ABO血型正反定型不一致资料讲解

ABO血型正、反定型操作规程[目的]保证ABO血型鉴定准确，确保临床输血安全。

[适用范围]XXX医院输血科[职责]具有专业技术的工作人员主要负责本院输血（或备血）标本的ABO血型鉴定（但只对该单份标本负责）。

[相关文件]试剂采购、保存和使用管理程序设备采购、使用管理程序消毒与清洁管理程序标本采集、运输、保存和报废管理程序紧急用血管理程序[相关记录]仪器设备的采购、使用和维护记录仪器的温度记录恒温水温箱的换水和消毒记录消毒液的配置记录清洁消毒记录试剂采购、使用记录标本交接和报废记录紧急用血记录[实验原理]ABO血型是根据红细胞表面存在的凝集原决定的。

存在A凝集原的称为A型，存在B凝集原的称为B型。

而血清中还存在凝集素。

当A凝集原与抗A凝集素相遇或B凝集原与抗B凝集素相遇时，会发生红细胞凝集反应。

一般A型血清中含有抗B凝集素，B型血清中含有抗A凝集素，因此可以用标准血清中的凝集素与被测者的红细胞反应（称为正定型），用标准红细胞与被测者血清中的凝集素反应（称为反定型），以确定其ABO血型。

[仪器器械]玻璃试管、玻片、记号笔、一次性塑料滴管、显微镜、普通离心机、试管架、恒温水温箱、试剂保存冰箱、标本保存冰箱。

[试剂]抗A标准血清、抗B标准血清、A型标准红细胞、B型标准红细胞、O型标准红细胞、生理盐水。

以上试剂均为有合格证件的正品。

[标本收集与处理]1．受检者血清：采集受检者静脉血2~3ml，经1000r/min离心1分钟或室温静置1小时后取上清。

2．2~5%的受检者红细胞：采集受检者静脉血或末梢血，用生理盐水制成2~5％红细胞盐水悬液备用，制备方法见本节质量控制和注意事项。

3．标本出现中度以上溶血者，为不合格标本，不能用于检测。

[实验方法与步骤]血型的正定型（试管法）：⑴、取2支试管，分别标上抗A 和抗B ；⑵、制备待测标本2~5%的红细胞悬液（取1支试管，加入2ml 生理盐水，再加入1滴待测标本红细胞，混匀备用）；⑶、在抗A 管中加入2滴抗A 标准血清，在抗B 管中加入2滴抗B 标准血清；⑷、在抗A 和抗B 管中分别加入1滴已制备好的待测标本2~5%红细胞悬液； ⑸、混匀后，立即对称放入离心机中进行1000r/min 离心1分钟，或室温静置1小时，再轻轻摇动试管，使沉于管底的红细胞浮起，先肉眼观察有无凝集现象，如内眼不见凝集，应将反应物倒于玻片上，再以低倍镜检查。

ABO正、反定型不合疑难血型三步分析法”ABO正反定型不符定义：①ABO正反定型不符，即正定型与反定型提示的血型结果不一致②ABO正反定型相符，但为弱反应，正定型反应强度＜3+，或反定型反应强度＜2+③正定型为O型，反定型与A细胞、B细胞凝集强度差别≥2+凡是遇到ABO正、反定型不合的病人第一步: 排除人为因素／操作失误１，重新采集血样⑴分抗凝，不抗凝两管⑵排除采错人，输血/输液处采样……２，核对试剂，器材仔细阅读试剂效期，说明书，操作方法，注意事项３，规范化操作复检复检ABO 血型仍然正、反定型不合，就确定为疑难血型进入三步法第二步第二步：凡是ABO正、反定型不合的病例按下面方法，分析病人的抗原、抗体是“变多？还是变少？”正、反定型结果判断1，正定型AB, (两种抗原) 抗原变多正定型O, (无抗原) 抗原变少2，反定型O, (两种抗体) 抗体变多反定型AB, (无抗体) 抗体变少3，正定型A, 或B (一种抗原) ①抗原变多;②抗原变少反定型A, 或B (一种抗体) ①抗体变多;②抗体变少★不要过问“真滴变多变少没有”，你依样画葫芦就是了规律很好记，不管是抗原/抗体：两种→肯定是变多没有→肯定是变少；一种→可能是变多，也可能是变少归纳ABO正,反定型不合的“五大类30种原因”知道有个“五大类30种原因”就可以了不要记，书上有这些表，现用现翻书★用排除法（1）红细胞抗原变少7种（2）红细胞抗原变多7种①＜6月,老年（临床）□①自身凝集素（临床诊断）□②白血病（临床诊断）□②红细胞粘附大量蛋白（RBC未洗）□③输异型血（输血史）□③样本含试剂反应物（RBC未洗）□④造血干细胞移植（病史）□④造血干细胞移植（病史）□⑤血型物质↑□⑤获得性B抗原（类B）（临床感染）□⑥急性大失血（临床病史）□⑥B(A)表型□⑦ABO亚型□⑦输异型血（输血史）□注意：每条的临床提示（3）血清抗体变少6种（4）血清抗体变多7种①<6个月/老年（临床）□①自身抗体（临床诊断AIHA）□②ABO亚型□②同种抗体（抗筛）□③低丙种球蛋白血症（化验）□③对试剂反应的物质□④造血干细胞移植（病史）□④血清蛋白异常（化验）□⑤先天性ABO抗体缺失□⑤输异型血浆（输血史）□⑥大量输液（输血史）□⑥造血干细胞移植（病史）□⑦输含血型抗体Ig（输血史）□注意：每条的临床提示5）混合凝集（mf）3种①3个月内输异型血（输血史）□②造血干细胞移植（病史）□③双精子受精/嵌合体（问家系）□注意：每条的临床提示归纳剩下不能排除的原因：第三步: 实验验证针对剩下几种不能排除的原因, 选择针对性实验验证，如何选择针对性实验呢?翻看书本:《输血免疫血液学实验技术》人民卫生出版社,2011 .1; P131。

34例ABO血型正反定型不符的原因分析摘要】目的分析ABO血型正反定型不符的原因，寻找解决问题的方法，并初步建立起血型正反定型不符时的操作规程。

方法对34例ABO血型正反定型不符的标本分别选用洗涤、改变反应温度、吸收放散试验、直接、间接抗人球蛋白实验，以及检测血型物质等实验方法。

结果经确认实验，分别判定为18例抗体减弱，12例冷凝集，2例红细胞抗原减弱，1例白蛋白、球蛋白比例失调，1例由于血液中可溶性血型物质过少引起的正反定型不符。

结论 ABO血型鉴定出现正反定型不符时，应根据表现型的具体情况和患者的临床资料设计血清学实验，正确鉴定ABO血型。

【关键词】ABO血型正反定型鉴定正反定型是安全输血最基本的保证，在工作中若发现正反定型不符的情况要高度重视。

笔者就日常工作中发现的34例正反定型不符的标本，对其原因进行总结，现报告如下：1 资料与方法1.1标本来源本院检验科2009年1月至2011年12月的住院患者，共计13567人次，受检者年龄5天—88岁。

1.2仪器与试剂康华医药公司提供的ABO血型试剂及反定型红细胞、专用离心机、专用保温箱、水浴箱和冰箱。

1.3方法1.3.1ABO血型鉴定，利用ABO血型试剂进行正定型；同时以每分钟2000转速度离心5分钟分离血清，将患者的血清加入标准A型红细胞，B型红细胞，O型红细胞离心进行血清学鉴定。

1.3.2吸收放散试验患者红细胞洗涤后制备压积红细胞，与等量相应抗血清混合放置4摄氏度冰箱1小时，取出后用4摄氏度生理盐水洗涤5次，取末次洗涤液作阴性对照，取压积红细胞加等量生理盐水置56摄氏度水浴箱放散10分钟，离心取上清液即放散液，加入相应的标准A型、B型红细胞立即离心看结果。

1.3.3 唾液中血型物质鉴定将患者的唾液离心，煮沸再离心处理，取5毫升唾液与5毫升生理盐水倍比稀释三排（1：1—1：512），分别加入等量抗-A、抗-B、抗-H血清的标准液，37摄氏度水浴箱中和15分钟，加入相应标准A型、B型、O型红细胞，离心看结果。

52例ABO血型正反定型不符原因及分析摘要：目的 ABO血型系统在临床应用中至关重要，如何准确的发出血型结果考验着每一个输血人，方法利用血型正反定型（微柱法、试管法）、ABO 亚型鉴别试验、吸收放散试验、抗人球蛋白试验、不规则抗体筛查及鉴定等试验，现就我院2014-2017年52例ABO血型正反定型不符的案例进行分析，结果抗体减弱患者25 例占59%，人为因素4例占8%，试剂因素3例占6%，血浆蛋白凝集干扰3例占6%，不规则抗体干扰4例占8%，冷自身抗体干扰6例占11%，亚型1例占2%，结论利用纠正试验来鉴别、推理，得出正确的血型结果。

关键词：ABO血型；不规则抗体；冷自身抗体；亚型52 cases of ABO blood group positive and negative stereotypes and analysis of the reasonsZhang Shi-peng，Li Xiao-bin，Feng Xin-guoDepartment of blood transfusion，the 331 Hospital of Zhuzhou，Zhuzhou，Hunan，412002，ChinaAbstract：Objective ABO blood group system is very important in clinical application，how to accurately test the results of blood type. Methods By using the method of blood group type（micro column method and test tube method）and ABO subtype identification test，absorption elution test，antiglobulin test，irregular antibody screening and identification tests，we analyzed 2014-2017 in our hospital 52 cases of ABO blood group typing discrepancies of the case. Results 25 cases of patients with weakened antibody accounted for 59%，4 cases of human factors accounted for 8%，3 cases of reagent factors accounted for 6%，3 cases of plasma protein agglutination interference accounted for 6%，irregular antibody interference in 4 cases accounted for 8%，cold autoantibodies interference 6 cases accounted for 11%，subtype 1 cases accounted for 2%. Conclusions the correct blood group result can be obtained by the correct test.Key words：ABO blood group；irregular antibody；cold autoantibody；subtype血型是指一个人红细胞上带有或缺乏一些特异性的物质。

ABO疑难定型一、ABO疑难血型鉴定的方法（一）正反定型：正定型：-A, -B，-AB, -H, -A1反定型：Ac, Bc, Oc, 自身对照1. ABO正定型中各种试剂用途疑难定型中正定型用抗血清抗-A及抗-B抗-AB:确认弱A和弱B抗原,与弱A及弱 B抗原亲和力强,会产生强反应抗-H:用于检查亚型及孟买型, A亚型红细胞上的H抗原多于正常A型抗-A1: 用于A亚型(如A2, A3)检测2. H抗原在红细胞上的分布3. ABO反定型中各种试剂的用途反定型中试剂红细胞的意义A及B细胞: 确认抗-A或抗-B抗体O型红细胞:检查是否存在ABO系统以外抗体干扰ABO反定型自身对照: 用于确认正反定型结果的有效性,排除自身抗体对定型的干扰(如冷凝集等) A2细胞: 用于亚型的鉴定, 尤其是在怀疑是A亚型且又存在抗-A1抗体的情况下（二）型物质测定型物质准备：1~2ml唾液，沸水煮10分钟，离心后得到的上清。

标清的调制：标清用盐水稀释至其效价为1：16中和：将0.5ml型物质与调制后的标清0.5ml等体积混合,室温放置30分钟检测：用Ac检测中和后的抗-A, Bc检测中和后的抗-B.结果判断：如果抗-A被中和，则被检者为A型，如果抗-B被中和，则被检者为B型。

（三）吸收放散吸收用RBC：盐水洗涤5次的被检者压积RBC 1ml。

吸收用的标准血清将压积RBC和标清按等体积比例混合，在相应的温度条件下（4℃）孵育1小时，每隔15分钟混匀一次用盐水洗涤孵育后的细胞6次，得到压积RBC，加入等量盐水。

56℃水浴震荡10分钟，离心获得上清即为放散液。

用标准试剂红细胞检测放散液。

（四）O型筛选红细胞的应用抗原组成:三组合细胞,要求必须具备全部的Rh因子I: O型R1R1(CDe/CDe); II:O型 R2R2(cDE/cDE); III: O型rr(cde/cde)用途: 用于受血者、献血员及孕产妇等的ABO系统以外不规则抗体的筛选目的: 在配血之前,有针对性、按比例的去寻找与带有抗体的病人相配合的血（五）自家冷凝集血样的ABO定型正定型用红细胞的准备:血样采集后,立即离心,获得压积红细胞用37℃温盐水洗涤红细胞45℃热放散3分钟巯基试剂处理: 破坏IgM抗体自家冷凝集血样的ABO定型反定型用血浆或血清的准备血样采集后放置4℃冰箱静置24小时,使红细胞充分吸收自身冷凝集抗体用自身红细胞吸收去除自身冷抗体用O型红细胞吸收去除ABO系统以外的非特异性及特异性抗体（六）获得性B1. 获得性B及多凝集现象获得性B:肠紊乱及感染病人, 细菌酶影响A抗原的受体肠内壁通透性增加,而后细菌多糖吸附在红细胞表面多凝集现象:异常或变形的RBC被所有正常人的血清凝集(微生物酶作用暴露或激活膜隐蔽受体多凝集血样中的血清不与自身反应)2. 获得性B产生的主要机理二、ABO正反定型不符的问题分析（一）ABO定型问题经常发生的情况为：1. 明显缺失应该出现的抗-A或抗-B：(1) 新生儿血样(2) 免疫缺陷、免疫紊乱(3) 前带现象(4) 血型型物质过多(5) 抗原太弱，常规方法检查不出来，相应血清中无抗体(6) 亚型，反应是混合视野2. 由于试剂被污染，或试剂中有额外抗体3. 明显多出抗原(或多出抗体)(1) 亚型，如A2型可能血清中有抗-A1(2) 自家凝集(3) 获得性B（二）引起ABO正反定型不一致的原因分析1. 技术因素：(1) 试剂贮存不当(2) 使用技术错误(3) 使用错误的试剂(4) 使用污染或失效的试剂(5) 离心速度不当2. 存在IgM性质的自家冷抗体由于自家冷抗体(冷凝集病,CHD)而导致自家溶血的病人，在低于37℃时血细胞自发凝集，影响正反定型。

血型鉴定中出现ABO血型正反定型不符的原因及措施目的对血型鉴定中出现ABO血型正反定型不符的原因和处理措施进行探讨。

方法抽取2014年1月～2016年12月间，拟输血患者中ABO血型正反定型不符者18例作为研究对象，对其进一步展开吸收放散试验、抗体筛查、唾液血型物质测定、亚型检测，经ABO疑难血型3步分析法对不符的原因进行分析及鉴定。

结果本次18例ABO血型正反定型不符者中，有2例为人为因素造成，另外16例的原因包括有生理因素、自身抗体因素、血浆蛋白异常、不规则抗体以及血液疾病等因素，其中不规则抗体因素所占比例最高（P＜0.05）。

结论造成ABO血型正反定型不符的原因较多，在临床血型鉴定中应引起重视，积极采取有针对性的确诊试验，展开鉴定分析，ABO血型鉴定时选择正确辅助手段，进而提高血型鉴定准确性，以保证输血的安全性、有效性。

[Abstract] Objective To explore reasons and measures of ABO typing discrepancy in blood grouping. Methods 18 patient with ABO typing discrepancy who were planning to receive blood transfusion from January 2014 to December 2016 were selected as research objects and they were further given absorption-elution test，antibody screening，saliva blood-group substance and subtype blood grouping.Reasons for discrepancy were analyzed and detected by 3-step analytical method of suspicious ABO blood group. Results In 18 patient with ABO typing discrepancy，2 cases were caused by human factors and 16 cases were caused by physiological factors，autoantibodies factors，plasma protein abnormality，irregular antibodies，hematologic diseases and other factors.Of which，proportion of irregular antibodies factors is the highest（P＜0.05）. Conclusion There were many reasons for ABO typing discrepancy which should be paid attention in clinical blood grouping and take targeted confirmatory tests and carry out identification and analysis.Proper supplementary means of ABO blood grouping can further improve accuracy of blood grouping to guarantee safety and effectiveness of blood transfusion.[Key words] Blood grouping；ABO typing discrepancy；Safety of blood transfusion；Suspicious blood group；Influencing factors在實际临床工作中，ABO血型属于输血、器官移植过程中所应用到的一种非常重要的血型系统，确定受血者与供血者之间的ABO血型正确，是有效保证临床输血安全的一个非常重要的前提，也是基本原则。

ABO血型鉴定正反定型试验方法
一、试剂和材料：
（一）单克隆抗A、抗B试剂（由试剂厂家提供）
（二）显微镜、载玻片
（三）A型、B型红细胞（本实验室制备的5%混悬液）
（四）EDTA抗凝的待测红细胞全血
（五）竹签
二、方法（玻片法）：
（一）正定型：
1.在一块干净的玻片上，间隔一定距离做好标记，分别滴一滴抗A和抗B试剂；
2.在每滴试剂中加一滴待测红细胞全血；
3.用竹签混匀试剂和红细胞，并使混合物直径＞15mm；
4.轻摇玻片，两分钟内观察结果，必要时可以在低倍镜下观察；
5.判读、解释并记录反应结果。

（二）反定型：
1.在玻片上间隔一定距离标明Ac和Bc字样。

分别滴加5%的A型红细胞悬液、B型红细胞悬液各一滴；
2.在玻片每滴红细胞悬液上滴加待测血清各一滴；
3.混匀（同正定型）；
4.轻摇玻片，两分钟内观察结果，必要时可以在低倍镜下观察；
5.判读、解释并记录反应结果。

6.结合正反定型反应结果、判定血型，见表1
表1 ABO血型正反定型试验结果判定
三、附注：
（一）表中“O”表示无凝集，“+”表示凝集，一般都是3-4个+的强凝集反应；
（二）2分钟后红细胞仍呈均匀混悬状态是阴性反应；
（三）若得到弱的或可凝集反应结果，该标本应用试管法重新试验；
（四）由于新生儿在出生4~6个月内，血浆中的ABO抗体活动太弱，并且含有来自母亲的抗体，故新生儿血型只能由检测红细胞抗原的正定型来测定其ABO血型；
（五）做正定型时，还可加一抗A、B血清（O型人血清），以检测ABO弱抗原；做反定型时可以加试一O型红细胞，借以证实是否有不规则抗体的存在。

ABO血型鉴定中正反定型不一致时的分析与探讨目的：利用ABO疑难血型3步分析法对正反定型不一致时导致的疑难血型进行鉴定和分析，探讨其原因与解决办法。

方法：用试管法和微柱凝胶卡法常规检测ABO血型，正反定型不符者进一步做吸收放散试验、唾液血型物质测定、抗体筛选、亚型检测等，并应用ABO疑难血型3步分析法进行分析、鉴定。

结果：共检测正反定型不符20例。

其中2例属于人为原因操作不规范导致正反定型结果不符，另外18例疑难血型鉴定分析原因主要为：生理因素、自身抗体、不规则抗体、血浆蛋白异常、血液病等影响因素。

结论：按照不同的确诊试验分别进行鉴定分析判断，选择正确的辅助方法检测ABO血型，提高血型鉴定的准确性与输血的安全有效性。

关键词ABO疑难血型3步分析法疑难血型鉴定输血安全ABO血型是人类最早发现也是对输血安全影响最大的血型系统。

ABO定型错误会导致溶血性输血反应，轻者可能导致无效输血，重者危及受血者的生命[1]。

当发现ABO正反定型不一致时如何查找原因并快速正确地鉴定患者血型就显得尤为重要。

我们在输血前试验中应用ABO疑难血型3步分析法[2]，对20例疑难血型进行鉴定分析及总结，报告如下。

1 材料与方法1.1 标本来源上海市中医药大学附属曙光医院2011年1月至2012年6月拟输血患者中ABO血型正反定型不符20例，年龄3个月～80岁。

1.2 试剂和仪器抗A、抗B和抗AB血型定型试剂（单克隆抗体），抗H、抗A1和RhD（IgM）血型定型试剂（单克隆抗体），人ABO血型反定型用红细胞试剂盒（其中包括：A1细胞、B细胞、O细胞）、直接抗人球蛋白试剂（抗IgG，C3d多特异性）、抗体筛检红细胞试剂盒等由上海血液生物医药公司生产；抗人球蛋白检测卡、ABO 血型微柱凝胶卡、37 ℃专用孵育器、卡式离心机由强生医疗器材有限公司生产；2002-2型血清学专用离心机由台湾贝索公司生产。

1.3 方法根据ABO疑难血型3步分析法。

ABO正反定不符5大类33种原因正反定不符的范围：正反定不符；正定型凝集强度＜3+，反定型凝集强度＜2+；正定型O型，反定型两孔凝集强度差别＞2+。

本文所总结正反定不符5大类33种原因，5大类可概括为，正定减弱、正定增强、反定减弱、反定增强和混合凝集。

一、正定型凝集减弱/缺失 7种1、年龄小于6个月或老年(临床提示)年幼和年长者ABO抗原由于自身原因，本身正定型较弱。

2、白血病(临床提示) 血液病红细胞异常，抗原弱。

3、异型血输注(临床提示输血史) 异型血输注形成混合血液标本，陈旧细胞可能表现为弱凝集。

4、造血干细胞移植(病史)造血干细胞移植形成混合红细胞，可能表现为凝集弱。

5、血型物质升高血型物质升高，中和试剂中抗体，降低效价，造成凝集减弱。

6、急性大失血(临床病史)急性失血后新产生红细胞未结合ABO血型抗原，凝集弱。

7、ABO亚型亚型抗原凝集弱。

二、正定型额外凝集 7种1、自身凝集素(临床提示AIAH)红细胞自身凝集，正定型假阳性，可通过正定型对照孔阳性发现。

2、红细胞粘附大量蛋白(红细胞未洗涤)红细胞黏附蛋白与抗体反应造成假阳性，可通过洗涤红细胞去除。

3、红细胞与血清试剂反应红细胞与血清试剂中非抗体成分反应，防腐剂、抗生素等。

4、造血干细胞移植(病史)移植干细胞生成红细胞与宿主不同，混合血液标本，额外凝集。

5、获得性B抗原(类B)(临床提示感染) 肠道菌干扰造成A、O型红细胞表面结合类B血型糖链物质，正定型表现为AB型或B型。

病情好转，“B”型消失。

6、B(A)、A(B)表型AB血型物质有相似，基因突变可导致表达的蛋白酶具有一定对方抗原转化活性，形成类似对方抗原物质，与部分单克隆抗体反应，与部分单克隆抗体不反应。

7、异型血输注(输血史) 混合血液标本表现为混合凝集，正定型有额外凝集。

三、反定型凝集减弱/缺失 6种1、年龄小于6个月或老年(临床提示)2、双胞胎嵌合体(家族史)例如A102O02/B102O02，两套基因，但抗原表达极弱，表现为AelBel，临床极有可能可能正定型判为O型，但无相应抗体。

■冏鍋範ABO血型鉴定正反定型不符的影响因素分析胡军彭焦武*（枝江市人民医院，湖北枝江443200）DOI：10.19435/j.1672-1721.2020.34.048ABO血型鉴定正反定型不符一直是影响输血安全的重要因素，ABO“疑难血型”的鉴定除了患者本身生理、病理因素外还受实验室人员能力、实验室设备、实验试剂、实验方法、实验环境等诸多因素影响。

各级医院输血科（血库）、各级血液中心、各级实验室对正反定型处理的能力参差不齐。

为进一步增强对血型鉴定中岀现正反定型不符结果的处理能力，保障输血安全，现就ABO正反定型不符的影响因素研究状况进行综述。

1常见正反定型不合的原因分类1.1人为因素对于基层实验室而言人为因素最为常见叫试验操作技术问题始终是应该首先排除的问题,出现此类问题一般只要进行复査即可解决。

最常见的原因是标本混淆、采样不规范、实验操作不规范叫1.2生理因素患者年龄、ABO亚型、冷凝集素等原因也可以导致ABO正反定型不符。

1.3病理因素各种病理因素会导致抗体效价升高或降低，抗原的抗原性增高或减弱甚至出现新的抗原物质。

造血干细胞移植、早产儿、恶性血液病、自身抗体a常引起ABO正反定型不符。

兰炯采等专家将正反定型结果不一致分为红细胞抗原减弱或丢失、红细胞额外反应、混合凝集、血清定型减弱或无反应、血清额外反应五类叫目前这种分类方式被广泛应用。

2正反定型不合的原因分析2.1技术错误检验前、检验中、检验后任何不规范操作均可能导致正反定型不符。

2.2红细胞表面抗原物质发生变化可引起正定型假阴性或假阳性。

2.2.1红细胞ABO抗原减弱或丢失输注异型红细胞、各种少见血型如A2.A2B等ABO亚型、白血病等恶性血液病、恶性实体肿瘤问、可溶性血型物质过高、急性大量失血、抗原发育不全或减弱、造血干细胞移植均可能导致红细胞抗原减弱或丢失而出现正定型假阴性。

2.2.2红细胞额外反应自身免疫性溶血性贫血、红细胞上黏附大量蛋白、各种髓系疾病、造血干细胞移植、获得性罕见表型、输注异型红细胞、双精子嵌合体网均可导致正定型假阳性。

㊃临床研究㊃D O I:10.3969/j.i s s n.1672-9455.2024.05.025A B O正反定型不符的白血病患者血型鉴定与临床分析*李茜,张智慧,高力立,彭沫溱,陈璐,赵梓昕,寸伟,罗臻ә,苏品璨云南昆明血液中心输血研究室,云南昆明650106摘要:目的对1例白血病患者A B O血型鉴定异常结果进行鉴定与回顾性分析,旨在为同类患者血型相容性检测提供参考㊂方法采用血清学检测进行A B O血型鉴定,采用聚合酶链反应-序列特异性引物进行A B O血型基因分型;采用亚硫酸氢盐测序检测A B O启动子甲基化状态㊂结果患者A B O血型正定型结果为O型,反定型结果为A型,正反定型结果不一致;试管法重复试验,4ħ时可见A1c凝集;吸收放散试验结果显示红细胞表面存在A抗原,提示正定型结果为A型;不规则抗体筛查阴性,直接抗人球蛋白试验阴性;基因分型检测基因型为A O1,表型为A型;甲基化检测发现患者A B O基因启动子区甲基化率为66.7%,明显高于随机选取的5例正常对照组标本平均甲基化率㊂结论白血病患者A B O抗原减弱可能导致血型误判,疾病状态下患者A B O基因启动子甲基化程度增高可能与其A B O抗原减弱密切相关,须结合分子生物学基因分型和血型基因甲基化检测方法进一步判断患者血型鉴定异常的原因,保障临床用血安全㊂关键词:白血病; A B O血型鉴定;血清学检测;聚合酶链反应-序列特异性引物;甲基化中图法分类号:R733.7;R457.1+1文献标志码:A文章编号:1672-9455(2024)05-0695-05输血作为一种临床救治患者的常用治疗手段,既可提高患者携氧功能,又能改善其凝血功能障碍,因此,输血前的A B O血型鉴定对保障临床输血安全尤为重要㊂A B O血型是由A B O基因编码决定的,一般情况下人体A B O血型不会发生改变㊂白血病是起源于造血干细胞或祖细胞的恶性克隆性疾病[1-2],白血病患者处于疾病状态可能引起自身体内血细胞或血浆成分发生改变,导致A B O抗原减弱或A B O抗体效价降低,出现A B O血型鉴定正反定型不相符的情况,极易引起血型误判,直接关系临床输血安全[3-4]㊂多种因素均可导致患者A B O抗原减弱,近年来,有研究发现,A B O基因启动子区甲基化程度与A B O抗原表达异常有关[5-8],但相关文献报道较少见㊂本研究通过血清学㊁聚合酶链反应-序列特异性引物(P C R-S S P)检测和A B O基因启动子区甲基化状态检测等检测手段对1例白血病患者的A B O血型鉴定检测异常结果㊁原因及处理方法进行了分析,初步探讨了白血病中A B O基因甲基化状态异常导致A B O抗原表达减弱在输血相容性检测中的临床意义,以期为临床诊疗提供参考依据,现报道如下㊂1资料与方法1.1一般资料血液标本来源于云南省肿瘤医院,患者,女,24岁,患恶性血液病,有2次输血史,患者知情同意本研究并签署知情同意书㊂患者于2022年2月3日初次诊断为白血病,目前患者白细胞计数(W B C)为206ˑ109/L,血红蛋白(H b)为51g/L,血小板计数(P L T)为38ˑ109/L,同时伴有脾脏肿大㊂患者严重贫血,急需输血,因其A B O血型鉴定正/反定型不一致(正定型结果为O型,反定型结果为A 型),医院将患者血液标本送检至血液中心进行A B O 血型鉴定和疑难交叉配血实验㊂1.2仪器 A B O血型定型检测卡配套孵育器和离心机(长春博迅生物技术有限责任公司),K A2200型血型血清学专用离心机(日本久保田公司),电热恒温水浴箱(上海博迅实业有限公司),冰箱(海尔集团海尔电冰箱有限公司),M a g C o r e H F16自动核酸提取仪(中国台湾R B C B i o s c i e n c e公司),T100P C R反应扩增仪(美国B i o-R a d L a b o r a t o r i e s公司),P o w e r P a c T M基础电泳仪(美国B i o-R a d L a b o r a t o r i e s公司), C h e m i D o c X R S+凝胶成像系统(美国B i o-R a d L a b o-r a t o r i e s公司),3730测序列分析仪(美国A B I公司), S W-C J-1D洁净工作台(江苏苏洁净化设备厂),D K-8D型电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司), D Y Y-8型稳压稳流电泳仪(上海琪特分析仪器有限公司),Y X J-2离心机(湘仪离心机仪器有限公司),H6-1微型电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂),U-3010紫外-可见分光光度计(H i t a c h i公司),移液器(范围100~1000μL,20~200μL,0.5~10μL,德国艾本德E P P E N D O R F公司)㊂1.3试剂抗-A㊁抗-B血型定型试剂-单克隆抗体(上海血液生物医药有限责任公司,批号20220101), A B O血型卡正/反定型和R h D血型检测卡-微柱凝胶法(D i a M e d G m b H/B i o-R a d低离子抗人球蛋白卡,批号50093.11.28),抗-A1凝集素(上海血液生物医药㊃596㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5*基金项目:云南省临床医学中心分中心开放项目(2020L C Z X K F-X Y19)㊂ә通信作者,E-m a i l:k m b l o o d l z@g m a i l.c o m㊂有限责任公司,批号20221019),抗-H单克隆抗体(上海血液生物医药有限责任公司,批号20221110),抗-A B抗体(D I A G A S T,批号464000),抗人球蛋白[抗免疫球蛋白G(抗-I g G),抗-C3d]检测试剂盒(上海血液生物医药有限责任公司,批号20225001),抗-I g G 检测试剂盒(上海血液生物医药有限责任公司,批号20215102),抗C3d检测试剂盒(上海血液生物医药有限责任公司,批号20225201),人A B O血型反定型用红细胞试剂盒(上海血液生物医药有限责任公司,批号20235313),低离子抗人球蛋白卡-微柱凝胶法(D i-a M e d G m b H/B i o-R a d,批号50531.76.10),不规则抗体检测试剂(人血红细胞,长春博迅生物技术有限责任公司,批号20221208),红细胞血型抗体筛选细胞(微柱凝胶法)S e r a s c a n D i a n a3(D i a g n o s t i c G r i f o l s, S.A.西班牙基立福公司,批号23007.01);核酸提取试剂盒(中国台湾R B C B i o s c i e n c e公司,批号P4101-17230);人类红细胞A B O血型基因分型试剂盒P C R-S S P法(天津秀鹏生物技术开发有限公司,批号202004001),M e t h y l E d g e T M B i s u l f i t e C o n v e r s i o n S y s-t e m(P r o m e g a,批号0000470334),焦碳酸二乙酯处理水(碧云天B e y o t i m e,批号111122230306),T a K a R a E p i T a q T M H S(T a K a R a,批号AM20984A),加样缓冲液(T a k a r a,批号A L G988A),B i g D y e测序反应试剂盒(A B I公司,批号91235489),P O P7测序胶(A B I公司,批号2211711),10ˑ电泳缓冲液(A B I公司,批号2208378)㊂1.4检测方法1.4.1血型血清学检测采集患者肘部静脉血进行检测,A B O血型正/反定型鉴定㊁间接抗人球蛋白试验㊁不规则抗体筛查采用微柱凝胶卡法和试管法;直接抗人球蛋白试验(D A T)采用试管法;将抗-A㊁抗-B 分别与经盐水洗涤3次的受检者浓缩红细胞等量混合进行吸收放散试验㊂所有试验操作均按照标准操作规范[9-10]和试剂盒说明书进行㊂1.4.2 P C R-S S P检测取患者乙二胺四乙酸外周抗凝全血400μL,使用自动核酸提取仪提取基因组D N A,采用微量紫外分光光度计检测D N A浓度和纯度㊂按照人类红细胞A B O血型基因分型试剂盒说明书进行P C R-S S P法基因分型P C R扩增试验㊂配制2.0%的琼脂糖凝胶,将5μL扩增P C R产物进行电泳检测,于120V恒定电压条件下电泳40m i n后使用凝胶成像系统成像,记录试验结果并根据试剂盒说明书结果分型表判定基因型㊂1.4.3 A B O基因启动子区甲基化检测采用亚硫酸氢盐测序法(B S P)检测标本A B O基因启动子区C p G岛甲基化状态㊂根据M e t h y l E d g e T M B i s u l f i t eC o n v e r s i o n S y s t e m试剂盒说明书,对患者基因组D N A进行亚硫酸氢盐修饰,使检测标本基因组D N A 中未发生甲基化的胞嘧啶通过亚硫酸氢盐处理后转化为尿嘧啶,甲基化的C p G胞嘧啶则不变㊂在N C B I 数据库下载A B O基因序列,应用M e t h y l p r i m e r e x-p r e s s s o f t w a r e v1.0和M e t h P r i m e r软件选取A B O 基因启动子区富含C p G位点的区域,并设计扩增引物,检测片段分别为175㊁160b p,共包含13个C p G 位点,分别编号为1~13,扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,上游引物序列1:A T G T T-G T T T A G G T T G G A G T G T A G T G,下游引物序列1: A C C A A C A T A A T A A A T C C T C C A T C T C;上游引物序列2:T T T T A A G T A G T T G G G G T T A T A G A T,下游引物序列2:A C C T A C A A T C C T A A C A C T T T C A A㊂以亚硫酸氢盐修饰后的患者基因组D N A为模板,根据T a K a R aE p i T a q T M H S说明书要求扩增目标序列㊂P C R反应体系为50μL,包括亚硫酸氢盐修饰后D N A模板2μL,T A K A R A E p i T a q T M H S (5U/μL)0.25μL,10ˑE p i T a q P C R B u f f e r(M g2+ f r e e)5μL,25mM M g C l25μL,2.5mM d N T P M i x-t u r e6μL,上下游引物各2μL,其余用无菌水补足㊂P C R条件为94ħ,1m i n;98ħ,10s;57ħ,30s;72ħ,30s;40个循环;72ħ终延伸10m i n;终止在4ħ㊂将P C R产物进行D N A琼脂糖凝胶电泳后对目的条带进行切胶,使用S a n P r e p柱式D N A胶回收试剂盒进行纯化回收;使用H i e f f C l o n e T M Z e r o T O P O-T A C l o n i n g K i t试剂盒对目的片段进行目的片段T A 克隆;使用生工质粒提取试剂盒S K8191U N I Q-10柱式质粒小量抽提试剂盒提取质粒D N A;将质粒使用P s tⅠ单酶切,琼脂糖凝胶电泳检查片段大小,确定是否含有目的片段,鉴定阳性克隆子;将阳性克隆子送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列分析㊂1.5统计学处理采用C h r o m a s(V e r s i o n2.3)软件分析测序峰图,使用甲基化分析软件B I Q A n a l y z e r分析目标序列C p G位点甲基化情况,并将B S P测序结果以圆圈图输出㊂目标序列中有13个C p G岛位点,计算C p G岛甲基化位点数占总C p G岛位点的百分比,计算甲基化率㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1 A B O血型鉴定患者A B O血型正定型结果为O型,反定型结果为A型,正反定型结果不一致,4ħ时试管法可见A1c凝集㊂见表1㊂不规则抗体筛查试验结果显示,患者血浆与3种抗体筛查细胞均无凝集㊂见表2㊂D A T结果显示,抗-I g G+C3d㊁抗-I g G㊁抗-C3d均为阴性㊂吸收放散试验结果显示,患者红细胞表面存在A抗原㊂见表3㊂2.2 P C R-S S P法检测 A B O基因分型检测出患者P C R-S S P基因分型格局1㊁2㊁4㊁6㊁8㊁9㊁11孔为阳性,3㊁5㊁7㊁10孔为阴性㊂对照人类红细胞A B O血型基因分型试剂盒(天津秀鹏生物技术开发有限公司)结果分型表判定患者基因型为A O1,表型为A型㊂见图1㊂㊃696㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5表1 A B O 血型鉴定正反定型结果方法正定型抗-A 抗-B 抗-A B 抗-H 抗-A 1反定型A l cB cO c A 2c 自身c 微柱凝胶法(G e l )00///04+0/0试管法(R T -I S)0004+002+S000试管法(4ħ-I S)0004+02+3+000试管法(37ħ-I S)04+01+S注:0表示阴性;1+~4+表示阳性,强度以1~4数值表示;S表示凝集加强;/表示未检测㊂表2 不规则抗体筛查试验结果抗筛试剂红细胞R h -h rDCEceCWK e l lKkK p aJ saD u f f yF y aF y bK i d dJ k aJ k bⅠ++00+00+0n t 0++0Ⅱ+0++000+0n t ++++Ⅲ0++0++0n t++抗筛试剂红细胞L e w i sL e aL e bPP 1MN SMNSsL u t h .L u aC o l t .C o bX gX g a微柱凝胶法Ⅰ+0+0+0+00+0Ⅱ0+0+0+++0+0Ⅲ++++++注:0表示阴性;+表示阳性㊂表3 受检者吸收放散试验结果标本来源放散试验A 1cB c O c 患者2+00阴性对照注:0表示阴性;+表示阳性㊂2.3 A B O 基因启动子区甲基化检测 经B S P 检测A B O 基因启动子区部分序列的甲基化水平,待检测标本D N A 经亚硫酸氢盐试剂盒转化处理后甲基化的胞嘧啶不发生改变,经P C R 扩增和T A 克隆测序检测到该C G 位点仍为C G ;而未甲基化修饰的胞嘧啶则转化为尿嘧啶,经P C R 扩增和T A 克隆测序检测到该C G 位点转化为T G ㊂检测标本的甲基化率指检测区域中甲基化的C p G 数量与该区域C pG 总数量的比值㊂将A B O 基因启动子富含C p G 岛区域检测片段大小为175㊁160b p 序列进行TA 克隆测序㊂见图2~4㊂甲基化状态分析结果显示,患者标本AB O 基因启动子区甲基化率为66.7%,高于随机选取的5例正常对照组标本平均甲基化率(<25%),差异有统计学意义(P <0.05)㊂见图5㊂ 注:片段大小从下至上依次为100㊁250㊁500㊁750㊁1000b p 和2000b p;检测目的条带均同时检测内参质控带,内参为人类生长激素基因的保守片段,大小约为1000b p㊂图1 P C R -S S P基因分型注:箭头表示该C G 位点的C 为甲基化的碱基㊂图2 C pG 岛甲基化C G 位点㊃796㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n ,M a r c h 2024,V o l .21,N o .5注:箭头表示C G 位点的C 未被甲基化,C G 转化为T G ㊂图3 C pG 岛非甲基化C G位点 注:D Z 1㊁D Z 2㊁D Z 3㊁D Z 4㊁D Z 5为对照组标本,S C 为受检白血病患者标本;ʻ为非甲基化位点,Ә为甲基化位点;图中分别为患者标本和正常对照组标本A B O 基因启动子175b p 和160b p 区域甲基化状态分析情况㊂图4 患者A B O基因启动子区甲基化状态注:与正常对照组比较,aP <0.001㊂图5 患者标本与正常对照组标本甲基化情况比较3 讨 论白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病,由于发生病变的白细胞失去分化成熟的能力,停滞于其发育的不同阶段,进而引起患者骨髓和其他造血组织中病变细胞大量增殖积聚并浸润其他器官和组织,导致患者造血功能异常,出现病态造血而无法产生足量的正常血细胞,临床表现为贫血㊁出血㊁感染及各器官浸润症状,输血是白血病非常重要的辅助治疗手段之一[1-2]㊂在临床输血治疗过程中A B O 血型的正确鉴定尤为重要㊂人类A B O 血型抗原由A B O基因编码,A B O 基因位于人类第9号染色体的长臂,属于常染色体显性遗传,一般情况下不会发生变化[11]㊂有研究表明,急性髓系白血病患者处于其病情发作期可能出现红细胞血型抗原减弱㊁消失或变异,其原本的A B O 血型抗原无法正常检出,导致A B O 正/反定型不一致,极易引起血型误判,影响输血安全[12]㊂近年来,分子生物学基因分型技术㊁血型基因甲基化检测技术在A B O 疑难血型鉴定中的广泛应用,其将新技术与传统血型血清学鉴定技术相结合,可快速㊁准确地鉴定疑难A B O 血型,并且进一步合理解释疾病状态下抗原减弱的原因,为更加安全㊁合理地解决临床疑难血型鉴定问题提供了新思路㊂本例患者使用微柱凝胶法进行A B O 血型鉴定试验结果显示,正定型结果为O 型,反定型结果为A型,正反定型结果不一致㊂排除微柱凝胶卡㊁反定型试剂㊁离心设备运行及其他人为因素的干扰后采用试管法分别于室温㊁4ħ和37ħ条件下重复A B O 正反定型试验,结果显示,3个温度下正定型均为O 型,而反定型在4ħ时试管法可见A 1c 凝集,推测患者产生不规则抗-A 1抗体㊂微柱凝胶法进行不规则抗体筛查和试管法进行直接抗人球蛋白试验结果均为阴性,排除是自身抗体造成的A B O 正反定型不符[13]㊂结合患者处于白血病发作期,其A B O 血型鉴定正反定型不符可能是红细胞本身所致,经吸收放散试验后检出患者红细胞表面存在弱A 抗原㊂基于血液免疫学检测试验,由白血病疾病状态下导致受试者A 抗原减弱与A B O 亚型引起的红细胞抗原数量减少的试验检测结果较为相似,难以鉴别,需进一步结合其他检测技术加以鉴别㊂本研究使用分子生物学血型基因分型P C R -S S P 法进行检测,本例患者A B O 基因分型结果为A O 1,表型为A 型,即可排除A B O 亚型的可能,而其正定型结果为弱A 表型,有研究在髓系恶性肿瘤[4]㊁骨髓增生异常综合征[14-15]㊁急性髓系白血病[15-16]㊁慢性粒细胞白血病[17]㊁膀胱癌[18]和口腔癌[8,19]等患者中均检测到A B O 抗原减弱的现象,与本研究结果一致㊂目前,对于血型抗原减弱的确切原因尚未明确,且患者出现A B O 抗原减弱的现象不是持续的,在疾㊃896㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n ,M a r c h 2024,V o l .21,N o .5病缓解后还有可能恢复血型抗原表达[20]㊂推测为机体在白血病状态下的A B O基因表达调控机制发生了改变,而这种调控机制目前尚未明确㊂近年来,甲基化已成为肿瘤研究的热点,甲基化是一种表观遗传修饰方式,参与机体疾病状态下的基因表达调控㊂有研究发现,白血病患者A B O抗原减弱与D N A甲基化导致A B O基因沉默的关系更为密切[18]㊂基于此,推测患者A B O基因启动子区C p G岛甲基化状态的异常可能与其A抗原表达减弱有关㊂本研究对患者标本A B O基因启动子区175㊁160b p2个区域甲基化状态进行检测,结果显示,检测区域患者标本A B O基因启动子区甲基化率为66.7%,明显高于随机选取的5例正常对照组标本平均甲基化率(<25%),差异有统计学意义(P<0.05)㊂有研究表明,A B O基因启动子C p G岛甲基化程度与A B O抗原表达呈负相关,甲基化程度越高A B O基因表达越不活跃,从而导致A㊁B抗原表达均减少[5,8,18];且白血病患者存在不同程度A㊁B抗原减弱[21],与本研究结果一致㊂提示患者白血病状态下A B O基因启动子区甲基化程度增高可能与A B O抗原减弱之间存在较为密切的相关性,因机体抗原减弱的调控机制是多因素共同作用的结果,而A B O启动子甲基化导致的基因表达下调仅可能只是A B O抗原减弱的其中一个因素,其机制还需进一步探索㊂本研究结果提示,本例白血病患者在疾病发作期,其A B O基因启动子区甲基化状态异常可作为导致A B O抗原减弱的重要因素之一,从而干扰A B O正反定型鉴定㊂在临床输血实践中开展血清学疑难血型鉴定的同时进行分子生物学基因分型和血型基因甲基化检测可作为血清学方法的有效辅助手段,有效缩短了输血相容性试验检测时间,保障临床用血安全㊁合理㊁有效,为实现患者个体化血液管理㊁做到精准输血提供了新思路㊂参考文献[1]I MA I Y,MA R U Y,T A N A K A J.A c t i o n m e c h a n i s m s o fh i s t o n e d e a c e t y l a s e i n h i b i t o r s i n t h e t r e a t m e n t o f h e m a t o-l o g i c a l m a l i g n a n c i e s[J].C a n c e r S c i,2016,107(11):1543-1549.[2]B O Y I A D Z I S M,WH I T E S I D E T L.T h e e m e r g i n g r o l e so f t u m o r-d e r i v e d e x o s o m e s i n h e m a t o l o g i c a l m a l i g n a n c i e s [J].L e u k e m i a,2017,31(6):1259-1268.[3]张勇,刘剑荣,陈华良,等.1例疑难血型和疑难配血分析[J].实验与检验医学,2015,33(3):389-390.[4]B I A N C O T,F A R M E R B J,S A G E R E,e t a l.L o s s o f r e dc e l l A,B,a nd H a n t i ge n s i sf r e q u e n t i n m y e l o i d m a l ig n a n-c i e s[J].B l o o d,2001,97(11):3633-3639.[5]B I A N C O-M I O T T O T,HU S S E Y D J,D A Y T K,e t a l.D N A m e t h y l a t i o n o f t h e A B O p r o m o t e r u n d e r l i e s l o s 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1例正反定型血型不符患者的输血分析
摘要
1.1标本患者：张某，女，21岁，患系统性红斑狼疮病史5年，住院检测，红细胞
2.56×1012/L，血红蛋白5g/L，临床有胸闷气短发绀的表现，无输血史和妊娠史，临床医师申请AB型红细胞悬液2U。

1.2材料 3%—5%标准红细胞由上海血液生物医药有限责任公司提供，血型卡和抗人球蛋白卡由Diamed公司提供。

1.3血型定型和交叉配血结果见表1和表2。

表1 ABO正反定型结果
2 讨论
2.1根据正反定型分析，正定性AB型，反定型A型，说明患者的血型不应该是O型和B型，如果是亚型，正定性应该是O型，这样的话，患者的血型只能是A型，或者AB型，自身盐水对照阳性，说明患者自身血球有凝集反应。

2.2根据和A型供血者的交叉配血结果分析，主侧不凝集，次侧凝集，自身对照阳性，根据主侧不凝集，这说明患者的血型不能是B型和O型。

2.3根据和B型供血者的交叉配血结果分析，主侧凝集，次侧凝集，自身对照阳性，说明患者的血型不是B型。

2.4根据和O型供血者的交叉配血结果分析，主侧不凝集，次侧凝集，自身对照阳性，说明患者的血型可以是任何血型。

2.5根据和AB型供血者的交叉配血结果分析，主侧凝集，次侧凝集，自身对照阳性，说明患者的血型不是AB型。

综合以上分析，患者的血型只能是A型或者O型，如果患者是O型血，那么用A型血做交叉配血时，主侧应该是凝集的，根据和A型血做交叉配血的结果是主侧不凝集，所以患者的血型应是A型，给予患者A型血2U，缓慢输注，患者无任何不适，生命体征平稳，临床症状缓解，第二天重新复查血型，患者正反定型为A型。

ABO 血型鉴定测定原理根据红细胞上有或无 A 抗原或／和 B 抗原，将血型分为 A 型、B 型、AB 型及O 型4种。

可利用红细胞凝集试验，通过正、反定型准确鉴定ABO血型。

所谓正定型，是用已知抗—A 和抗—B 分型血清来测定红细胞上有无相应的A 抗原或／和B抗原；所谓反定型，是用已知A细胞和B细胞来测定血清中有无相应的抗—A或／和抗—B。

标本种类及收集要求1 受检者血清.2 EDTA2K抗凝血或未稍取血，受检者血液制成5 ％红细胞盐水悬液使用。

3 标本出现中度溶血者，为不合格标本，不能用于检测。

仪器、试剂、校准品、质控品、以及其他所需物品离心机，显微镜。

抗A、抗B血型定型试剂（单克隆抗体）：长春博德生物技术有限责任公司产品注册号：国药准字S1*******。

包装:抗A、抗B各1支/盒，塑料瓶，规格：10ml/支。

储存要求：2℃～8℃避光保存，主要成分：分泌抗人 A 型和抗人 B 型血型原单抗的杂交瘤细胞培养上清液并补加一定量小鼠腹水抗体。

0.9/%的生理盐水：山东齐都药业有限公司。

操作步骤：试管法1 取洁净小试管(内径10mm×60mm)3支，分别标明抗—A、抗—B和抗—A十B，用滴管分别加抗—A、抗—B 和抗—A 十 B 分型血清各l 滴（约50 ul）于试管底部，再以滴管分别加入受检者5％红细胞盐水悬液1滴，混和。

2 另取洁净小试管(内径10mm×60mm)3 支，分别标明A、B 和O 细胞。

用滴管分别加入受检者血清l 滴于试管底部，再分别以滴管加入A、B和O型5％试剂红细胞悬液l滴，混和。

3 立即以1000r／min离心3 min。

4 将试管轻轻摇动，使沉于管底的红细胞浮起，先以内眼观察有无凝集(或溶血)现象。

如内眼不见凝集，应将反应物倒于玻片上，再以低倍镜检查。

5 观察结果时既要看有无凝集，更要注意凝集强度，此有助于A、B亚型、类B 或cisAB的发现。

6 凝集强度判断标准4+ 红细胞凝集成一大块，血清清晰透明。

如果发现ＡＢＯ正反定型不一致应该怎么办？如果发现ＡＢＯ正反定型不一致应该怎么办？如发现ＡＢＯ正反定型不一致，首先要重复做试验一次。

严格执行操作规程，使用质量合格的试剂以及细心观察和解释试验结果，就可以解决问题。

对一些疑难问题必须进一步研究。

初步的检查步骤包括：（1）另从受检者取1份新鲜血液标本，这样可以纠正因污染或搞错标本造成的不符合。

（2）将红细胞洗涤数次，配成的3％～5％盐水细胞悬液用抗Ａ、抗Ｂ、抗Ａ1、抗Ａ、Ｂ及抗Ｈ做试验可以得到其他有用的信息。

（3）对受检红细胞做直接抗球蛋白试验，结果呈阳性表明红细胞已被抗体致敏。

（4）用Ａ1、Ｂ、Ｏ型红细胞及自身红细胞检查受检血清，如果怀疑是抗Ｉ，用Ｏ型（或ＡＢＯ相和的）脐血红细胞检查。

（5）如果试验结果未见凝集，应将红细胞及血清试验在室温（18～22℃）或4℃放置30分钟用显微镜检查核实。

（6）如疑为Ａ抗原或Ｂ抗原减弱，则可将受检红细胞与抗Ａ或抗Ｂ血清做吸收及放散试验，以及受检者唾液做Ａ、Ｂ、Ｈ血型物质测定。

（7）如试验结果红细胞呈缗钱状排列，加等渗盐水1滴混合，往往可使缗钱状消失。

（8）如受检者为Ａ型血而以为有类Ｂ抗原时，可用下列方法进行鉴别：①观察细胞与抗Ａ及抗Ｂ的凝集强度，与抗Ａ的反应要比与抗Ｂ的反应强，这种区别用玻片法试验更为明显。

②用受检者红细胞与自身血清做试验，血清中的抗Ｂ不凝集自身红细胞上的类Ｂ抗原。

③检查唾液中是否有Ａ、Ｂ物质，如果是分泌型,可检出Ａ物质而无Ｂ物质。

④核对病人的诊断，类Ｂ抗原的形成与结肠癌、直肠癌、革兰氏阴性细菌感染有关。

（9）如发现多凝集现象，应考虑有遗传产生的Cad抗原活性：被细菌酶激活的Ｔ或ＴＫ受体或产生机制不大明了的Tn受体所引起。

多凝集红细胞具有以下特点：①能被人和家兔的许多血清凝集。

②能与大多数成年人血清凝集，不管有无相应的同种抗体。

③不被脐带血清凝集。

④通常不与自身血清凝集。

⑤如有条件可用外源凝集素加以鉴别。

对ABO血型鉴定正反定型不符标准操作规程的建立及探讨ABO血型鉴定是临床血型鉴定中必不可少的部分。

准确的ABO血型鉴定结果对于输血、器官移植等临床操作具有重要意义。

正反定型不符是指血型鉴定的阴、阳性反应不能直接对应，这种情况可能会对临床诊断和治疗带来风险。

因此，建立并完善ABO血型鉴定正反定型不符标准操作规程是非常重要的。

一、建立标准操作流程1.标本采集和保存：采集新鲜的全血标本，并使用抗凝剂稳定血细胞。

2.血型鉴定试剂准备：准备正、反血型鉴定试剂，确保试剂在保质期内并适当储存。

3.正定型操作：将待测血清与正血型鉴定试剂混合，在37摄氏度下孵育，根据试剂说明书进行判读，记录结果。

4.反定型操作：将待测红细胞与反血型鉴定试剂混合，在37摄氏度下孵育，根据试剂说明书进行判读，记录结果。

5.结果解读：根据正、反定型试剂的判读结果，确定待测血型。

二、探讨正反定型不符的原因1.血型抗体：正反定型不符可能是由于患者血液中存在一些非ABO抗体引起的。

这些抗体可能是自然存在的，也可能是由于输血或妊娠等因素而导致的。

2.检测方法：检测方法的不准确或不规范也可能导致正反定型不符。

例如，试剂配制不当、试剂储存不当、操作人员技术不熟练等情况都可能影响结果准确性。

3.标本问题：标本质量差、污染或保存不当也可能导致不符结果。

因此，在标本采集和保存上需要严格控制。

三、对正反定型不符的处理1.重新操作：如果正反定型不符，可以尝试重新操作，确保操作的准确性和标本的质量。

2.进一步检测：对于较为复杂的正反定型不符情况，可以进行进一步的检测，如使用更敏感的试剂或进行酶解试验、直接抗人球蛋白试验等。

3.抗体鉴定：如果正反定型不符，可以对患者的血清进行抗体鉴定，以寻找可能存在的异常抗体。

四、实施质量控制措施1.核对操作：在操作过程中，需要进行核对，确保正确操作。

2.质控样本：使用质控样本进行质量控制，确保试剂和操作的准确性。

3.参与外部质量控制：参与外部质量控制活动，与其他实验室比对结果，提高实验室水平。