成年大鼠心肌细胞分离方法

文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编辑,有帮助欢迎下载支持. 1文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑. 成年大鼠心肌细胞分离方法 【摘要】 目的: 探讨三种分离成年大鼠心肌细胞的方法。方法: 分别应用酶消化法（0. 1 %的胰蛋白酶和0.1%胶原酶依次消化）、程序冷冻后机械分离法（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃冻存）、酒精和多聚甲醛固定后机械分离法分离心肌组织获取单个心肌细胞悬液。光镜观察, 结合形态学和台盼蓝染色评价心肌细胞。结果: 用三种方法新分离的活性心肌细胞比率约70 %～80 % 、杆状、横纹清晰。结论: 三种方法均可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离。 【关键词】 大鼠; 心肌细胞; 细胞分离 【ABSTRACT】 Objective: To study the methods of isolating adult rat ventricular cardiomyocytes. Methods: The method of enzyme digestion(0.1% trypsin and 0.1% collagenase by turns) or mechanical method: mechanical isolation after procedure cryoapplication(4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，freeze and keep under-196℃) or mechanical isolation after alcohol and paraform fixation was used to isolate cardiac muscular tissues and obtain single cardiomyocyte suspension. The cardiomyocytes were morphologically observed with optical microscope and evaluated through trypan blue dying. Results: Viability of freshly isolated adult rat ventricular cardiomyocytes, which were rodshaped with clear cross striations,was 70%～80%. Conclusion: Adult rat ventricular cardiomyocytes can be 文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编辑,有帮助欢迎下载支持. 1文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑. isolated well with the above methods. 【KEY WORDS】 Rat; Cardiomyocytes; Cell Separation 心肌细胞不仅保存了心肌结构和功能上的某些特点,同时去除了体内各种限制因素的影响,作为实验工具,具有简便、精确、重复性好等优点,已成为研究心肌结构、代谢、功能、病理生理及其机制的重要工具。目前乳鼠心肌细胞的分离方法比较成熟，但是由于未成熟心肌细胞和成熟心肌细胞的差异性使得大量来自于未成熟心肌细胞实验的结论难以用于成熟心肌细胞。特别是近年来, 随着心肌细胞电生理和分子生物学研究的兴起，成熟心肌细胞越来越多的应用于心血管病理生理的研究。目前分离成熟心肌细胞应用较多的是Langendorff 灌流胶原酶消化法，但是它消化下来的是整个心脏的心肌细胞，如果我们只想了解部分心肌细胞功能时就显示出其局限性，我们根据文献的方法加以改进，探讨三种简单、快捷的成年大鼠心肌细胞分离方法，为研究心肌细胞生理和病理特性提供了有用的实验模型。 1 材料与方法 1.1 酶消化法 1.1.1 动物 健康雄性Wister大鼠（200～300g），军事医学科学卫生与环境医学研究所提供。 1.1.2 试剂 0. 1%胰蛋白酶（GIBCO）, 0. 1%胶原酶Ⅰ(GIBCO) (两种酶均用DHanks 液配制成0. 1 %的液体,经正压过滤除菌,pH7. 2, - 20 ℃保存)，DHanks 液（g/L）（NaCl 8.0, KCl 0.4,Na2HPO4 0.7，H2O 0.06, KH2PO4 0.06,NaHCO3 0.35）,用双蒸去离子水配制，pH7.2,文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编辑,有帮助欢迎下载支持. 1文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑. 高压蒸气灭菌,4 ℃保存。培养液[10%DMEM(GIBCO) 干粉,由双蒸去离子水配置液体]正压过滤除菌,pH7. 2～7. 4, - 20 ℃保存。 1.1.3 主要器材 光学显微镜(Olympus),超净工作台(苏州净化设备有限公司),FA21045N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司) 1.1.4 心肌细胞分离 大鼠用25%乌拉坦（1.0g/kg）腹腔注射麻醉，取适量待测心肌组织（下列操作均除水浴和离心外均在超净工作台内进行）立即放入预冷的DHanks 液中,冲洗3次。将心室肌用眼科剪剪成1 mm3 大小组织块,然后加入0. 1 %胰蛋白酶溶液10 ml,37 ℃水浴8min 后,吸取上层混悬液移弃。再加入0. 1 %胶原酶溶液15ml，37 ℃水浴并用磁力搅拌器搅拌30～40min 后,吸取上层混悬液，放在预冷10%DMEM中终止反应。剩余沉淀物再加0. 1%胶原酶溶液15ml，37℃水浴并用磁力搅拌器搅拌30～40min后, 吸取全部液体，终止反应。混悬液用200目孔径不锈钢网过滤除去未消化组织,在室温下800～1000转/min离心3～5min，弃上清，沉淀加入培养液2ml,混匀。 1.2 程序冷冻后机械法 1.2.1 动物 同上。 1.2.2 试剂 DMEM (GIBCO)，Ficoll(Pharmacia) ，KrebsHenseleit 缓冲液（mM）（NaCl 118, KCl4.8, MgSO41.2 ，KH2PO41.2, NaHCO325,Glucose 11，pH7.4），蒸馏水溶解后，经0.22μm滤膜抽滤消毒，备用。0.1M PBS（mM）（NaCl 138, KCl 2.7, KH2PO41.2,Na2PO4 8.1，pH7.4）, 蒸馏水溶解后，高压蒸汽消毒，备文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编辑,有帮助欢迎下载支持. 1文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑. 用。 1. 2.3 主要仪器 FA21045N 型电子天平(上海精密科学仪器有限公司), B600型离心机（白洋离心机厂），光学显微镜（Olympus）等。 1.2.4 心肌细胞的分离 大鼠麻醉后，开胸迅速取心脏，将待测部分左心室放在60%甘油的DMEM的冻存管中，程序冷冻，最后保存于液氮中备用（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃冻存）。从液氮中取出保存的心脏，迅速放入40℃水浴中解冻。用DMEM清洗心脏，将左心室剪碎成1mm3的小块，于KH液中吹打10min以分离心肌细胞，必要时可重复一次。将含心肌细胞的溶液用100目网筛过滤，800转/min离心5min，0.1MPBS清洗两次，800转/min离心。将沉淀轻轻加入4%的Ficoll上，400转/min离心4min，弃上清，沉淀即为高纯度的杆状心肌细胞。 1.3 酒精和多聚甲醛固定后机械法 1.3.1 动物 同上。 1.3.2 主要仪器 100目、300目筛子，眼科剪刀，眼科镊子，平皿，离心机等。 1.3.3 单细胞悬液的制备 将待测心肌组织用生理盐水冲洗后置于70%酒精和4%多聚甲醛溶液(0. 1M pH7. 4)固定，4℃冰箱保存备用。将酒精固定的组织放在120目不锈钢网上，下置一平皿，用眼科剪刀将组织剪碎，用眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直至将组织搓完为止。将平皿中的混悬液用300目铜网过滤以去除细胞团块，收集细胞悬液，以500～800转/min离心沉淀2min。时间允许文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编辑,有帮助欢迎下载支持. 1文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑. 也可以在取下组织后立即进行悬液的制备，然后用70%冷乙醇固定备用。 1.4 心肌细胞的观察和评价 分离的心肌细胞置于显微镜下进行形态学观察, 结合0.4%台盼蓝染色评价心肌细胞活性,计数活性细胞比例。 2 结果 本方法可获得70%～80%具有活性的成年大鼠心室肌细胞(图1～3)。新分离的存活单个成年大鼠心室肌细胞呈杆状或矩形, 横纹清晰, 菱角分明, 长宽比约4～5∶1。由于活性细胞的细胞膜完整, 所以台盼蓝不能进入细胞内而拒染。死亡或损伤严重的心肌细胞呈团块状, 由于细胞膜缺乏完整性, 被台盼蓝染成蓝色。 2007年2月李淑娟等：成年大鼠心肌细胞分离方法第1期2007年2月河北北方学院学报（医学版）第1期图1 成年大鼠心室肌细胞图2 成年大鼠心室肌细胞图3 成年大鼠心室肌细胞 （图1～3新分离的心肌细胞呈长杆状，长宽比大约为4～5∶1，数量多，横纹明显。） 3 讨论 目前分离心肌细胞的方法主要有酶消化法和机械收集法。文献报道最多的是Langendorff逆行主动脉灌注酶溶液消化的方法,但由于技术条件要求较高,收获细胞的质和量差异较大,尤其在我国进行成熟心肌细胞分离培养的单位尚少,成功率也较低，而且它消化下来的是整个心脏的心肌细胞，如果我们只对处理过的局部心肌细胞感兴趣，这就显示出它的局限性，比如在对部分缺血处理过的心肌细胞用流式细