大肠菌群检验原始记录(平板计数法)

检验员：审核员：
样品编号
LST肉汤初发酵试验培养温度℃，培养开始时间年月日点分，培养结束时间年月日点分。
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，接种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，培养观察。
样
品
编
号
BGLB肉汤复发酵试验
培养温度℃，培养开始时间年月日点分，培养结束时间年月日点分。
结果报告
MPN/mL
备注：+：阳性-：阴性
绥芬河出入境检验检疫局综合技术中心密山实验室
ZJ-03-107大肠菌群检验原始记录
样品名称：样品号：
检验日期：验讫日期：标准物质Biblioteka 号检验依据设备编号
大肠菌群计数
第一法大肠菌群MPN计数法：取检样25g(ml)+225ml，用均质器均质1min，制成1:10的样品匀液。按10倍递增稀释，选取6个适宜的稀释倍数，接种LST肉汤管，每个稀释度接种三管，培养观察。

大肠菌群是经常用来衡量食品卫生情况的重要指标，绝大部分食品都会要求检测的项目。

在食品微生物实验室里，大肠菌群和菌落总数的检测频次应该是最高的，但检测过程中总会有一些小问题困扰着大家，以下来讲解一下大肠菌群平板计数法的注意事项。

方法选择相比于MPN计数法，平板计数法更适用于大肠菌群含量较高的食品。

但大肠菌群多少算是含量较高呢国标里没有明确规定，但通常认为，产品大肠菌群以100CFU/g（mL）为界，超过这个含量一般认为是含量较高。

但具体什么时候选用平板计数法进行大肠菌群的检测，大部分情况还是要看你的产品执行的标准。

假如产品标准要求大肠菌群含量的单位为CFU/g（mL），那必须选用平板计数法。

若是/g(mL)或者MPN/100g(mL)，就应选择MPN计数法，MPN法具体选用哪版国标此处不再赘述。

因此，根据自己产品的情况选择适当的检测方法。

培养基的要求平板计数法使用的培养基为结晶紫中性胆盐琼脂培养基，简称VRBA。

无论是国标，还是培养基的使用说明中都明确表示，VRBA是不需要进行灭菌的，煮沸2min即可使用。

特地点出这一点是因为很多朋友都在问VRBA的灭菌条件，对不灭菌的培养基不信任，害怕出现检测异常，那是因为这些小伙伴们对其中的原理不清楚。

大肠菌群的定义是在一定培养条件下能够在发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，因此大肠菌群是不能形成芽孢的，在VRBA培养基煮沸的过程中，即使有大肠菌群存在也会被杀灭，所以从培养基带入污染的可能性是没有的。

当然盛装培养基的容器是需要进行灭菌的，以免容器引入污染。

另外，VRBA是一种选择性的培养基，含有的结晶紫对革兰氏阳性菌有比较强的抑制作用而对革兰氏阴性菌几乎没有作用，而且平板培养产生的菌落还需要进行复发酵的验证，因此VRBA培养基就不需要进行灭菌了。

但值得注意的是，VRBA需要现配现用，配制出的培养基应当在3h之内使用完毕。

稀释度的确定国标中要求选择2-3个适宜的连续稀释度。

大肠菌群快速检测一、初始接菌量与达到0.2吸光度所需时间线性关系确定菌种：大肠杆菌AS1.90方法：AS1.90菌种稀释液10-4，10-5，10-6，10-7，10-8接种0.5至装有3.6mLONPG培养基的瓶子中，放至斯坦道研制的仪器自动检测。

以平板计数法确定初始接菌量。

结果：AS1.90 10-7=197CFU/mL以10为底初始接菌量的对数值为横坐标，达到0.2吸光度所用时间为纵坐标，得到初始接菌量与达到0.2吸光度线性关系，如下图示。

在高浓度初始接菌量下，初始接菌量与达到0.2吸光度所需时间呈现良好线性关系。

二、同一理论接菌量下不同反应瓶的时间比较菌种：大肠杆菌AS1.90方法：大肠杆菌AS1.90菌种稀释液10-6接种0.5至装有3.6mLONPG培养基的瓶子中，同样的接菌量做四管，放至斯坦道研制的仪器自动检测。

大肠杆菌AS1.90菌种稀释液10-9接种0.5至装有3.6mLONPG培养基的瓶子中，同样的接菌量做四管，放至斯坦道研制的仪器自动检测。

以平板计数法确定初始接菌量。

结果：10-8=108CFU/mL在高浓度初始接菌量(理论浓度10800CFU/mL)下，四个平行样达到0.2吸光度所用的时间基本一致，在6.5小时左右。

在低初始接菌量(理论浓度11CFU/mL)下, 四个平行样达到0.2吸光度所用的时间差别较大，有两管为535min，一管为570min，另一管为701min。

三、小结Ⅰ、在高浓度初始接菌量（102CFU/mL以上）时，初始接菌量与达到0.2吸光度所需时间呈现良好线性关系。

平行样达到0.2吸光度所用的时间基本一致。

Ⅱ、在低浓度初始接菌量（10CFU/mL以下）时，同样初始接菌量与达到0.2吸光度所需时间差别较大。

Ⅲ、实验中还发现，反应的容器对反应时间影响很大。

如在15*150mm试管反应的时间比在瓶子中反应时间多了4小时以上。

故统一容器的大小、形状和材料才能确定初始接菌量与达到一定吸光度所需时间线性关系。

G B4789.3-2010食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数前言本标准代替GB/T 4789.3-2008《食品卫生微生物学检验大肠菌群计数》。

本标准与GB/T 4789.3-2008相比，主要修改如下：——修改了标准的中英文名称；——"第二法大肠菌群平板计数法"的平板菌落数的选择范围修改为"15 CFU～150 CFU"；——删除了"第三法大肠菌群Petrifilm TM测试片法"。

本标准的附录A、附录B为规范性附录。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB 4789.3-1984、GB 4789.3-1994、GB /T 4789.3-2003、GB /T 4789.3-2008。

食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数1 范围本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。

本标准适用于食品中大肠菌群的计数。

2 术语和定义2.1 大肠菌群 coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

2.2 最可能数 most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。

3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。

3.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。

3.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。

3.4 天平：感量 0.1 g。

3.5 均质器。

3.6 振荡器。

3.7 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。

3.8 无菌锥形瓶：容量 500 mL。

3.9 无菌培养皿：直径 90 mm。

3.10 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。

3.11 菌落计数器。

4 培养基和试剂4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录 A 中 A.1。