分钟1ml,两分钟收一 管。 5、比色测定：波长，红色部分520nm,黄色部分450nm 绘制洗脱曲线： 以光密度为纵座标，以时间为横座标，并标明洗脱峰的名称 。 6、凝胶的回收。

特点：与被分离物质分子的 大小和凝胶颗粒孔隙的大小 有关
Kd=0
大分子量 小分子量
Hale Waihona Puke 0＜Kd<1 Kd=1
洗脱体积
应用
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、 多糖、核酸类等物质。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可 以完全将它们分开。 利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、 去热源和脱色。

Kav 细胞色素c 牛血清蛋白 球蛋白 lg M
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第四节 应用
一、脱盐和浓缩：小网孔的干凝胶可以吸水， 使用它会使高分子溶液得到浓缩。 二、分离生物大分子：根据分子量大小不同 进行分离。适用于理化性质相似（溶解度、 带电性质等） 三、去热源物质 热源物质 是一种糖蛋白。 在制备水解蛋白、核苷酸、酶等注射剂时， 常用凝胶过滤去热源物质。
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四、测定分子量： 蛋白质分子量的对数（lg M）与Kav呈线 性关系，可以利用已知分子量的标准蛋白在同 样条件下做凝胶过滤，划出标准曲线。由曲线 则可得到未知蛋白的分子量。
从天然琼脂中得来的天然物。 单体： D-半乳糖和3，6脱水的L-半乳糖联结而成。
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• 1、结构： Sepharose为束状琼脂糖以氢 键交联成的立体网状颗粒。按其浓度分为 Sepharose2B（2%）、 Sepharose4B （4%）、 Sepharose6B（6%） • 交联琼脂糖（ Sepharose CL)，为琼脂糖 与1，3-二溴异丙醇交联成的， Sepharose CL-2B、 Sepharose CL-4B、 Sepharose CL-6B孔结构不变，对热的稳定性有所提 高。
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第三节 操作
处理→装柱→加样 →洗脱→再生
一.凝胶的选择与处理 1. 型号选择：使分离物的分子量包含在其分离范围内。 2. 颗粒大小的选择：一般用中粒100-200目。 颗粒小，分离效果好，但流速慢； 颗粒大，流速大，但分离效果差。 3. 凝胶用量的计算： g=Vt/膨胀度 4. 凝胶处理： 溶胀——充分溶胀才可使用。 抽气——将凝胶网孔中的气泡排除。
一.葡聚糖凝胶（商品名： Sephadex）
1.结构：以葡聚糖为骨架，以3-氯-1，2-环氧丙烷为交联剂， 结构：

实验步骤
1 溶胀凝胶：用去离子水浸泡Sephadex G-25凝胶24h以
上或用去离子水沸水浴溶胀约2h。 2 凝胶装柱：将溶胀的凝胶轻缓倒入柱中，使其自然沉 降，沉降后凝胶柱的高度为柱高的3/4~4/5切柱床面平整， 床面维持0.5cm高的洗脱液。 3 洗柱：除杂，一般洗脱液体积为柱床体积的2~3倍。 4 加样洗脱：取0.5mL的样品，取样器尖头沿管壁伸到床 面之上，慢慢将样品加到凝胶床面上。拧松夹子，待样 品全部进入凝胶柱中，接通洗脱液，开始洗脱并收集洗 脱液。
2 加入样品时应注意不要搅动床面，使样品与床 面的洗拖脱液混合，影响分离效果。
5 收集检测：用1.5mL离心管收集洗脱液，每管 收集1mL。边收集边进行蛋白质与铵盐的检测。 取洗脱液2滴置于小试管中，加入磺柳酸1滴，
如有蛋白质洗脱下来，则有白色混浊或沉淀 出现。取洗脱液2滴加入白瓷板中，加入纳氏 试剂1滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉 淀。
注意事项
1 装柱时，凝胶中的水不宜过多，用玻棒搅动小 烧杯中的凝胶，轻缓倒入柱中，凝胶的高度 应是层析柱高度的3/4~4/5。如层析柱中凝胶 高度不够，应在凝胶床面未形成之前再加入 葡聚糖凝胶，要尽量防止由于加胶次数较多， 致使胶中出现节痕。同时，要避免柱床内产 生气泡。
凝胶过滤法使蛋白质脱盐
实验目的
学习凝胶过滤法分离纯化物质的原理与操 作技术。
实验原理
葡聚糖凝胶（Sephadex G-25）具有网状结 构，小分子物质能进入其内部，而大分 子物质却被排阻在外部，当一混合溶液 通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质 就按不同相对分子量被分开。
葡聚糖凝胶是葡萄糖通过α-1，6-糖苷键形成的葡聚糖长 链，与交联剂环氧氯丙烷以醚键相互交联而成的具有 三维结构的多孔网状结构物。

凝胶过滤层析技术原理讲解凝胶过滤层析技术原理讲解(附动画)原创作者;gfzhang凝胶过滤层析(Gel Filtration Chromatography，GFC)又称尺寸排阻层析(Size Exclusion Chromatography，SEC)凝胶渗透层析(Gel Permeation Chromatography，GPC)分子筛层析(Molecular Sieve Chromatography，MSC)注:在高效液相色谱分析中，用GFC或SEC表示凝胶过滤色谱或尺寸排阻色谱，流动相通常是水溶液;在有机高分子分析中，常用GPC表示凝胶渗透色谱，流动相通常是有机溶剂;在蛋白质分离纯化中用GFC或SEC表示凝胶过滤层析或尺寸排阻层析;本文以下内容均针对蛋白质分离，因此均以凝胶过滤层析(GFC)表示。

(1)分离机理GFC填料是由高分子交联而成、内部具有网状筛孔的固体颗粒，利用球状凝胶内的筛孔的大小，不同水力学半径的分子在通过填料时运行路径存在差异，利用该差异将不同大小的蛋白质进行分离。

蛋白质分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，因此总体运行路径较短，从层析柱入口到出口所需时间较短;较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，总体运行路径较长，故在管柱内的停留时间较长;基于此原理可以区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而确定未知样品的分子量。

注1:球形蛋白与线性分子在凝胶过滤层析中的保留行为存在差异，因此使用球形蛋白制作的分子量标准曲线不能用于明胶多肽、淀粉或其它聚合物。

(2)应用范围A蛋白质分离，基于混合中不同蛋白质分子尺寸大小进行分离;B分子量测定，蛋白质分子量(球形)的对数与其在凝胶过滤层析时的保留时间呈线性关系; C样品脱盐或溶剂置换。

(3)填料要求一般状况下，用于制备凝胶过滤层析的填料应不吸附目标成份，所有欲分离物质均被洗脱出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。