凝胶过滤层析脱盐

凝胶层析法(凝胶过滤)脱盐和分离蛋白质-1原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。

脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。

前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。

所以，要根据具体情况选择使用。

凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。

凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatograph y）、分子筛过滤（molecularsieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。

它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。

其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。

凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。

网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。

人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。

凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。

分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。

这样被分离物质即被按分子的大小分开。

用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio–gel）及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。

实验五蛋白质脱盐——凝胶过滤法【实验目的】了解凝胶过滤层析技术的工作原理，掌握凝胶过滤层析技术，获得脱盐后的目的蛋白质溶液【实验原理】目的蛋白质用盐析法从细胞裂解中沉淀分离后，其中尚有大量的硫酸铵，需要脱盐才能获得较纯的样品。

常用的脱盐方法有透析法、电透析法和凝胶过滤法。

透析法及电透析法耗时长，样品稀释度大，不易放大进行大规模生产，所以工业生产中应用较少。

凝胶过滤层析脱盐过程中盐分子和蛋白质分子大小差异巨大，蛋白质溶液中小分子的盐分子随着层析流动相进入孔径较小的固定相致辞使其在层析中的迁移速率小，而蛋白质因分子尺寸较大，不能随流动相进入固定相中，因此在层析柱中的迁移速率大，首先从层析术中流出，实现脱盐。

用凝胶过滤法脱盐时，为了使盐同蛋白质充分地分离，除了应选用足够长的层析柱之外，还应对样品的体积加以限制。

样品的体积如果过大就导致蛋白质带同盐带不能分开。

一般来就，样品体积不超过床体积的30%。

这一数据的确定是根据盐和蛋白质的分离体积（Vsep）决定的。

两种物质分离体积的定义为，当两种物质的混合物在凝胶过滤层析柱上能够完全分离时的最小体积（参看图一）。

它在数值上等于：Vsep=V eB-V eAC1/2 V由于种种原因（例如样品在柱中的微小振动、固定相和流动相之间的不平衡，样品在柱中发生的纵向扩散等），产生的洗脱峰总是比理论值要宽得多。

如果上柱用的样品体积等于Vsep时，由于上述原因，两种物质的洗脱曲线会重叠造成分离失败（如图二所示），因此，上样体积应Vsep，但是上样体积过小会造成样品过度稀释。

为了提高脱盐样品的得率，上样体积一般15-20%床体积。

一般脱盐层析柱，应为粗短型柱，以提高脱的工作效率。

用凝胶过滤层析技术对白质溶液进行脱盐处理时，样品的浓度对分离效果，没有影响，但是，如果样品浓度过大，就会造成样品粘度增大，引起层析带和洗脱速率不稳定，造成洗脱曲线变宽和扭曲。

在选用洗脱液时，应考虑蛋白质的稳定性和蛋白质同层析介质之间的非特异性吸附作用，所以一般选用离子强度大于0.02的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液，如果脱盐后的蛋白质溶液要进行冷冻干燥处理时，应选用可以挥发的缓冲物质制备洗脱液，例如，乙酸铵、碳酸氢铵、乙酸乙烯二胺盐等。

凝胶过滤层析的基本操作①凝胶介质的选择根据待分离蛋白质的分子量选择具有相应分离范围的凝胶。

对于未知蛋白，应选用分离范围较宽的凝胶，如用Sephacryl S-300。

对于分子量在3~5kDa的蛋白质，脱盐时应选用Sephadex G 50或G 25；而对于小分子量多肽物质（1~5kDa），脱盐则应选用Sephadex G 10或Sephadex G 15。

②凝胶介质的处理和装柱商品凝胶一般是干粉，使用前应用水溶胀。

一般情况下，1份凝胶加十份水，自然溶胀至少24小时。

溶胀后，将上清中细小的凝胶碎块弃除，重新搅拌悬起，待凝胶沉淀后，再次弃去凝胶碎块，重复数次，直到液相澄清为止。

为加速溶胀，可将凝胶煮沸一小时，该法同时具有灭菌的作用。

凝胶过滤层析柱的长与直径的比例应为50~100:1。

装柱时柱体要垂直，先在柱内加入约1/3柱床体积的水或缓冲液，然后沿柱一侧将缓冲液中的凝胶（凝胶：缓冲液=3：1）搅拌均匀，缓慢并连续地一次性注入柱内。

装柱过程中，要避免柱内缓冲液流干，注意保持柱体凝胶均匀无气泡和裂缝。

装完后，可用2 ml蓝色葡聚糖溶液检查柱体的均匀性。

如柱体均匀，可见蓝色区带均匀平稳地通过凝胶，不留任何条纹。

要保持凝胶和缓冲液温度一致，以减少气泡的产生。

③上样凝胶过滤柱层析对于样品的体积有严格的要求。

样品体积不应超过柱床体积的1~5 %，如超过5 %，则会导致分离效率降低，低于1 %则分离效率也不会提高，所以蛋白质样品应尽可能浓缩至10~20 mg/ml。

样品本身对洗脱液的相对粘度不能超过2，样品粘度过高，会使层析区带不稳定，或流速不规律，区带变宽或扭曲。

上样前样品应经0.2 μm 孔径滤膜过滤或10，000 g离心5 min，去除残渣，加样时避免破坏柱体表面，保持其表面均匀平整。

④洗脱洗脱液应保持一定的离子强度以消除凝胶中含有的游离羧基和硫酸根等与蛋白质的结合作用。

Sephadex和Sepharose CL凝胶层析所用的洗脱液的离子强度至少应为0.02 mol/L；Sephacryl凝胶应为0.05 mol/L。

一、实验目的1. 了解凝胶层析法的原理及操作步骤。

2. 掌握凝胶层析脱盐实验的基本操作，学会使用凝胶层析柱进行蛋白质的脱盐纯化。

3. 通过实验验证凝胶层析法在脱盐过程中的效果。

二、实验原理凝胶层析法是一种利用凝胶的分子筛作用，将混合物中的组分按分子大小进行分离的方法。

凝胶层析脱盐实验主要是通过凝胶的分子筛作用，将含有盐的蛋白质溶液中的盐分与蛋白质分离，从而达到脱盐的目的。

三、实验材料与仪器1. 材料：- 凝胶层析柱（1.5cm×20cm）- Sephadex G-25凝胶- 0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液- 样品（含盐蛋白质溶液）2. 仪器：- 电子天平- 移液器- 烧杯- 漏斗- 铁架台- 铅笔四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：- 将凝胶层析柱垂直固定在支架上，关闭下端出口。

- 将Sephadex G-25凝胶用0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液充分溶胀，然后倾倒至层析柱中，使其自然沉淀至柱底。

2. 准备样品：- 用移液器准确吸取一定量的含盐蛋白质溶液，加入适量的0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液进行稀释，使其浓度适宜。

3. 加样：- 将准备好的样品沿层析柱的上端缓慢加入，注意不要扰动凝胶层。

4. 层析：- 打开层析柱下端出口，用0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。

5. 收集与鉴定：- 收集洗脱液，观察洗脱液的颜色变化，判断脱盐效果。

- 取一定量的洗脱液进行SDS-PAGE电泳分析，观察蛋白质的迁移情况，进一步验证脱盐效果。

五、实验结果与分析1. 观察洗脱液的颜色变化：- 在凝胶层析脱盐实验过程中，随着洗脱液的收集，洗脱液的颜色逐渐变浅，说明盐分逐渐被洗脱。

2. SDS-PAGE电泳分析：- 通过SDS-PAGE电泳分析，观察蛋白质的迁移情况，发现脱盐后的蛋白质样品中，目标蛋白质的条带明显，说明脱盐效果良好。

六、实验结论通过凝胶层析脱盐实验，我们成功地将含盐蛋白质溶液中的盐分与蛋白质分离，实现了脱盐的目的。

实验三Sephadex G-25凝胶层析法脱盐和离子交换柱层析分离菠萝蛋白酶一、Sephadex G-25凝胶层析法脱盐（一）目的和要求掌握凝胶层析法的原理及操作技术。

（二）原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。

脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。

前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。

凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatography）、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。

它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。

其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。

凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。

网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。

人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。

凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。

分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。

这样被分离物质即被按分子的大小分开。

一、实验目的1. 掌握凝胶层析法的原理和操作步骤。

2. 学习利用凝胶层析法对蛋白质进行脱盐处理。

二、实验原理凝胶层析法是一种利用凝胶对分子进行分离的技术。

凝胶是一种具有多孔结构的物质，分子在凝胶中的移动速度取决于其分子大小和凝胶孔径。

通过选择合适的凝胶和层析条件，可以将不同分子大小的物质分离。

在凝胶层析脱盐实验中，蛋白质分子与盐分子在凝胶层析柱中的移动速度不同，从而使蛋白质与盐分离。

蛋白质分子较大，无法进入凝胶的微孔，移动速度较快；而盐分子较小，可以进入凝胶的微孔，移动速度较慢。

三、实验材料与试剂1. 材料：蛋白质样品、盐溶液、葡聚糖凝胶G-252. 试剂：蒸馏水、缓冲液、洗脱液、洗脱液储备液、盐检测试剂、蛋白质检测试剂四、实验步骤1. 装柱：称取葡聚糖凝胶G-25 5g，加入80ml洗脱液（蒸馏水或适宜的缓冲液），在沸水浴中溶胀30min，用倾泻法去除悬浮的小颗粒。

然后装进内径1.2cm，高30cm的玻璃柱内，注意装填均匀，无气泡和裂纹存在，并保持液面在凝胶表面以上。

2. 加样：打开柱的出口，让柱内的液体慢慢流出，直至液面与凝胶床表面相平，然后加入2ml含盐蛋白质溶液，至样品液面刚好到达凝胶床表面时，加入30ml洗脱液（与溶胀和装柱时所用液体完全相同），以0.5ml/min的流速洗脱，每5ml收集一管。

3. 收集样品：将收集的样品液进行盐和蛋白质检测。

4. 盐检测：根据具体盐的种类选择合适的检测方法，如火焰原子吸收光谱法、离子色谱法等。

5. 蛋白质检测：将分步收集的样品液于280nm处的紫外光吸收法检测，也可用福林酚测定。

五、实验结果与分析1. 盐检测：通过盐检测方法，可以确定脱盐效果。

实验结果显示，脱盐效果良好，盐浓度明显降低。

2. 蛋白质检测：通过紫外光吸收法或福林酚法，可以确定蛋白质的纯度和浓度。

实验结果显示，蛋白质的纯度较高，浓度符合预期。

六、实验讨论1. 凝胶层析法是一种简单、有效的蛋白质脱盐方法。