第五章自由基清除剂
本章要点
1.自由基理论的产生机理及来源
2.自由基对机体活动的影响
3.自由基清除剂的基本概念
随着生命科学的飞速发展，英国人Harman于1956年提出了自由基学说。该学说认为，自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因，其中的观点被越来越多的实验所证明。
自由基（Free radical）是人体生命活动中各种生化反应的中间代谢产物，具有高度的化学活性，是机体有效的防御系统，若不能维持一定水平则会影响机体的生命活动。但自由基产生过多而不能及时地清除，它就会攻击机体内的生命大分子物质及各种细胞器，造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。
近年来，国内外对自由基及自由基清除剂的研究十分活跃，在各类食品科学、生命科学及医学书籍上都有许多关于自由基及其清除剂的研究报道，自由基清除剂作为功能性食品的重要原料成分之一，通过人们日常消费的食品来调节人体内自由基的平衡，已受到食品营养学家的广泛重视。
第一节自由基理论
一、自由基的产生机理及来源
自由基又叫游离基，它是由单质或化合物的均裂（Homdytic Fission）而产生的带有未成对电子的原子或基团。它的单电子有强烈的配对倾向，倾向于以各种方式与其他原子基团结合，形成更稳定的结构，因而自由基非常活泼，成为许多反应的活性中间体。
人体内的自由基分为氧自由基和非氧自由基。氧自由基占主导地位，大约占自由基总量的95%。氧自由基包括超氧阴离子（O2－·）、过氧化氢分子（H2O2）、羟自由基（OH·）、氢过氧基（HO2－·）、烷过氧基（ROO·）、烷氧基（RO·）、氮氧自由基（NO·）、过氧亚硝酸盐（ONOO－）、氢过氧化物（ROOH）和单线态氧（1O2）等，它们又统称为活性氧（reactive oxygen species，ROS），都是人体内最为重要的自由基。非氧自由基主要有氢自由基（H·）和有机自由基（R·）等。
（一）自由基的产生
人体细胞在正常的代谢过程中，或者受到外界条件的刺激（如高压氧、高能辐射、抗癌剂、抗菌剂、杀虫剂、麻醉剂等药物，香烟烟雾和光化学空气污染物等作用），都会刺激机体产生活性氧自由基。
人体内酶催化反应是活性氧自由基产生的重要途径。人体细胞内的黄嘌呤氧化酶、髓过氧化物酶和NADPH氧化酶等在进行酶促催化反应时，会诱导产生大量的自由基中间产物。除酶促反应外，生物体内的非酶氧化还原反应，如核黄素、氢醌、亚铁血红素和铁硫蛋白等单电子氧化反应也会产生自由基。外界环境，如电离辐射和光分解等也能刺激机体产生自由基反应，如分子中的共价键均裂后即形成自由基。
自由基反应包含3个阶段，即引发、增长和终止阶段。反应之初，引发阶段占主导地位，反应体系中的新生自由基形成许多链的开端，反应物浓度高。引发后的扩展阶段为反应的主体，若起始有几个引发自由基在扩展阶段没有消失或增加，那么反应中就有几条链。随着反应的进行，体系中的反应物浓度越来越
低，自由基相互碰头的机会越来越多，反应速度就越来越慢，自由基越来越少，最后反应停止。由此可见，自由基反应动力学有别于普通的分子反应，自由基可以连续传递而出现连锁反应。
过氧化物作为引发剂可以使反应在较低温度下进行，如果反应体系中有自由基清除剂存在，它就能很快地捕捉自由基使扩散不能形成。活性强的自由基清除剂能阻止连锁反应的开始。因为氧分子与许多有机物反应时产生自由基，而自由基清除剂能捕捉过氧自由基而中断连锁反应，阻止有机物的氧化，所以自由基清除剂又称为抗氧化剂。
（二）自由基的来源
人体内特定的自由基有不同的来源。
超氧阴离子自由基（O2－·）在其中扮演着非常重要的角色，因为在反应顺序上其他许多活性中间产物的形成都始于与O2－·起作用。它是从黄嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶通过酶的一电子还原作用释放的氧产生的或由呼吸链裂解生成的。人体利用的氧气中约有1%～3%转化为O2－·。
过氧化氢分子（H2O2）也是一种重要的非自由基活性物，容易在活细胞中扩散。过氧化氢酶能有效地将其转变成水，生成氧自由基。
羟自由基（OH·）的活性最强，其半衰期估计为10-9秒，其产生后能迅速起反应。在射线等高能辐射下，通过体内水的均裂作用或经金属催化过程由内源的过氧化氢分子形成。紫外线能将过氧化氢分子分裂成两个羟自由基分子。
过氧基自由基的半衰期比较长，可达数秒，在生物系统中扩散的途径相当长。在脂质过氧化过程中，从多不饱和脂肪酸去掉一个氢原子开始，能形成过氧基自由基。羟自由基能启动这一反应过程。
脂质过氧化作用进一步产生烷氧自由基（RO·）和有机的氢过氧化物（ROOH），后者可能重排成为内过氧化物中间产物，然后分裂产生乙醛。
单线态分子氧（1O2）是另一种非自由基的活性物，可能是体内的组织暴露于光中形成的。其半衰期估计为10-6秒，具体时间取决于周围基质的性质。它能通过转移其激发态能量或通过化学结合与其它分子相互作用。单线态分子氧优先发生化学反应的靶为双键部位。
氧化氮自由基（NO·）也是一种很重要的自由基，它是精氨酸在酶作用下形成的一种信号化合物，能松弛血小管平滑肌，防止血小板的凝集，从而降低血压。也可通过激活参与初级免疫的巨嗜细胞而产生。它的半衰期为6～50秒，很容易与氧发生反应，反应产物NO2也是自由基。它还能与生物分子直接反应或与O2－·结合形成过氧亚硝酸盐（ONOO－）。NO·过多会产生细胞毒性。
二、自由基对机体生命活动的影响
自由基是体内各种生化反应的中间代谢产物，在人体的生命活动过程中，各种生化反应，不管是酶促反应还是非酶促反应，都会产生各种自由基。从自由基的化学结构可以看出，它含有未配对的电子，是一类具有高度化学活性的物质。在正常的情况下，体内自由基处于不断产生与清除的动态平衡之中，并在代谢中发挥着重要作用，参与一些酶和前列腺素的合成，增强白细胞吞噬活性，提高杀菌效果等。但是，如果自由基过多或清除过慢，则会对人体造成严重危害。
（一）自由基积极的生物学功能
自由基作为人体正常的代谢产物，对维持机体的正常代谢有特定的促进作用。这种促进作用主要表现在对机体危害物的防御作用。
1．增强白细胞的吞噬功能，提高杀菌效果
白细胞在吞噬细菌的过程中，对氧的消耗量激增，会产生大量的O2－·和H2O2，两者通过Haber-Weiss 反应还会进一步产生OH·，这些活性氧对病原菌都有很强的杀灭效果。OH·还可引发被吞噬细菌的不饱和脂肪酸降解，降解终产物丙二醛也是一种强力杀菌剂，足以致细菌死亡。
2．促进前列腺素的合成
前列腺素是人体内的一种重要的激素，它以花生四烯酸为前驱物质，经膜上多酶系统催化氧化生成，其生物合成途径中必须有氧自由基（OH·或O2－·）的参与。
3．参与脂肪加氧酶的生成
血小板脂肪加氧酶作用于花生四烯酸生成1，2-氢过氧化-5，8，11，14-碳四烯酸（12-HPETE）及其
他相关的化合物，该类化合物是一系列具有强生物学活性化合物（如白三烯）的前体。在HPETE形成过程中有活性氧自由基参与。
4．参与胶原蛋白的合成
胶原蛋白的前体称原胶原蛋白。原胶原蛋白中的脯氨酸和赖氨酸经羟化酶的羟化作用是原胶原蛋白合成的关键步骤。在此酶促羟化过程中，需要O2－·、H2O2、OH·或1O2等活性氧自由基的参与。
5．参与肝脏的解毒作用
机体对外来毒物的解毒作用主要在肝脏进行，解毒作用实质是在肝微粒体细胞色素P450催化下对各类毒物的羟化作用。一定剂量范围内的外来毒物可被羟化并排出体外而完成解毒作用，当剂量大时，机体受不住就会出现中毒。在肝解毒过程中，连接于细胞色素上的O2－·自由基是真正起羟化作用的物质。
6．参加凝血酶原的合成
凝血酶原是凝血酶的前体。在凝血酶原合成过程中，其前体蛋白质氨基端的10个谷氨酸残基经过酶促羧化作用转变为10个γ-羧基谷氨酸残基，形成凝血酶原。该羧化过程与氧自由基密切相关，没有氧自由基的参加，就不能形成凝血酶原。
7．参与血管壁松弛而降血压
NO·是精氨酸在酶作用下形成的一种信号化合物，还作为细胞松弛因子而松弛血管壁，降低血压。血管扩张剂（如乙酰胆碱等）启动一个钙调节受体，在NO·合成酶催化和NADPH参与下，氧化L-精氨酸的胍基生成NO·并释放到细胞外。接着活化可溶性鸟苷酸环化酶，使血管平滑肌与血小板中的cGMP水平增加，从而促进血管平滑肌松弛，抑制血小板凝聚和粘附到内皮细胞上。
8．杀伤外来微生物和肿瘤细胞
NO·和O2－·结合以后生成ONOO－阴离子，在略高于生理pH的碱性条件下相当稳定，从而允许其由生成位置扩散转移到较远的位置。一旦在低于生理pH的酸性条件下（病理条件下往往如此），ONOO－立即分解生成NO·和O2－·，这两种自由基的氧化性非常强，具有很大的细胞毒性，对于杀伤外来微生物和肿瘤细胞非常有意义。
然而，在生命活动中，由于经常受到各种外界不良因素的刺激，导致机体组织中的自由基数量往往过多，甚至对机体组织产生危害。
（二）自由基对生命大分子的损害
自由基具有高度的活泼性和极强的氧化反应能力，能通过氧化作用攻击体内的生命大分子，如核酸、蛋白质、糖类和脂质等，使这些物质发生过氧化变性、交联和断裂，从而引起细胞结构和功能的破坏，导致机体的组织破坏和退行性变化。
OH·是最活泼的自由基，也是毒性最大的自由基。它可和活细胞中的任何分子发生反应而造成损伤，而且反应速度极快，被破坏的分子遍及糖类、氨基酸、磷脂、核苷和有机酸等。
O2－·的毒性是机体发生氧中毒的主要原因，由它引起的损伤表现在使核酸链断裂、多糖解聚及不饱和脂肪酸过氧化作用，进而造成膜损伤、线粒体氧化磷酸化作用的改变及其他一系列的变化。
所有能产生O2－·的生物系统都能通过歧化反应生成H2O2，能使少数酶的-SH（巯基）氧化失活。因为H2O2能迅速穿过细胞膜，而O2－·不能，在细胞内的H2O2能与Fe2+或Cu2+ 离子反应生成OH·，另外紫外线也能使H2O2均裂生成OH·，这是H2O2毒性的真正原因。
1．自由基对核酸的损害
自由基作用于核酸类物质会引起一系列的化学变化。例如，氨基或羟基的脱除、碱基与核糖连接链的断裂、核糖的氧化和磷酸质键的断裂等。反应还会形成新的自由基，发生连锁反应，导致核酸碱基破坏，产生遗传突变，严重受损的不能修复，导致细胞死亡。
2．自由基对蛋白质的损害
自由基可直接作用于蛋白质，也可通过脂类过氧化产物间接作用于蛋白质而产生破坏作用。如过氧自由基（ROO·）可使蛋白质分子发生交联，生成变性的高聚物，其他自由基则可使蛋白质的多肽链断裂，并使个别氨基酸发生化学变化。更严重的是，自由基可改变酶蛋白的化学结构，导致酶生物活性的丧失。
3．自由基对糖类的损害
自由基通过氧化性降解使多糖断裂，如影响脑脊液中的多糖，从而影响大脑的正常功能。自由基使核
糖、脱氧核糖形成脱氢自由基，导致DNA主链断裂或碱基破坏，还可使细胞膜寡糖链中糖分子羟基氧化，生成不饱和的羰基或聚合成双聚物，从而破坏细胞膜上的多糖结构，影响细胞免疫功能的发挥。
4．自由基对脂质的损害
脂质中的多不饱和脂肪酸由于含有多个双键而化学性质活泼，最易受自由基的破坏，发生过氧化反应。磷脂是构成生物膜的重要部分，因富含多不饱和脂肪酸故极易受自由基破坏。膜中磷脂发生过氧化作用，会引起膜中蛋白质及酶的交联或失活，导致膜通透性的变化，严重影响膜的各种生理功能。亚细胞器膜磷脂所含的不饱和脂肪酸比质膜的还多，所以对过氧化反应更为敏感。如果细胞内线粒体膜被氧化受损，则会使能量生成系统受到影响。溶酶体膜若受到破坏则会释放出其中的水解酶系，会使细胞内多种物质水解，严重时甚至会造成细胞自溶，组织坏死。由此可见，若自由基对生物膜的破坏很严重，就会引起细胞功能的极大紊乱。
（三）自由基学说
人们根据对衰老机理的不同理解，提出了许多种衰老学说，主要有自由基学说、免疫功能下降学说、脑中心学说、代谢失调学说、生物膜衰老学说、脂褐素与衰老学说、衰老过程中基因淋巴因子及其基因表达改变的学说等。自由基学说能比较清楚地解释机体衰老过程中的种种症状，如老年斑、皱纹及免疫力下降等，是目前最有说服力的学说。
自由基学说认为，自由基的强氧化作用，损伤了机体的生命大分子，引起人体细胞免疫和体液免疫的功能减弱，最终导致免疫疾病的出现。其作用机理可概括为以下几个方面。
1．生命大分子的交联聚合和脂褐素的累积
自由基作用于脂质能发生过氧化反应，其氧化的终产物丙二醛等会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，形成脂褐素。由于脂褐素不溶于水，所以不能随着机体的代谢排出体外，在细胞内逐渐堆积。其颗粒呈圆形或椭圆形，直径约为1~5微米，颗粒大小会随年龄的增大而增大。老年斑就是由脂褐素在皮肤的堆积而形成的，老年斑的出现是人体衰老的一个明显的外表象征。另外，随着胶原蛋白的交联聚合，会使胶原蛋白溶解性下降、弹性降低及水合能力减弱，会导致皮肤失去张力，皱纹增多，老年骨质再生能力减弱等。脂褐素在脑细胞中的堆积，会出现记忆力的减退或使智力发生障碍，甚至出现老年性痴呆症。眼球晶状体长期暴露于光和氧中，极易发生脂质氧化损伤，导致视网膜模糊，引起白内障和老年黄斑变性。
2．器官组织细胞的破坏与减少
器官组织细胞的破坏与减少是机体衰老的症状之一。器官组织细胞破坏或减少主要是由于自由基引起的脂质过氧化而造成对细胞膜与细胞器膜的损害，改变了生物膜的结构与功能，影响了膜的通透性与流动性，从而导致了膜功能的紊乱，加快机体的衰老。
另外，自由基作用于核酸引起的基因突变改变了遗传信息的传递，导致蛋白质与酶的合成错误及酶活性的降低。自由基还可与膜上的酶发生作用，影响细胞正常生理功能的发挥。自由基通过对脂质的侵袭加速了细胞的衰老进程。这些结果的积累，造成了器官组织细胞的老化与死亡。
3．免疫功能的降低
免疫功能是指机体抵抗外来有害物质入侵的能力。人体内的免疫系统包括细胞免疫和体液免疫。自由基作用于免疫系统，会引起人体细胞免疫与体液免疫功能减弱，并使免疫识别力下降，免疫系统在攻击病原体和异常的细胞时，也侵犯了自身正常的细胞和健康组织而出现自身免疫性疾病。
有研究表明，弥散性硬皮病、系统性硬结、溃疡性结肠炎和成胶质病变等自身免疫性疾病往往伴有较多的染色体断裂现象，这类病人血液中有一种血清因子能够促进正常的淋巴细胞染色体发生断裂。自身免疫疾病的病变过程与自由基关系密切，其致病机理可能是由于特殊血清断裂因子的作用或细胞的氧化代谢而产生了大量的OH·和O2－·所致。
（四）自由基与疾病的关系
越来越多的临床和干预实验，以及来自基础研究的证据表明，自由基参与许多疾病的病理过程，从而诱发如心血管疾病、某些癌症、老年白内障和黄斑变性、某些炎症及多种神经元疾病。
1．自由基与心血管疾病
大多数心血管疾病的主要原因是动脉粥样硬化，是动脉壁的一种多因素疾病。自由基攻击动脉血管壁和血清中的不饱和脂肪酸使之发生过氧化反应而生成过氧化脂质，后者能刺激动脉壁，增加粥样硬化的趋
势。动脉硬化的程度与硬化斑中脂质过氧化程度呈正相关，血管内壁的蜡样物质就是脂质发生过氧化反应的直接证明。动脉粥样硬化的早期，在内皮下层间隙形成脂质沉淀，即所谓的脂肪条纹。随着年龄的增加，粥样硬化症呈增多的趋势，这与老年人动脉壁不饱和脂肪酸含量高，血清中Fe2+和Cu2+含量高，Fe2+或Cu2+通过Haber-Weiss反应促使OH·产生，OH·的存在加剧了脂质过氧化进程。过氧化产物丙二醛促使弹性蛋白发生交联，破坏了其正常的结构和功能，其应有的弹性与水结合能力丧失，最终产生了动脉硬化症，从而引起冠心病等其他心血管疾病。
2．自由基与癌症
致癌过程是一个复杂的多阶段的过程，包括诱发和促进两步。一个正常的细胞发生癌变必须经历诱发和促进这两个阶段，这就是两步致癌学说。
大量研究证明，诱发阶段与自由基关系密切，促癌阶段也与自由基有关，促癌能力与其产生自由基的能力相平行。致癌物必须在体内经过代谢活化形成自由基并攻击DNA才能致癌，抗癌剂也必须通过自由基形式去杀死癌症。
3．自由基与肺气肿
自由基作用于肺部的巨嗜细胞，使其释放了蛋白水解酶类而导致了对肺组织的损伤破坏，从而引起细支气管和肺泡管的破裂，肺泡间隔面积缩小，周围血液与肺之间气体交换量减少，导致肺气肿。
正常情况下，肺组织细胞间的蛋白酶与抗蛋白酶能够保持平衡，蛋白酶抑制剂控制着水解蛋白酶类的释放与活性。如果缺乏这种抑制剂，就有可能导致肺气肿。长期吸入香烟及其他大气中的污染物，会使肺中氧自由基增多，使水解蛋白酶增多和使水解蛋白酶的天然抑制剂失活，最终导致肺气肿的出现。
4．自由基与缺血后重灌流损伤
缺血所引起的组织损伤是致死性疾病的主要原因。有许多证据说明，在完全性缺血、缺氧时，组织损伤程度较轻，而在缺血后再灌注时，由于自由基的急剧增多而使组织损伤更加严重。
在缺血后重灌流状态下，细胞内的氧自由基主要来自黄嘌呤氧化酶，它是由前体黄嘌呤脱氢酶转变而来的。该脱氢酶广泛存在于各种组织细胞中，它是以NAD+为电子接受体，所以不产生自由基。当组织细胞缺血时，ATP生成量减少，导致细胞内能量不足，不能维持正常的离子浓度。于是，Ca++重新分布使得细胞内Ca++浓度增大，激活了一种蛋白酶而将脱氢酶不可逆地转化成氧化酶。另外，缺血使得细胞内ATP 减少，AMP增多，AMP又可逐步分解成次黄嘌呤，而次黄嘌呤是氧化酶的适宜作用底物。当重灌流时，氧分子重新进入组织，与组织中积累的次黄嘌呤和氧化酶发生反应，生成大量的活性氧自由基。这些活泼且有强氧化性的自由基使细胞膜脂质过氧化，使透明质酸和胶原蛋白降解，从而改变了细胞的结构与功能，造成组织的不可逆损伤。另外，在缺血组织中具有清除自由基的抗氧化酶类合成能力发生障碍，从而加剧了自由基对缺血后重灌流组织的损伤。
5．自由基与眼病
由自由基氧化损伤引起的视力损害，最常见的当数白内障和老年黄斑变性。
老年人由于全身机体的衰老使得眼球晶状体中自由基清除剂的含量与活性降低，导致对自由基侵害的抵御能力降低。许多事实表明，白内障的起因和发展与自由基对视网膜的损伤导致晶状体组织的破坏有关。
又由于眼晶状体长期暴露于光和氧中，所形成的活性氧类物质可能与晶体蛋白质起反应。受损的蛋白质可能聚合和沉淀，从而丧失原来的功能。视觉活性最高的视网膜组织易受损害，从而引起老年黄斑变性。
6．自由基与炎症
当局部氧量过少或外来病原菌侵袭时，大量多形嗜中性白细胞积聚在病变处。这些白细胞由特殊作用的代谢物激活，结合在膜上的NADPH2氧化酶被激活，氧化NADPH2成为NADP+，同时产生大量的O2－·。氧自由基一方面破坏病原菌和病变细胞，另一方面进攻白细胞本身而造成白细胞大量死亡，引起溶酶体酶的大量释放，进而杀伤组织细胞，造成骨、软骨的破坏，导致炎症和关节炎。
7．自由基与贫血
贫血的出现也与自由基有关。据研究表明，地中海贫血的病理变化包含红细胞膜的过氧化，膜上多不饱和脂肪酸含量减少，-SH转变成-S-S基团和维生素E含量减少。缺铁性贫血的病变过程也有自由基参与，因为此时红细胞的维生素E和过氧化酶含量减少，易被自由基破坏而缩短寿命。
8．自由基与癫痫
有关研究证明，癫痫活动伴有活跃的自由基反应。清除自由基，阻断自由基反应对癫痫的预防和治疗有一定作用。自由基反应在癫痫发生中的作用日益受到重视。
目前认为，老年性聋与自由基受损关系密切；自由基与糖尿病也有比较复杂的关系；大骨节病与克山病也有密切的关系。随着自由基理论的研究发展，许多人类重大疾病与自由基反应的关系正在逐步被揭示。自由基对人类健康的影响作用正在被更多的人所接受，越来越多的专家正在运用自由基理论，在确保人体健康方面的研究中取得较大的成果。
第二节自由基清除剂
一、自由基清除剂简介
自由基是人体正常的代谢产物，正常情况下人体内自由基是处于不断产生与清除的动态平衡中，人体内存在少量的氧自由基，不但对人体不构成威胁，而且可以促进细胞增殖，刺激白细胞和吞噬细胞杀灭细菌，消除炎症，分解毒物。但如果人体内自由基的数量过多，就会对生物膜和其他组织造成损伤，破坏细胞结构，干扰人体的正常代谢活动，引起疾病，加速人体衰老进程。
在长期的进化过程中，生命有机体内必然会产生一些物质能清除这些自由基，将它们统称为自由基清除剂（Scavenger）。
自由基清除剂是指能清除自由基或能阻断自由基参与的氧化反应的物质。自由基清除剂的种类繁多，可分为酶类清除剂和非酶类清除剂两大类。酶类清除剂一般为抗氧化酶，主要有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等几种。非酶类自由基清除剂一般包括黄酮类、多糖类、维生素C 、维生素E、β-胡萝卜素和还原型谷胱甘肽（GSH）等活性肽类。
自由基清除剂大多为抗氧化剂，通过清除作用降低活泼自由基中间体浓度，降低自由基连锁反应中扩展阶段的效率来控制自由基的生成。但有些抗氧化剂是通过抑制自由基引发剂（如某些金属元素）的产生而起作用的。自由基清除剂也不都是抗氧化剂，有些系统并未进行氧化作用。
自由基清除剂发挥作用必须满足三个条件：第一，自由基清除剂要有一定的浓度；第二，因为自由基活泼性极强，一旦产生马上就会与附近的生命大分子起作用，所以自由基清除剂必须在自由基附近，并且能以极快的速度抢先与自由基结合，否则就起不到应有的效果；第三，在大多数情况下，清除剂与自由基反应后会变成新的自由基，这个新的自由基的毒性应小于原来自由基的毒性才有防御作用。
这些自由基清除剂对维持机体的正常生命活动，保持健康起着重要的作用。但是，随着年龄的增长，机体内产生自由基清除剂的能力逐渐下降，从而减弱了对自由基损害的防御能力，使机体组织器官容易受损，加速了机体的衰老，引发一系列的疾病。为了防止此类现象的发生，可以人为地由膳食补充自由基清除剂，从而达到防御疾病、延缓衰老的目的。
二、酶类自由基清除剂
（一）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）
超氧化物歧化酶（SOD）是目前研究得最深入、应用得最广泛的一种酶类自由基清除剂。
1．种类、结构及分布
1968年，美国人McCord在Fridovich指导下，从牛红细胞中提取Cu·Zn的酶蛋白质，并发现它能催化O2－·歧化，所以把这种酶蛋白命名为超氧化物歧化酶，英文简称为SOD。
SOD存在于几乎所有靠氧呼吸的生物体内，包括细菌、真菌、高等植物、高等动物和人体中。SOD 是一类含金属的酶，按其所含金属辅基不同可分为含铜锌SOD（Cu·Zn-SOD）、含锰SOD（Mn-SOD）和含铁SOD（Fe-SOD）3种。
含铜锌金属辅基的Cu·Zn-SOD是最为常见的一种酶，主要存在于真核细胞的细胞质中或高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙中。在动物血液、牛肝、猪肝、牛心、豌豆、麦叶等动植物组织中均有存在，是目前应用最广泛的一类酶。该酶由两条肽链组成，每条肽链含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。
Fe-SOD主要存在于原核细胞中，一些真核藻类甚至高等植物如银杏、柠檬、番茄等组织内也有存在。此酶也由两条肽链组成，一般每个二聚体含有一个铁原子。
Mn-SOD主要存在于原核细胞和真核细胞的线粒体中，在植物的叶绿体基质、类囊体内也会存在，在人体肝脏中含量较高。此酶的纯品呈粉红色，由两条或四条肽链组成。
2．理化及生物学特性
SOD属酸性蛋白酶，对pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定。又由于SOD属于金属酶，其性质不仅取决于蛋白质，还取决于结合到活性部位的金属离子。三类SOD的活性中心都含有金属离子。如采用物理或化学方法除去金属离子，则酶活丧失；如重新加上金属离子，则酶活又恢复。
不同来源的Cu·Zn-SOD具有较高的同源性，它们的物化特性也很相似，据推测它们可能由同一原始酶进化而来。不同来源的Mn-SOD和Fe-SOD也具有相似的物理性质和较高的同源性，它们可能由另一原始酶进化而成。
SOD是生物体内防御氧化损伤的一种十分重要的金属酶，对氧自由基有强烈清除作用，特别对于超氧阴离子（O2－·），SOD可将其催化歧化而生成H2O2和O2，故SOD又称为清除超氧阴离子自由基的特异酶。
3．SOD的生理功能及应用
SOD作为功能性食品基料的生理功能主要有以下几方面。
（1）清除体内产生的过量的超氧阴离子自由基，保护DNA、蛋白质和细胞膜免遭O2－·的破坏作用，减轻或延缓甚至治愈某些疾病，延缓因自由基损害生命大分子而引起的衰老现象，如延缓皮肤衰老和老年斑的形成等；
（2）提高人体对自由基外界诱发因子的抵抗力，增强机体对烟雾、辐射、有毒化学品及医药品的适应性；
（3）增强人体自身的免疫力，提高人体对自由基受损引发的一系列疾病的抵抗力，如炎症、肿瘤、白内障、肺气肿等，治疗由于免疫功能下降而引发的疾病；
（4）清除放疗所诱发的大量自由基，从而减少放射对人体其他正常组织的损伤，减轻癌症等肿瘤患者放化疗时的痛苦及副作用；
（5）消除疲劳，增强对剧烈运动的适应力。
因此，具有清除自由基功能的SOD就成为医学、食品和生命科学等领域研究的热点。
目前，SOD已广泛地应用于人们生活的各个方面。如深受女性消费者喜爱的化妆品中有大宝SOD、康妮SOD 、SOD 康舒达霜剂等。SOD添加于化妆品有明显的防晒效果和抗炎作用，可有效防止皮肤受电离辐射（如紫外线）的损伤。
SOD在医疗上的应用更是不胜枚举，它尤其对治疗关节炎和类风湿性关节炎疗效显著。此外，SOD 对治疗癌症、缺血后重灌流损伤、肺气肿、白内障、糖尿病、贫血等疾病均有疗效。
SOD在食品方面的应用也极为广泛，可作为功能性食品的功能因子或食品营养强化剂，有良好的抗衰老、抗炎、抗辐射、抗疲劳等保健强身的效果。国外把SOD作为食品添加剂应用到口香糖和饮料中。国内也开发出了多种强化SOD的食品，如SOD雪糕、SOD豆奶、SOD啤酒、SOD果汁饮料、SOD的酸奶和SOD口服液等。还可用富含SOD的原料加工制成功能性食品，如大蒜饮料、刺梨SOD汁等。在人们越来越注重健康饮食的今天，SOD将成为功能食品中的活跃分子。
然而，SOD作为一类高分子抗氧化酶，分子量在32000道尔顿以上，又都带有金属辅基，且其来源大多从动物血（猪血、牛血）和动物脏器以及某些微生物中制备而来，多为生物种属差异很大的异源性蛋白。因此，在应用上，它除了具有严格的针对性和有效性外，必然也有很大的局限性。SOD应用的局限性归纳起来主要有8个方面：
（1）半衰期短。SOD的体内半衰期为6～8分钟，体外半衰期（25℃时）为9～10天。因此，体内注射表现为多次数、少浓度，体外涂抹则表现为高剂量、低效应；
（2）代谢速率快。SOD在体内代谢速率极快，注射6小时后，90%以上的大分子SOD经降解为小分子而随泌尿系统排泄；
（3）酶分子量大，均在32000以上。其中，原核细胞Mn-SOD分子量为40000；真核细胞线粒体Mn-SOD
都由9个相等亚基组成，其分子量为80000。因此，透皮或透膜吸收困难，体内或细胞内作用弱；
（4）酶制剂不宜口服，口服易被胃酸变性、胃蛋白酶和胰蛋白酶水解破坏，且SOD分子原形不易透过肠粘膜，因而难以发挥全身性药效作用；
（5）大分子异性蛋白，不宜大剂量、长时间使用，否则会不可避免地出现某些过敏性变态反应，呈现明显的不良反应性变化；
（6）对靶细胞或靶部位的亲和力低，药用趋向性不明显。因此，对疾病的疗效缺乏特异性作用；
（7）酶的稳定性不高，对理化因素较为敏感，过高温度、过大剂量辐射、过长时间超声波、过强酸碱度、过多化学物质及变性剂、还原剂等均易导致SOD分子结构改变，酶活性丧失，形成不可逆性变化；
（8）药物作用单一性大、常规剂量单独使用疗效欠佳。
针对SOD应用过程中客观存在的局限性，国内外学者进行了大量卓有成效的研究工作，并已逐步探索或寻找出解决上述局限的一些有效方法和对策。
4．SOD的制备
SOD广泛存在于动、植物和微生物体内，但目前我国主要是从动物血液中提取。受到血源和得率的限制，影响了SOD的生产成本和推广应用。
由于利用微生物（深红酵母）生产SOD具有易培养、易大规模工业化生产、不受季节与自然条件限制等优越性，因此，微生物SOD的生成具有更广阔的发展前景。其工艺流程如下：
菌体培养→破壁→菌体破片→Rnase酶解、离心30分钟→清液→上DE32柱→0.2mol/L NaCl洗脱→洗脱液→加45%（NH4）2SO4、离心→上清液→上DE32柱→洗脱→洗脱液→浓缩→冷冻干燥→SOD成品。
破菌的方法可采用超声波处理法、酶裂解法、细胞自溶法、氯仿-乙醇法和甲苯法等。根据有关的研究表明，用甲苯法破壁对提取酵母SOD具有一定的优越性。另外，为了提高SOD纯度，在洗脱时可采用梯度洗脱法。
5．SOD的纯度检查
SOD产品一般为浅绿色冻干粉，其纯度的检查主要根据以下三个指标。
（1）均一性
通常用聚丙烯酰胺凝胶电泳检查其均一性。也可用琼脂糖凝胶电泳，其操作简单，试剂单一且色带的间隔比前者大，更易观察与分析。还可进行超离心分析来检查其均一性。
（2）酶的比活
要求达到一定的标准。如：化妆品用SOD比活≥3000u/mg蛋白质；口服用SOD比活≥3500u/mg蛋白质；标准（活性测定用）及药用SOD比活≥5000u/mg蛋白质；试剂用SOD（电泳纯）比活≥8000u/mg 蛋白质。
（3）酶的重要理化性质
最重要的是金属离子含量（常采用原子吸收分光光度法测定）、氨基酸含量和吸收光谱。如Cu·Zn –SOD 中1分子的酶必须含有相当于两原子Cu和两原子Zn；虽然不同来源的酶所含的氨基酸不完全一致，但仍然显示一定的规律；三种SOD都有特定的吸收光谱，观察纯酶的吸收光谱有助于判断SOD的纯度。
6．SOD的（活性测定）分析方法
一般分为直接法和间接法两大类。
直接法往往需要操作复杂、价格昂贵的仪器，在一般试验室无法使用。间接法需借助超氧自由基产生剂和超氧自由基清除指示剂两种物质。其中常用的产生剂包括最早使用的黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶、邻苯三酚及近年发展起来的非酶体系的NADH-PMS、核黄素-TEMED、碱性二甲基亚砜、HXT-01050；清除指示剂则有最早发现的细胞色素C、NBT，到近年来的鲁米诺和MTT等。
间接法中比色法最为常用，如黄嘌呤氧化酶-细胞色素C法和邻苯三酚自氧化法。这两种最为普及的方法多年来不断得到改进，其灵敏度也不断得到提高。另外，近年来新建立了多种方法，如化学发光法、光化学法、极谱氧电极法、免疫法等。其中化学发光法与极谱氧电极法由于方法简便、灵敏度高，受到人们的青睐。
（1）黄嘌呤氧化酶（XO）- 细胞色素C法
国外多以该法测定SOD活性。在SOD被发现之初就是利用此法进行测定的，又称之为McCord法，被认为是间接法中的经典方法。酶活性单位定义为：在一定条件下，3ml反应液中，每分钟抑制氧化型细胞色素C还原率达50%的酶量定为一个活力单位。
McCord法灵敏度较低，但采取以下措施可得到提高:
①用乙酰化细胞色素C替代细胞色素C，可将灵敏度提高一倍，而且使测定结果不受样品中细胞色素C氧化酶的影响；
②将pH7.8，0.05mo1/L磷酸缓冲液换成pH10.2的碳酸缓冲液，并将黄嘌呤浓度从0.05 mmo1/L 增至
0.10 mmo1/L ，灵敏度可提高10倍；
③预先将黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶溶液在25℃下保温10分钟，使O2－·产量达到稳定程度，即O2－·产生率与其自动歧化率达到平衡，灵敏度增加可高达710倍；
④利用FP9平行分析仪可进行半自动分析，快速、简便，可以同时测定多个样品。
（2）邻苯三酚自氧化法
国外多使用经典的邻苯三酚自氧化法（简称Marklund法），Marklund法是采用420nm处光吸收测定。酶活力定义为：在一定条件下1ml的反应液中，每分钟控制邻苯三酚在420nm波长的自氧化速率达50%的酶量定为一个活力单位。
该方法经过不断改进，操作更为简便、灵敏度更高。如将吸收波长由420nm改用325nm，测试灵敏度提高了6.4倍，称为微量邻苯三酚自氧化法，同时将邻苯三酚耗量减少一半；
Marklund法的另一缺陷是呈色反应与光吸收值的测定必须同步进行，因此样品池必须保持恒温，且不能同时处理多个样品。通过使用二硫苏糖醇（DTT）或L-抗坏血酸（VC ）作为终止剂，使反应暂时停止，使A420在一定时间内保持恒定，可同时测多个样品，有较高的重复性和回收率。同时，终止剂既不参与，也不影响邻苯三酚的呈色反应，自氧化曲线与经典法的相吻合，最大抑制百分比和灵敏度也基本一致。
另外，为消除HCl对SOD的抑制作用，改用K2HPO4- KH2PO4缓冲液替代Tris - HCl缓冲液，灵敏度可提高50%。
（3）化学发光法
化学发光法依据的原理是：O2－·可与化学发光剂鲁米诺（luminol）反应，产生激发态产物，当其迅速返回基态时，即发出光。SOD可消除O2－·，从而使发光强度降低，SOD浓度与发光百分率在一定时间内呈线性关系。活力单位定义为：在一定条件下，使每毫升反应液于1分钟末发光率被抑制50%的酶量作为一个酶活力。
同传统的比色法相比较，化学发光法专一性较强，其他干扰因素少，灵敏度高，最适用作粗提取液中SOD活性的检测。
（4）极谱氧电极法
比色法测定的呈色反应往往不稳定，因此测定结果波动很大。极谱氧电极法利用了系统产生O2－·过程中消耗O2，一定量的SOD又会使O2－·歧化产生O2，从而使耗氧量减少的特性，使用极谱氧电极仪精确测出耗氧量而推算出酶活。SOD活力单位定义为：25℃，pH8.4，使每分钟产生1μl O2的SOD量定为1个酶活力单位。
该方法利用了O2张力的变化，与所用试样的物理状态如澄清度、是否胶体或悬浊液、有无颜色等无关，尤其适用于各种组织匀浆。而且由于直接测定O2量，方便、快速、微量化、灵敏度高、重复性好，且可自动连续记录酶作用过程的变化。
除了以上几种方法，其他方法如光化学法（正染法）等方法也都得到不断的改进；而灵敏度、特异性均高于一般化学法的免疫法在医学上也得到应用，并取得了很好效果。同时计算机也开始用于SOD的活性分析，并有用于SOD酶活力线性分析的专用软件，可适用于各种产O2－·系统、各种清除剂系统及不同的酶提取液的活力测定。
（二）过氧化氢酶（catalase，CAT）
过氧化氢酶是另一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。CAT 作用于过氧化氢的机理实质上是H2O2的歧化，必须有两个H2O2先后与CAT相遇且碰撞在活性中心上，才能
发生反应。H2O2浓度越高，分解速度越快。
几乎所有的生物机体都存在过氧化氢酶。其普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网、动物的肝和红细胞中，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理。
CAT是红血素酶，不同的来源有不同的结构。在不同的组织中其活性水平高低不同。过氧化氢在肝脏中分解速度比在脑或心脏等器官快，就是因为肝中的CAT含量水平高。
自1937年首次推出作为细胞内结晶化酶之一的牛肝过氧化氢酶之后，已利用不同方法（选择性沉淀法和层析法）从牛、马或人的红细胞、肝和肾中提纯过氧化氢酶。从不同机体分离出的大多数过氧化氢酶的分子量为240kDa，并具有4个相同的亚单位，在其活性部位各含一血红素基团。来自哺乳动物以及某些真菌和细菌的过氧化氢酶还含有4个紧密结舍的NADPH分子，但其功能尚有争议。
常用的CAT酶活性测定方法有以下几类：
（1）分光光度法包括钼酸铵比色法、紫外速率直接法和改良比色法等。其中改良比色法简便，快速，显色稳定，重复性好，不需特殊试剂及仪器设备，适合一般实验室采用，但生物样品常会造成干扰；
（2）化学发光法鲁米诺（luminol）在一定条件下与H2O2及Co2+等金属离子共存时发出强烈的蓝光，当样品中有CAT存在时，基质的H2O2将被分解，由H2O2所引起的化学发光强度减弱，由此计算总CAT酶活性。化学发光法易受试剂配制、操作技术和条件及测定时间等多种因素影响，但经过方法改进，可排除各种不良因素对测定的影响，是一种简单灵敏、重复性好、特异性也较高的化学发光技术测定方法；
（3）极谱法溶液中两个电极间加以一定的电压（极化电压）后产生可测电流，极谱法是应用氧电极，通过测量这种电解电流量以测定溶质的方法。当反应体系中含有一定浓度的过氧化氢时，加入一定量的含有过氧化氢酶的样品，过氧化氢就被分解而产生氧气，记录仪上可显示出反应室中氧量增加，增加的程度与加入液体中酶的活性成正比。该方法广泛用于生化方面的研究工作；
（4）滴定法包括:①过硼酸盐底物法：在中性水溶液中，CAT催化过硼酸盐还原成硼酸盐，同时释出氧。经过一定时间后，加入硫酸使酶失活，以中止反应，用高锰酸钾溶液滴定残存的过硼酸盐，结果反映CAT活性；②过氧化氢滴定法；一定量的细菌同一定量的H2O2发生反应，经过一定时间后加酸中止反应，然后用高锰酸钾滴定剩余的H2O2量，从而测定细菌过氧化氢酶的活性。
（5）检压测定法在一定pH的缓冲液中，过氧化氢酶作用于过氧化氢释出氧气。此反应非常迅速、剧烈，在不断搅拌、震荡及减压的条件下，所产生的氧气得以迅速逸出溶液，在一定容量的容器内产生压力变化，压力变化数值可换算成产氧量，用来表示样品过氧化氢酶的活性。
（三）谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）
谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是在哺乳动物体内发现的第一个含硒酶，它于1957年被Mills首先发现，但直到1973年才由Flohe和Rotruck两个研究小组确立了GPX与硒之间的联系。
研究表明，硒是谷胱甘肽过氧化酶（Se-GPX）的活性成分，是GPX催化反应的必要组分，它以硒代半胱氨酸（Sec）的形式发挥作用，摄入硒不足时使Se-GPX酶活力下降。在体内处于低硒水平时，活力与硒的摄入量呈正相关，但到一定水平时，酶活力不再随硒水平上升而上升。Se-GPX存在于胞浆和线粒体基质中，它以谷胱甘肽（GSH）为还原剂分解体内的氢过氧化物，能使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，并使过氧化氢分解成醇和水，因而可防止细胞膜和其它生物组织免受过氧化损伤。它同体内的超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）一起构成了抗氧化防御体系，因而在机体抗氧化中发挥着重要作用。
机体在正常条件下，大部分活性氧被机体防御系统所清除，但当机体产生某些病变时，超量的活性氧就会对细胞膜产生破坏。机体消除活性氧O2－·的第一道防线是超氧化物歧化酶（SOD），它将O2－·转化为过氧化氢和水，而第二道防线是过氧化氢酶（CA T）和GPX。CAT可清除H2O2，而GPX分布在细胞的胞液和线粒体中，消除H2O2和氢过氧化物。因此，GPX、SOD和CAT协同作用，共同消除机体活性氧，减轻和阻止脂质过氧化作用。
GPX广泛存在于哺乳动物的组织中，不同种类的GPX其分子量和比活性也有所不同。谷胱甘肽是此酶的特异性专一底物，而氢过氧化物则是非专一性底物。
GPX的活力测定常采用5，5′-二硫代对二硝基苯甲酸（DTNB）法，用单位时间内催化GSH氧化的减少量表示。GSH可和二硫代对二硝基苯甲酸（DTNB）反应生成黄色的5-硫-2,2-硝基苯甲酸阴离子，在
412nm处有最大光吸收，测定该离子的浓度，即可计算出GSH减少的量。由于上述反应在非酶条件下仍能进行，故计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少量。
三、非酶类自由基清除剂
（一）维生素类
维生素不仅是人类维持生命和健康所必需的重要营养素，还是重要的自由基清除剂。对氧自由基具有清除作用的维生素主要有维生素Ｅ、维生素Ｃ及维生素Ａ的前体β-胡萝卜素。
维生素Ｅ又称为生育酚，是强有效的自由基清除剂。它经过一个自由基的中间体氧化生成生育醌，从而将ROO·转化为化学性质不活泼的ROOH，中断了脂类过氧化的连锁反应，有效地抑制了脂类的过氧化作用。维生素Ｅ可清除自由基，防止油脂氧化和阻断亚硝胺的生成，故在提高免疫能力，预防癌症等方面有重要作用，同时在预防和治疗缺血再灌注损伤等疾病有一定功效。
维生素Ｃ又称为抗坏血酸，在自然界中存在还原型抗坏血酸和氧化型脱氢抗坏血酸两种形式。抗坏血酸通过逐级供给电子而转变成半脱氢抗坏血酸和脱氢抗坏血酸，在转化的过程中达到清除O2-·、·OH、ROO·等自由基的作用。维生素Ｃ具有强抗氧活性，能增强免疫功能、阻断亚硝胺生成、增强肝脏中细胞色素酶体系的解毒功能。人体血液中的维生素Ｃ含量水平与肺炎、心肌梗塞等疾病密切相关。
β-胡萝卜素广泛存在于水果和蔬菜中，经机体代谢可转化为维生素Ａ。β-胡萝卜素具有较强的抗氧化作用，能通过提供电子，抑制活性氧的生成，从而达到防止自由基产生的目的。许多试验表明，β-胡萝卜素能增强人体的免疫功能，防止吞噬细胞发生自动氧化，增强巨噬细胞、细胞毒性Ｔ细胞、天然杀伤细胞对肿瘤细胞的杀灭能力。在多种食品中，β-胡萝卜素与不饱和脂肪酸的稳定性密切相关。
有实验证明老年人摄入维生素C以及维生素E可以增进多项免疫功能，维生素C-E联合物还可清除血液中的自由基等有害物质和循环应激激素。除此之外，维生素C、维生素E以及?胡萝卜素等抗氧化性维生素可以延缓老龄化进程，还可以预防和治疗许多老年疾病，如动脉粥样硬化、高血压、心脏病和脑卒中等，这些疾病都与低密度脂蛋白胆固醇的氧化有关。
维生素C还能有效保护维生素E和?-胡萝卜素不被过早消耗。每天摄入500毫克维生素C可以帮助高血压患者降低血压。摄入维生素E不但可增强老年人的记忆力、预防老年痴呆症及治疗受自由基所累的迟缓型运动障碍，还可预防前列腺癌的发病、抑制消化道肿瘤（尤其是肠癌），并降低其死亡率。短期、大剂量地肠内补充维生素E 还可调整单核细胞、巨噬细胞对内毒素的反应，提高维生素E对于败血症、缺血再灌注损伤均能起到保护性的治疗作用。
健康人可以通过日常均衡的膳食摄取充足的维生素，但在机体受到感染、体力活动增加、服用特殊药物、体液大量丢失及妇女怀孕和哺乳等情况下，机体对维生素的需求大大增加，不额外补充，则易导致维生素缺乏，自由基损伤机体，诱发或加速其他疾病。
（二）黄酮类化合物
黄酮类化合物泛指两个苯环通过中央三碳链相互联结而成的一系列C6-C3-C6化合物，主要是指以2-苯基色原酮为母核的一类化合物，在植物界广泛分布。黄酮是具有酚羟基的一类还原性化合物。在复杂反应体系中，由于其自身被氧化而具有清除自由基和抗氧化作用。其作用机理是与Ｏ2-·反应阻止自由基的引发，与金属离子螯合阻止·OH的生成，与脂质过氧化基ROO·反应阻断脂质过氧化。
黄酮及其某些衍生物具有广泛的药理学特性，包括抗炎、抗诱变、抗肿瘤形成与生长等活性。黄酮在生物体外和体内都具有较强的抗氧化性，具有许多药理作用，对人的毒副作用很小，是理想的自由基清除剂。目前已发现有4000多种黄酮类化合物，可分为如下几类：黄酮、儿茶素、花色素、黄烷酮、黄酮醇和异黄酮等。
很多常用中草药的活性成分是黄酮类化合物，其提取物芦丁、芒果甙、青兰甙、双氢青兰甙、芸香甙、橙皮甙和黄苓甙等均已应用于临床。以黄酮类化合物为主要成分的银杏叶提取物（EGB）已被广泛应用于医药和功能性食品行业。研究表明：EGB在治疗心血管疾病，调节血脂水平，治疗脑供血不足和早期神经退行性病变等方面有良好的疗效。另外，很多天然药物或食物中的某些功效成分，同样对氧自由基具有清除作用，如丹参中的丹参酮，黄苓中的黄苓甙，五味子中的五味子素，黄芪中的黄芪总黄酮、总皂甙、黄芪多糖，灵芝、云芝、香菇、平菇等菇类的多糖，甘草中的甘草酸，竹叶（紫竹、高节竹、金毛竹、花哺
鸡竹、红哺鸡竹、斑竹等）中的黄酮类组分，麦麸中的膳食纤维等。而另外一些天然食物如坚果、葡萄的皮和籽、薯类、蜂胶等，虽然未能确定其起作用的功效成分，但仍可通过试验揭示其对氧自由基有明显的清除作用。
儿茶素是从茶叶中提取出来的多酚类化合物-茶多酚（Tea Polyphenols，简称TP）的主体成分，约占茶多酚总量的60%～80%，茶干重的12%～24%。作为茶多酚中含量最高、药理作用最明显的组分，已引起了广泛的重视。大量体外实验及动物试验证实，儿茶素具有抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、防辐射、防龋护齿、抗溃疡、抗过敏及抑菌抗病毒等作用，是一种优良的天然抗氧自由基清除剂。茶多酚溶液清除羟自由基活性大于VC溶液。茶多酚为羟自由基清除剂，茶多酚的主要成分儿茶素在清除自由基过程中扮演了重要的角色。大量的研究表明：儿茶素氧化聚合物也是一种有效的自由基清除剂和抗氧化剂，具有抗癌、抗突变、抑菌、抗病毒，改善和治疗心脑血管疾病，治疗糖尿病等多种生理功能。其在食品、医药保健等领域的作用越来越突出。作为儿茶素氧化聚合物的茶色素治疗冠心病的作用机制在于提高SOD活力和降低MDA含量，削弱脂质过氧化作用，增加供氧和供血能力。茶色素对高血压的预防和缓解作用也是通过提高SOD活力、增强机体的抗氧化能力而实现的。
原花青素是一种多酚类化合物，这种化合物在酸性介质中加热均产生花青素，故将这类物质命名为原花青素。原花青素是由不同数量的儿茶素或表儿茶素缩合而成，分二聚体、三聚体直至十聚体。二至四聚体为低聚体，五聚体以上为高聚体，其中二聚体分布最广。原花青素是一种天然有效的自由基清除剂，主要存在于葡萄、苹果、可可豆、山植、花生、银杏、花旗松、罗汉柏、白杨树、刺葵、番荔枝、野草萄、高梁等植物中。此外，葡萄汁、红葡萄酒、苹果汁、巧克力和啤酒中也含有原花青素。原花青素多为水或乙醇提取物，少数经离子交换纯化，用冷冻或喷雾干燥成淡棕色粉末，味涩，略有芳香。分离后的原花青素二聚体、三聚体可以清除各种氧自由基，从而具有抗氧化、降血压、抗癌等多种药理活性，能增强免疫、抗疲劳、延缓衰老等功效。
异黄酮类作为一种有效的抗氧化剂国内外已有很多报道。大量实验研究结果表明：异黄酮是一种有效的抗氧化剂和自由基清除剂。
（三）微量元素
除了上述的各种酶及维生素类、黄酮类化合物，许多微量元素也起到清除自由基的作用。
1.硒
硒是一种非常重要的微量元素，是硒谷胱甘肽过氧化酶的活性成分，Se-GPX存在于胞浆和线粒体基质中，能使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，并使过氧化氢分解成醇和水，摄入硒不足时使Se-GPX酶活力下降，在体内处于低硒水平时，Se-GPX活力与硒的摄人量呈正相关，但到一定水平时，酶活力不再随硒水平上升而上升。有人曾对糖尿病大鼠补充硒和维生素E，其GPX和超氧化物歧化酶（SOD）活性均有不同程度增加，而脂质过氧化产物丙二醛含量随之下降，可能是因为抗氧化酶蛋白与葡萄糖的糖化反应受到硒和维生素E的抑制而使抗氧化酶活性得到保护。另外，高糖环境中增加的糖基化蛋白会自动氧化产生大量自由基，而引起一系列连锁氧化过程，硒和维生素E的抗氧化性可阻断这一过程中的某些环节。
2.锌
锌在清除自由基的过程中也起到很重要的作用。锌能减少铁离子进入细胞并抵制其在羟自由基引发的链式反应中的催化作用，锌也能终止自由基引起的脂质过氧化链式反应。锌可与铁竞争从而抑制了脂质过氧化的多个环节，它们通过竞争与膜表面结合的位点，可使铁复合物产生减少，通过Hater-Weiss反应产生·OH减少，造成脂类转变为活性氧的链式反应被抑制。缺锌还可以显著降低GPX的活性。由于锌可以激活体内的GPX，锌缺乏使体内有活性的GPX数量减少，也由于锌缺乏导致的过氧化脂质生成增多，而使GPX消耗增多，导致其活性下降。锌还有稳定细胞膜的作用，由于锌与红细胞膜结合，抑制了膜脂质过氧化过程中所产生的自由基，从而降低了自由基对膜的损伤。锌作为超氧化物歧化酶的辅酶，催化超氧离子发生歧化反应。锌缺乏可以显著降低Cu/Zn-SOD的活性，而使Mn-SOD活性代偿性升高。但当缺锌严重时，Mn-SOD活性的代偿性升高仍然对自由基有抑制作用，且随浓度增加而抑制增强。锌可以诱导体内硫蛋白的产生而抵制自由基的损害，锌与抗氧化剂鳌合，其抗氧化作用增强。
3.铜
Cu/Zn-SOD的活性中心是铜，铜蓝蛋白中含有血清铜的大部分，是细胞外液重要的抗氧化剂。铜蓝蛋白的抗氧化作用主要是防止过渡金属Fe2＋和Cu2＋催化H2O2形成·OH。铜蓝蛋白具有铁氧化酶的活力，能将Fe2＋氧化成Fe3＋，防止Fenton反应的发生。
4.铁
铁是过氧化氢酶（CA T）的活性中心，体内三分之二的铁存在于血红蛋白中，血红素缺乏，CA T活性下降。但活性铁是脂质过氧化的催化剂，脂质过氧化启动反应所产生的脂烷基与氧反应，产生脂烷过氧基。这些自由基再度作用于脂质，使反应以链式不断进行，脂质过氧基的性质非常活跃，而造成细胞成分的损害。
5.锰
锰是体内多种酶的组成成分，与体内许多酶的活性有关。锰与铜同样是超氧化物歧化酶（SOD）的重要组成成分，在清除超氧化物、增强机体免疫功能方面产生影响。Mn-SOD是体内自由基清除剂。对人来说，胚胎和新生儿体内的Mn-SOD含量高于成年人，随着机体衰老，其含量逐步下降。老年色素斑中脂褐素在细胞内的形成和聚集与Mn-SOD有关。因此，锰的抗衰老作用主要与体内Mn-SOD有关。
6.锗
有机锗能降低脂质过氧化，保护细胞质膜，降低血浆、肝、脑等组织中过氧化脂质水平。
（四）类胡萝卜素
四、富含自由基清除剂的食品
随着人们对自由基理论的了解，越来越多的人开始关注能够清除自由基的功能食品。食品专家们也对此进行了积极的研究和探索。目前，对此类食品的研究大致有两个方向。一是从天然动植中提取有效成分，添加于各种饮料或固态食品中作为功能性食品的功能因子或食品营养强化剂。目前已有添加SOD的蛋黄酱、牛奶、可溶性咖啡、啤酒、白酒、果汁饮料、矿泉水、奶糖、酸牛乳、冷饮类等类型的功能性食品面市。二是利用微生物发酵或细胞培养，得到自由基清除剂含量丰富的产品。
在许多天然动植物中含有抗自由基的活性成分。如姜含挥发油和姜辣素，其成份有姜酚、姜酮和姜烯酚。绿茶的主要成分茶多酚，银杏、竹叶的有效成分黄酮和酚类，各种果品蔬菜中的维生素，还有一些中药如白首乌、五味子、葛根、小叶女贞、柴胡、车前子等也含有多种活性成分。另外，党参、灵芝等真菌中的多糖也是有效的活性成分。在动物的肝脏等器官，血液中也可提取有关的活性成分。
利用微生物发酵或细胞培养生产功能因子，也是目前研究的热点。如在固体培养基上人工培育冬虫夏草，由预处理的大豆经少孢根霉短期固态发酵生成丹贝异黄酮，用大蒜细胞培养或深红酵母生产SOD。这些方法不受气候、季节的限制，可实现工业化的连续生产。
二十一世纪，有利于确保人类健康的功能性食品将是食品行业发展的重点。关于自由基清除剂的深入研究，对预防和治疗人类的许多疾病，以及对各类保健食品生产方面均具有指导意义。随着研究的深入，将有更多更有效的自由基清除剂被开发和利用，将会进一步推动功能性食品行业向前发展，为保障人类的身体健康作出更大贡献。
思考题
1.自由基理论的核心内容是什么？
2.自由基对人体有哪些危害？怎样消除或减少这些危害？
3.什么叫自由基清除剂？各有哪些种类？
4.SOD在食品中有哪些应用？
5.微量元素与自由基清除剂有什么关系？
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超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧 化法） （适用于：SOD及各种抗氧化剂） 操作图解 具体方法 1 溶液配制 1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。 1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。 1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA） 40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。用pH 计测量，pH应为7.4。用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。 1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中） 取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。再往里加连苯三酚14.6 mg (M。W.126.1 )，即得。（当天有效,以上为1个样品的用量）。 2 测试液 2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。（空白参比：Tris-HCl 缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。此时的ΔA为ΔA0。 3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。此时的ΔA为ΔA样。 3 计算公式
f 也称氧化压力。化学上也称为“游离基”，是含有一个不成对电子的原子团。由于原子形成分子时，化学键中电子必须成对出现，因此自由基就到处夺取其他物质的一个电子，使自己形成稳定的物质。在化学中，这种现象称为“氧化”。我们生物体系主要遇到的是氧自由基，例如超氧阴离子自由基、羟自由基、脂氧自由基、二氧化氮和一氧化氮自由基。加上过氧化氢、单线态氧和臭氧，通称活性氧。体内活性氧自由基具有一定的功能，如免疫和信号传导过程。但过多的活性氧自由基就会有破坏行为，导致人体正常细胞和组织的损坏，从而引起多种疾病。如心脏病、老年痴呆症、帕金森病和肿瘤等等疑难杂症。此外，外界环境中的阳光辐射、空气污染、吸烟、农药等都会使人体产生更多活性氧自由基，使核酸突变，这是人类衰老和患病的根源。 氧自由基：我们生活在富含氧气的空气中，离开氧气我们的生命就不能存在，但是氧气也有对人体有害的一面，有时候它能杀死健康细胞甚至致人于死地。当然，直接杀死细胞的并不是氧气本身，而是由它产生的一种叫氧自由基的有害物质，它是人体的代谢产物，可以造成生物膜系统损伤以及细胞内氧化磷酸化障碍，是人体疾病、衰老和死亡的直接参与者，对人体的健康和长寿危害非常之大。
正常情况下，参与代谢的氧大多数与氢结合生成水，然而有4－5％的氧将被酶所催化形成超氧阴离子，后者又可形成过氧化氢，它们都属于自由基。自由基有多种,如氧自由基和羟自由基 ,是指那些最外层电子轨道上含有不配对电子的原子、离子或分子。自由基具有高度的氧化活性，它们极不稳定,活性极高,它们攻击细胞膜、线粒体膜,与膜中的不饱和脂肪酸反应，造成脂质过氧化增强。脂质过氧化产物（mda等)又可分解为更多的自由基，引起自由基的连锁反应。这样，膜结构的完整性受到破坏，引起肌肉、肝细胞、线粒体、DNA、RNA 等广泛损伤从而引起各种疾病,诸如炎症、癌症、扩张性心肌病、老年性白内障、哮喘等疾患，故自由基是人体疾病、衰老和死亡的直接参与和制造者。 氧自由基的克星------抗氧化剂，（也就是氧自由清除剂或者抑制剂）它对人体的健康可是有着密切的关系。根据医学上的研究，维他命、矿物质及酵素中具保护身体、防止自由基（free radicals）形成功能者，就称作抗氧化剂。 而我们的身体，当然也会有自然产生的自由基清除者来抑制自由基形成，此外，身体自然制造的酵素，也可中和自由基。除了这些酵素，我们还可由饮食中摄取天然的抗氧化剂，例如：维他命A、C、E及硒，以协助体内清除自由基。如果人体系统在自由基的充斥下，而自然产生的自由基清除者无法“应付”时，健康就会亮起红灯。因此，人们在平时就应通过饮食，摄取天然的抗氧化剂，或服用一些补充品，来协助身体破坏自由基。号称第六生命元素的壳寡糖，可完全净化自由基，使自由基失去活性，达到抵御疾病和延缓衰老的作用。在1991年的国际学术会议上，美欧等许多国家的科学家一致把壳寡糖与蛋白质、脂肪、糖类、维生素、矿物质并列誉为人体第六生命要素。壳寡糖能降血脂、降血压、能抗癌，对现代文明病有惊人的防治作用。壳寡糖是机体“清道夫”，能排除体内自由基，提高机体免疫力，减肥美肤，延缓衰老。 我们知道，细胞经呼吸获取氧，其中98％与细胞器内的葡萄糖和脂肪相结合，转化为能量，满足细胞活动的需要，另外2％的氧则转化成氧自由基。由于这种物质非常活跃，几乎可以与各种物质发生作用，引起一系列对细胞具有破坏性的连锁反应。 在一般情况下，细胞不会遭到这种分子杀手的杀害，这是因为我们人体细胞存在着大量氧自由基的克星——抗氧化剂，比如，脂溶性的维生素E、水溶性的维生素C及一些酶类等等，这些天然的抗氧化剂能够与氧自由基发生氧化还原反应，使氧自由基被彻底清除，而只有在某些情况下，氧自由基才会致细胞甚至肌体于死地。 自由基清除剂：至于对付氧自由基的办法，目前已经发现了许多氧自由基的克星，也就是氧自由清除剂或者抑制剂，其作用机理有
·O2ˉ自由基清除实验 (1) 实验原理 黄嘌呤氧化酶 黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2ˉ 即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2ˉ)。·O2ˉ与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2ˉ越少，溶液的颜色越浅。 (2)试剂 Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l) 实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用 Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！) 0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解) NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65, 黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l) 实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用 PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g, 800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。 实际配制500mL。高压灭菌，室温保存。 PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上 Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度 实际配制见记录本！ HCl(1M): MW=36.5 310ul/10ml.(36% HCl密度1.18g/ml) 实际配制：800uL浓盐酸+9mL水，于塑料管中4℃保存。 NaOH(1M): MW=40 0.4g/10mL, 存于冰箱 (3) 测定方法 超氧阴离子自由基清除能力的测定参照Bae等人的方法略加改进。样品溶液1-5mg/ml 起始浓度，用于水或50%乙醇溶液。 Bae, S.W., Suh, H.J., 2007. Antioxidant activities of ve different mulberry cultivars in Korea.
网络出版时间：2012-12-19 08:52 网络出版地址：https://www.doczj.com/doc/f88770337.html,/kcms/detail/11.2206.TS.20121219.0852.010.html 2012-11-20 超氧阴离子自由基荧光探针法检测及其 应用研究 赵永强1,2，林洪1，李来好2,*，杨贤庆2，郝淑贤2，张牧天3 (1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003； 2.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广 东广州 510300； 3. 北京师范大学-香港浸会大学联合国际学院，广东珠海 519085) 摘要：该研究以2-氨基吡啶与吡啶-2-甲醛为原料，经亲核取代反应合成了一种新型荧光探针：2-（2’-吡啶 亚胺甲基）吡啶（2-APC），所得目标产物经熔点测定、元素分析、红外光谱与核磁共振波谱等方法表征确认。 利用2-APC与超氧阴离子自由基（O2·-）发生荧光淬灭反应的原理，建立了一种测定邻苯三酚自氧化体系 产生O2·-的方法，该方法反应体系最佳条件为：反应pH=8.2；反应温度T=40℃；反应时间t=40 min。测 定条件为：λex=295 nm、λem=365nm，狭缝宽度5 nm。邻苯三酚在0.4×10-6~8.0×10-6 mol?L-1浓度范围内 与相对荧光强度呈良好线性关系，线性回归方程为y=37.567x+55.581，R2=0.9834。应用该方法对L-抗坏 血酸清除O2·-能力进行评价，结果表明L-抗坏血酸清除O2·-的IC50值为0.182 mmol?L-1。 关键词：超氧阴离子自由基；荧光探针；合成；应用 Fluorescence Probe Method for Superoxide Anion Radical Detection and its Application Study ZHAO Yong-qiang 1,2，LIN Hong1，LI Lai-hao2,*，YANG Xian-qing2，HAO Shu-xian2，ZHANG Mu-tian (1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, P.R.China； 2.Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, National R&D Center for Aquatic Product Processing, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Science, Guangzhou 510300, P.R.China； Beijing Normal University-Hong Kong Baptist University United International College, Zhuhai 519085, P.R.China) Abstract：A novel fluorescence probe 2-APC was synthesized by 2-aminopyridine and 2-pyridinecarbaldehyde based on nucleophilic substitution reaction in this study. The reaction product was characterization by melting test, elemental analysis, infrared spectrum and 1HNMR. A fluorescence probe method for superoxide anion radical detection was established. The optimum conditions of this reaction system were as follows, pH, temperature and time of reaction system was 8.2,40 oC and 40 min respectively. The conditions of fluorimetric determination were as follows, λex=295 nm, λem=365nm and the slit width was 5 nm. In the range from 0.4×10-6 M to 8.0×10-6 M, relative fluorescence intensity (y) and pyrogallol concentration (x) were shown a good linear relationship, y=37.567x+55.581，R2=0.9834. Superoxide anion radical (O2·-) scavenging activity of L-ascorbic acid was evaluated using the above mentioned method, the results showed that the IC50of L-ascorbic was 0.182×10-3mol?L-1. Key words：superoxide anion radical, fluorescence probe, synthesis, application 中图分类号：O657.34 文献标识码：A 文章编号： 活性氧是需氧生物细胞进行正常代谢的产物，生物体生命代谢过程中通过非酶反应与酶反应不断产生各种活性氧自由基，如超氧阴离子自由基（superoxide anion radical, O2·-）、过氧化氢（hydrogen peroxide, 收稿日期：2012 基金项目：国家科技支撑计划项目(2012BAD28B00)；国家现代农业产业技术体系(CARS-49)；国家海洋局海 洋公益性行业科研专项(201005020；2013418018)；茂名市科技计划项目(2011A01002) 作者简介：赵永强(1985—)，男，博士研究生，研究方向为水产品加工及贮藏工程。E-mail：zhaoyq1122@https://www.doczj.com/doc/f88770337.html, *通信作者：李来好(1963—)，男，研究员，博士，研究方向为水产品加工与质量安全。E-mail：laihaoli@https://www.doczj.com/doc/f88770337.html,
超氧阴离子产生速率测定 羟氨氧化法 (王爱国，罗广华．植物的超氧物自由基与羟胺的反应[J]．植物生理学通讯，1990，(6)：55-57) 一、原理 植物组织器官的衰老总是伴着细胞内膜结构的破坏，表现为细胞内的电解质大量渗漏出来。很多研究结果表明，细胞衰老过程中膜的破坏是由细胞中(特别是线粒体和叶绿体)产生的自由基(如O2·ˉ、OH·、O2等)使膜脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化作用而造成的。膜脂过氧化作用中产生的自由基，它不仅能连续诱发膜脂过氧化作用，而且还可以使蛋白质脱H+而产生蛋白质自由基，使蛋白质分子发生链式聚合，从而使细胞膜变性，最终导致细胞损伤、衰老和死亡。 二、材料、仪器设备与试剂 (一)材料 植物叶片、花瓣等器官 (二)仪器设备 低温高速离心机、微量加样器(1mL、20uL)、精密电子天平、分光光度计、试管、 研钵、剪刀、镊子、烧杯、试管架 (三)试剂 (1)0.05 mol·L-1磷酸缓冲液PH=7.8(0.66304g的NaH2PO4.2H2O和16.3849g的 Na2HPO4.12H2O定溶1000mL，校正PH) (2)10m mol·L-1盐酸羟胺(NH2OH·HCl，69.49，溶于水)0.3475g定溶到500mL，(冷) (3)17m mol·L-1对氨基苯磺酸(C6H7NO3S 173.19 1.4721g) 或者(C6H7NO3S·H2O 191.21 1.6253g)定溶到500mL，(冷，磁) (4)7m mol·L-1α-萘胺，0.5012g定溶到500mL，(乙醇溶解，定溶，溶解完全) 三、试验步骤 (1)制做亚硝酸根标准曲线 2mL系列浓度的NaNO2(5,4,3,2,1,0.5μg/L)加入4mL对氨基苯磺酸和4mLa－萘胺于25℃保温20min，然后测定OD530以［NO2－］和测得的OD530值互为函数作图，制的亚硝酸根标准曲线 (2)取0.2g植物材料，加入1.0mL 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液(PH7.8)于冰浴研磨
超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法) 简介： 超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。 Leagene 超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法)又称超氧阴离子清除能力检测试剂盒，其检测原理是利用羟胺氧化的方法可以检测生物体系中超氧阴离子自由基(O 2-)，即超氧阴离子自由基(O 2-)与羟胺反应生成NO 2-，在一定范围内颜色深浅与超氧阴离子自由基(O 2-)成正比，根据NO 2-反应的标准曲线将A 530换算成NO 2-浓度，再依据上述关系式即可计算出O 2-浓度。该试剂盒主要用于测定植物组织中的超氧阴离子自由基含量或超氧阴离子清除能力。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 蒸馏水 2、 实验材料：植物组织(大豆、绿豆、玉米等叶片)、血液、组织样本等 3、 研钵或匀浆器 4、 离心管或试管 5、 低温离心机 6、 恒温箱或水浴锅 7、 比色杯 8、 分光光度计 操作步骤(仅供参考)： 编号 名称 TO1123 50T Storage 试剂(A): NO 2-标准(1mM) 1ml RT 试剂(B): O 2- Lysis buffer 125ml RT 试剂(C): 羟胺溶液 30ml RT 试剂(D): 氨基苯磺酸显色液 30ml 4℃ 避光 试剂(E): 萘胺显色液 30ml 4℃ 避光 使用说明书 1份
1、准备样品： ①植物样品：取正常或逆境下的新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取预冷的O2-Lysis buffer后冰浴条件下匀浆或研磨，4℃离心，上清液即为超氧阴离子自由基提取液，4℃保存备用。 ②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，4℃保存，用于超氧阴离子自由基的检测。 ③高活性样品：如果样品中含有较高浓度的超氧阴离子自由基，可以使用O2- Lysis buffer 进行恰当的稀释。 2、配制系列NO2-标准溶液：取出NO2-标准(1mM)恢复至室温后，以NO2-标准(1mM) 按下表继续稀释： 加入物(ml) 1 2 3 4 5 6 NO2-标准(1mM)0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 蒸馏水0.99 0.98 0.97 0.96 0.95 0.94 NO2-含量(μM) 10 20 30 40 50 60 3、O2-加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意 避免产生气泡。如果样品中的超氧阴离子自由基浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。 加入物(ml) 空白管标准管测定管 蒸馏水1—— 系列NO2-标准(1-6号管) — 1 — 待测样品——0.25 O2- Lysis buffer ——0.25 羟胺溶液——0.5 混匀，25℃水浴孵育。 氨基苯磺酸显色液0.5 0.5 0.5 萘胺显色液0.5 0.5 0.5 混匀，30℃水浴孵育。 4、O2-测定：以空白调零，分光光度计(1cm光径比色杯)检测标准管、测定管530nm处吸光度(A标准、A测定)。 计算： 以系列NO2-标准(1-6号管)含量(μM)为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，制作标准曲线，根据测定管的吸光度进而计算NO2-含量。根据如下公式计算具体样品中超氧阴离子
活性氧（ROS）在许多致病过程中起关键作用，包括致癌作用、炎症、缺血再灌注损伤和信号转导。目前开发的几种方法包括电子自旋共振法和化学荧光法。其中，荧光检测在高灵敏度和实验方便性方面是优越的。细胞溶质Ca2+的荧光指示剂，极大地促进了细胞中Ca2+依赖性信号转导的实验研究。然而，几种用于检测ROS的荧光探针（包括2,7-二氢二氢荧光素（DCFH））可与各种ROS（超氧化物，过氧化氢等等）发生反应。此外，DCFH易于自氧化，导致暴露在光下时荧光自发增加。因此，将这些探针视为检测细胞中特定的氧化物质（例如过氧化氢）是不合适的。 胞内羟基自由基测定机理： 2-[6-(4-羟基)苯氧基-3H-黄嘌呤-3-酮基-9-基]苯甲酸（HPF）被设计并合成为新型荧光探针，用于检测选择性高活性氧（hROS），即羟基。这种新开发的ROS指示剂HPF比二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）具有更高的特异性和稳定性，因此被广泛用于更精确的胞内ROS 定性测量。 尽管HPF本身几乎不发荧光，但HPF选择性地和剂量依赖性地在与hROS反应时产生强荧光化合物，但不与其他活性氧物质（ROS）反应。因此，通过单独使用HPF，可以将hROS 与过氧化氢，一氧化氮和超氧化物区分开来。此外，HPF对光诱导的自动氧化具有抗性。 胞内羟基自由基测定方法： 在本研究中，用PBS洗涤500 μL藻类培养物，并在黑暗条件和室温下于10 μM HPF （Invitrogen，美国）的终浓度下温育40 min。用PBS洗涤一次后，通过FL1通道检测胞内羟基自由基水平。 胞内超氧阴离子自由基测定机理： 一种名为二氢乙锭（DHE）的荧光素被广泛用于测量细胞内超氧阴离子自由基。DHE可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，形成氧化乙啶，氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞ROS含量的多少和变化，二氢乙啶在细胞内主要被超氧阴离子型ROS氧化，用流式细胞仪可直接观察。 胞内超氧阴离子自由基测定方法： 在本研究中，用PBS洗涤1 mL藻类培养物，并在黑暗条件和室温下于20 μM DHE（Invitrogen，美国）的终浓度下温育30 min。用PBS洗涤一次后，通过FL2通道检测胞内超氧阴离子自由基水平。
一．实验原理： 该方法利用NADH-PMS-NBT为超氧阴离子(O2·-)生成系统，超氧阴离子清除剂能减少NBT 的蓝色。通过检测560nm处吸光值可判断体系中还原物质的还原能力。 二．实验仪器：分光光度计 三．实验试剂： 一：液体40mL×1瓶； 二：液体1mL一瓶； 三：粉剂一支； 四：粉剂一支； 五：1mg/mL芦丁标准品，1mL 四．溶液配制： 一工作液：用时加双蒸水360mL，也就是10倍稀释，得到400mL试剂一工作液； 二工作液：用赠送的棕色瓶配制。试剂二工作液由试剂二加上100mL试剂一工作液配得，现配现用，注意避光； 三工作液：试剂三工作液由试剂三溶解于100mL试剂一工作液配得，现配现用； 四工作液：粉剂一支。用50mL双蒸水溶解，摇匀后，取10mL，加入90mL试剂一，配成试剂四工作液，现配现用，用赠送的棕色瓶盛装。注意避光，配好的试剂请于2小时内用完。五工作液：阳性对照，按需配制，-20℃保存。 五．实验步骤： 测定吸光值。
六．清除能力计算： 超氧阴离子自由基清除（%）=[空白孔吸光值-（测定孔吸光值-对照孔吸光值）]/空白孔吸光值*100 注： 1 如未做对照孔，可以将其视作为0； 2 阳性对照求值时将其视作测定孔进行计算即可。 七．注意事项： 1. 如样品中色素物质不是分析对象，建议先通过SEP C18柱进行脱色处理，处理后样品可不做对照孔； 2. 如不确定样品的超氧阴离子自由基清除能力，可先做不同浓度的稀释液进行摸索，并选择适宜浓度进行测定，高浓度下，浓度与清除率间并不线性相关。 3. 试剂三建议全程冰上操作。试剂四切记避光保存，特别是配制后，且应尽快用完。建议在做好一切其它准备工作后再配制试剂四应用液。试剂四正常颜色为黄色，强光照射下，5-10分钟内会变为绿色，随后变为蓝色，变色后试剂不可再用！ 4. 试剂二、三应用液和样品混匀后再加入试剂四，次序颠倒会导致不显色。 5. 部分物质会导致显色加深，导致求得的抑制率是负值，如遇到此类现象请先确定该物质是否具有超氧阴离子清除能力，再考虑更换方法，如邻苯三酚自氧化法等进行测试。
抗超氧阴离子自由基及生产超氧阴离子自由基测试盒 说明书修订日期：2015.07.13 Cat number：KGT012 Store at4℃for6months For Research Use Only（科研专用） 一、测定原理 模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，产生超氧阴离子自由基O2—，加入电子传递物质及gress 氏显色剂，使反应体系呈现紫红色，可用分光光度计测其吸光度，当被测样本中含有O2。抑制剂时，则比色时测定管的吸光度低于对照管的吸光度，而如果被测样本中含有产生O2。物质时，则比色时测定管的吸光度高于对照管的吸光度，通过以维生素C做标准，可计算出被检物品对O2。的影响能力。 二、试剂盒组份 组份KGT012 50assays Buffer A 5.0mL Buffer B 5.0mL Buffer C 5.0mL Buffer D350μL Buffer D稀释液 5.0mL 试剂E1支 试剂F1支 Vc标准品4支 注意事项 1．Buffer A室温较低时会有部分结晶析出，溶解后加蒸馏水稀释10倍至1×Buffer A50ml。 2．Buffer D用前用Buffer D稀释液按1︰14稀释至1×Buffer D（不可冷冻，4℃可保存2个月）。 3．试剂E配制：将试剂加入蒸馏水37.5mL中溶解后备用，4℃避光保存。 4．试剂F配制：将试剂加入蒸馏水37.5mL中溶解后备用，4℃避光保存。 5．显色剂配制：试剂E︰试剂F︰冰乙酸＝3︰3︰2的体积比配制，4℃避光保存（冰乙酸自备）。 6．Vc标准贮备液配制：将一支Vc标准品加蒸馏水定容至5ml（Vc标准配制后当天内使用）Vc标准品工作液（0.15mg/ml）配制：取1ml贮备液加4ml蒸馏水，5倍稀释现配现用。 Vc标准品配制后见光极易分解，配制的0.15mg/ml Vc标准品工作液需30分钟内检测。
ESR 电子顺磁共振（EPR）或称电子自旋共振（ESR）现象最早发现于1944年。它利用具有未成对电子的物质在磁场作用下吸收电磁波的能量使电子发生能级间的跃迁的特征，对顺磁性物质进行检测与分析。 自旋捕集方法是将不饱和的抗磁性化合物（自旋捕集剂）加入反应体系,与反应体系中产生的各种活性高、寿命短的自由基结合形成相对稳定的自旋加合物,以适于ESR检测其原理是利用适当的自旋捕捉剂与活泼的短寿命自由基结合,生成相对稳定的自旋加合物,可以用电子自旋共振波谱法检测自旋加合物的数量,利用自旋加合物的数量来计算原来自由基的多少。 H： V： ESR测自由基是怎么被检测的（细胞，组织，溶液？体内，体外？） (MGD)2 - Fe2 +,是含有10mmol·L- 1MGD 和2mmol·L- 1FeSO4的溶液。 体外捕集：处死后取组织（血液、细胞），加入捕集剂，ESR测定 体内捕集：腹腔注射捕集剂，处死取组织（血液、细胞），ESR测定 腹腔注射几乎没有检测到自由基信号，或者信号很弱，而处死后样品加捕获剂则可以检测到自由基信号。 通用捕获剂 典型的自旋捕捉剂是亚硝基化合物或氮氧化合物，把足够量的自旋捕捉剂加入到产生自由基的体系中，自旋捕获剂就会快速地和任何出现的自由基反应，最后给出稳定的可检测的氮样氧自由基加合物。所形成的自由基加合物的ESR 谱上有被捕自由基基因给出的超精细分裂,可鉴别被捕自由基通用自旋捕获剂所形成的自由基加合物对自由基结构变化相当敏感， ESR 技术检测O-2 O-2可以与1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸钠(Tiron)(钛铁试剂)快速反应生成一种称之为“Tiron 半醌自由基”的自旋加合物，比较稳定，可在室温下应用电子顺磁共振波谱仪(EPR)进行检测，从而解决了生理条件下水溶液中寿命极其短暂的O-2·的定性和定量问题 ESR 技术检测·OH DMPO作自由基捕获剂对自由基结构变化相当敏感,可以提供自由基结构的详细信息。它与·OH产生的自旋加合物的ESR谱表现出特别容易识别的特征谱线。在溶液中容易形成的自我捕集产物二聚体自由基不会干扰实验结果。 ESR 技术检测血红蛋白结合的一氧化氮 在组织或血液中，一氧化氮大多与氧或过渡金属反应生成了硝酸盐或亚硝酸盐以及一氧化氮与金属的配合物。一氧化氮与血红蛋白的结合速率常数非常高，而且能够得到有特征的ESR 波谱。利用这一性质，我们可以用血红蛋白作为一氧化氮的捕集剂检测一氧化氮自由基。但是，HbNO 极易氧化，这就限制了这种方法在富氧条件下的应用。 ESR 技术检测生物体系产生的一氧化氮 一氧化氮与含金属蛋白反应产生的亚硝酰的金属配合物，往往会抑制细胞中许多重要的酶，对细胞产生毒害作用。目前应用较多的捕集剂的有Fe2+- (DETC)2，它可与一氧化氮形成稳定的单亚硝酰-铁配合物MNIC，给出特征的ESR 波谱。但由于Fe2+-( DETC)2不溶于
负氧离子与自由基的关系 摘要：外界环境中的阳光辐射、空气污染、频发的雾霾天气、吸烟、农药等都会使人体产生有害的自由基，导致人体患病、衰老。我们要积极可以抗氧化、中和消减自由基，抵抗疾病和衰老，空气负离子就是具有抗氧化防衰老、消减自由基效果的自然因子。 外界环境中的阳光辐射、空气污染、频发的雾霾天气、吸烟、农药等都会使人体产生有害的自由基，使核酸突变，导致人体患病、衰老。 自由基的危害 自由基带有不稳定的氧分子，它们由衰老、日光暴晒或是接触过的有毒化学物中产生。因为失去1个电子变得不稳，为了使自己稳下来，便尝试从细胞里夺回失去的电子，因而损害健康的细胞，引起病变，甚至增加患癌的机会。 众多的医学研究和临床试验证明，人体细胞电子被抢夺是万病之源。自由基的危害很大，夺去了细胞的电子会导致疾病;如果自由基
夺去了细胞蛋白分子的电子，使蛋白质接上支链发生烷基化，形成畸变的分子就会致癌。 如何消减体内自由基? 虽然我们难逃自由基的“魔爪”，但是我们积极可以抗氧化、中和消减自由基，抵抗疾病和衰老，空气负离子就是具有抗氧化防衰老、消减自由基效果的自然因子。 空气负离子可以消减体内自由基，减轻自由基的危害的原理主要是因为负离子具有抗氧化(还原性)防衰老的突出作用。空气负离子的抗氧化性(还原性)是一种基本的化学原理，化学反应就是电子层上分子的交换，失去分子叫氧化、得到分子叫还原。失去电子的分子(团)或原子显示正电性的叫正离子，获得多余电子的分子(团)或原子显示负电性的叫负离子，因此空气负离子带有负电位即有多余的电子，可以补充给老化的细胞和血球电子，防止了电子抢夺的恶性循环、具有消减自由基的效果。 环境污染会导致人体内的自由基剧增，负氧离子不仅能消减人体内已形成的自由基，而且可以主动出击、吸附凝聚沉淀空气中的小粒
纳米水雾是一种氧化还原能力极强的物质。它具有以下特点：它非常活跃，可以与一切有机物质发生链式反应，可以杀死病毒、细菌，降解农药、激素、抗生素等，它与污染物反应后的产物是水、CO2、无机盐，且剩余纳米水雾最终还原成水，没有其他物质生成，对人体没有任何危害。 好尔卫盾产品工作时产生的是纳米水雾，而不是臭氧。通过以下实验说明： 一、将5滴有机蓝墨水加入即时产生的含有纳米水雾的200ml水溶液中，5秒以内蓝墨水完全褪色；（有机蓝被氧化而褪色）。 将5滴有机蓝墨水加入200ml纯净水中，通入臭氧，20分钟以后略有褪色。 二、200ml纯净水通入臭氧20分钟，静置5分钟，加入5滴有机蓝墨水，不褪色； 含有纳米水雾的水溶液200ml，静置两天，加入5滴有机蓝墨水，10秒内褪色。 三、好尔卫盾在纯净水中工作并不产生异味。如果有臭氧产生的话，就有腥臭味。 纳米水雾相比臭氧具有以下优势： 1、氧化能力强，其标准电极电位达到2．80 V，仅次于F（2.87V），高于臭氧（2.07V），是一种氧化能力极强的氧化剂；可以与一切有机物质发生链式反应杀死病毒、细菌，降解农药等。 2、反应速率常数大，非常活泼，与大多数有机物反应的速率常数在106～1010mol_1·L·s-1非常迅速；也就是说能瞬杀死病毒，细菌，降解农药，将它们分解为无毒无害的物质。 3、选择性低，且与被氧化的反应物浓度无关。即为再少的细菌，再低浓度的农残都能被处理达到国家相关标准。 4、纳米水雾本身就是在水溶液中产生的，相对于臭氧保存的时间长。而臭氧在空气中的分压接近于0，所以在水中实际的溶解度很小，几乎不能在水中保存。. 5、纳米水雾本身无嗅无味，处理效率高，反应后的产物是水、CO2、无机盐，不产生二次污染．且剩余的纳米水雾最终还原成水，不产生其他物质。臭氧本身就有腥臭味，对人的神经系统有损害。 6、若在使用好尔盾产品时也闻到了刺激性气味，那不是产生了臭氧，而是因为纳米将水中的消毒剂残留的Cl-氧化成了氯气。
*广西自然科学基金资助项目(桂科自9912038)1第一附属医院药剂科收稿日期:2003-05-10 玉郎伞提取物对超氧阴离子自由基和羟自由基的抑制和清除作用 * 焦 杨 段小群 黄仁彬 韦锦斌 蒋伟哲 1 (广西医科大学药理学教研室 南宁 530021) 摘要 目的:探讨玉郎伞提取物(Y LS)对氧自由基的抑制和清除作用。方法:采用分光光度法检测Y L S 对超氧阴离子自由基(O 2·-)和羟自由基(·O H )的清除及抑制作用。结果:Y L S 浓度为0.15、0.30、0.60g /ml 在体外对·O H 的清除率分别为7.1%、29.1%、68.5%,对O 2·-的清除率分别为40.5%、49.9%和64.5%,对O 2·-生成的抑制率分别为48.0%、60.3%和68.8%。结论:Y LS 对O 2·-具有明显的抑制及清除作用,对·O H 也有一定的清除作用。关键词 玉郎伞提取物;超氧阴离子自由基;羟自由基;清除作用中国图书资料分类法分类号 R285.5 SCAVENGING AND I NHIBITIING EFFECT OF YULA NGS AN EXTRACT ON SUPEROXI -DE ANION FREE RADICAL AND HYDROXY FREE RADICAL J iao Yang ,Duan Xiaoqun,Huang Renbin,et al.(Depa rtm ent of Pha rmaco logy ,Guang xi Medical Univ ersi-ty ,Nanning 530021China ) Abstract Objective :To study the scavenging effect o f YU LANGSAN ex tract on supero xide anio n free radical (O 2·-)and hydrox y free radical (·O H ).Methods :Spectro photometry (w av e leng th 322nm a nd 536nm )w as used to observ e the effects o f YLS o n O 2·-and ·O H .Result :The lev el of ·O H was reduced by 7.1 %,29.1%,68.5%in the presence o f YLS 0.15,0.30,0.60g ·ml -1,the lev el of O 2·-w as reduced by 40.5 %,49.9%and 64.5%,respectively .The genera tion o f O 2·-w as inhibited by 48.0%,60.3%a nd 68.8%,respectiv ely ,in the presence of YLS 0.15,0.30,0.60g ·ml -1in v itro .Conclusion :The results show that YLS can g rea tly scav eng e O 2·-(P <0.01)and ·O H,and inhibit the productio n of O 2·-.Key words YU LANGSAN ex tract;superoxide a nion free radical;hydrox y free radical;scav enging effect 玉郎伞是一种尚未开发利用的民间草药,为蝶形花科植物疏叶崖豆M illettia pulchra Kur z va r .lax io r (Dunn )Z .W ei 的块根,具有舒筋活络、补虚润肺之功能,民间用于腰腿痛、风湿痛、慢性肝炎、肺结核等的治疗[1]。本研究小组的一些药理学研究初步表明,玉郎伞提取物(Y L S )具有降低血压、减轻心肌缺血再灌注损伤、减轻急性化学性肝损伤等作用[2]。本研究探讨其在体外对连苯三酚氧自由化产生的氧自由基(O 2·-)和由邻二氮菲-Fe 2+/H 2O 2体系产生的羟自由基(·O H)的抑制和清除作用。 1 材料和方法 1.1 材料:Y L S 由本室自行提取,每毫升溶液含生药3g 。连苯三酚为中国医药(集团)上海化学试剂公司生产,批号为F010630;邻二氮菲、硫酸亚铁为上海试剂三厂生产,均为分析纯。 1.2 仪器:分光光度计(DU -640,美国Beckman 公司)。1.3 方法[3,4]: 1.3.1 ·O H 的生成及清除率的测定:配制含邻二氮菲0.75mmo l /L 、Fe SO 40.75mmol /L 磷酸盐缓冲液(pH 7.3)150mmol /L 的溶液作为反应体系,加0.01%H 2O 2(损害)或不加H 2O 2(未损害),37℃保温60min 后,以磷酸盐缓冲液为参比,分别测536nm 时的吸收值,得A 损害与A 未损害。上述反应体系加入0.01%H 2O 2和一定量的Y L S,以同浓度Y L S 作参比,测536nm 时的吸收值,即得A 样。重复8次。按下式计算·O H 清除率:·O H 清除率(S %)=(A 样-A 损害)/(A 未损害-A 损害)×100 %。1.3.2 O 2·-的生成及清除率的测定:配制含磷酸盐缓冲液(pH8.3)50mmo l /L 、连苯三酚0.2mmo l /L 的溶液作为反应体系,反应温度为25℃,测定波长为322nm 。此反应体系中加入一定量Y L S,以同浓度Y L S 作参比,测定反应启动后10s 时的吸收值(A 样)。另取试剂同上,不加Y L S,作为空白对照,以PBS 为参比,测反应启动后10s 时的吸收值(A 空)。重复8次。按下式计算清除率:O 2·-清除率(S %)=(A 空-A 样)/A 空×100 %。· 22·广西医科大学学报 J OU RNAL O F GUANGXI M EDICAL UN IV ERS ITY 2004Feb ;21(1) DOI:10.16190/https://www.doczj.com/doc/f88770337.html, k i .45-1211/r.2004.01.010
植物超氧阴离子自由基含量的测定 一、实验目的 了解实验原理，掌握实验技术 二、实验原理 超氧阴离子（O?? 2）能与羟胺反应生成NO3-，反应式为： NH2OH+2O?? 2+H+ = NO2-+H2O2+H2O 其中NO2-进一步反应生成对氨基磺酸、反应后再生成α-苯胺，最后生成红色的偶氮化合物。其中，偶氮化合物在520nm到560nm下有吸收峰，本次实验在530nm下进行比色。 三、实验材料与仪器 植物材料 小麦叶片，荠菜叶片 试剂 NaNO2- AR 100μl；蒸馏水；对氨基酸苯磺酸；α-苯酸；PBS；盐酸羟胺；对氨基苯磺酸；α-苯胺。 仪器 可见光分光光度计，型号V-1100D 四、实验方法 1.标准曲线 1 2 3 4 5 6 7 NO2-标准液（50μg/ml）0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0 对氨基酸苯磺酸 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 α-苯酸 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0然后置于30o C培养箱中保温30min显色反应测定A530，以NO2-为横坐标，A530值为纵坐标，绘制标准曲线。 2. O?? 2的提取 小麦叶片称取1.0g。加入少量PH7.8的PBS研磨。之后定容到5ml。10000rpm 45o C离心 10min。之后取上清液备用。 注：空白对照直接用上清液显色测本底值NO2-含量。 3.组织中O?? 2测定 （1）NO2-的产生 O?? 2 PBS 盐酸羟胺标样 2.0 1.5 0.5 调零 2.0 2.0 0 之后置于25o C保温20min （2）NO2-显色，调标准线
货号：MS1518 规格：100管/96样 超氧阴离子清除能力试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。 测定原理： AP-TEMED系统产生超氧阴离子，与盐酸羟胺反应生成NO 2－，NO 2 －与对氨基苯磺酸和α－ 萘胺的作用生成红色的偶氮化合物，在530nm处有特征吸收峰，样品对超氧阴离子的清除能力与530nm的吸光值呈负相关。 自备实验用品及仪器： 天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。 试剂组成和配制： 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体1.5mL×1支，4℃避光保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加6mL蒸馏水充分溶解。 试剂三：液体7.5mL×1瓶，4℃保存。 试剂四：液体7.5mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂五：液体7.5mL×1瓶，4℃避光保存。 样品处理： 1.组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提 取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。 2.细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细 胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）； 然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。 3.培养液或其它液体：直接检测。 4.粉剂药物可配制成相同浓度，比如1mg/mL。 第1页，共2页