乳鼠心肌细胞原代培养综述
【摘要】：目的乳鼠原代心肌细胞培养在心血管病防治研究领域应用广泛，但是心肌细胞成活率、搏动率，纯化率过低仍是本技术有待解决的关键之处。
本文探讨原代心肌细胞培养的条件和方法以及一些注意事项做一下总结。
【关键词】乳鼠心肌细胞原代培养
1．新生大鼠鼠龄的选择
乳鼠心肌细胞随年龄的增长，其增殖分化能力亦有变化，如在新生3d内，具有部分增殖能力，而成年大鼠心肌细胞为终末分化细胞，不具备增殖能力，因此，我们在选择鼠龄时，尽量选择出生时间短的乳鼠，这样的心肌细胞成活率及贴壁率较高，所以选择新生1~3d均可，最好为半日龄的大鼠更为理想。
2．消化酶的选择使用
分离组织常用的消化液有胰蛋白、胶原酶和透明质酸，如依地酸二钠(EDTA)，其作用是利于组织块分散为单个细胞，利于细胞的贴壁生长。
消化液的浓度、消化能力、消化的时间、温度对组织离散效果影响较大，甚至会损伤细胞，导致培养细胞状态不佳，失去贴壁生长能力，增加心肌细胞死亡率。
其中胰蛋白酶的消化力较强，常用浓度为0·05~0·50%，在37℃、PH8·0条件下作用最强，易造成心肌细胞损坏，因此，有学者认为“单纯应用胰蛋白酶消化对细胞的存活率有极大的负面影响”[1]，而TDTA作为一种化学螯合剂，价格低、毒性小，对细胞有一定的离散作用。
所以，选用胰蛋白酶与EDTA联合应用，可降低细胞损害，具有更好的消化分离效果。
另外，胶原酶作用较温和，通过水解细胞间胶原蛋白来实现离散组织的目的，对细胞的损伤较小，也是理想的细胞分离液，针对心肌细胞间含有不同胶原酶类型，可联合使用Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶。
且要知道的是在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主，故我们选用胶原酶I，文献报道胶原酶的工作浓度一般在0。
61 g·L-1，我们使用的为0。
8 g·L-1。
胶原酶最好现用现配。
3．污染防治
虽然污染本身是不可能完全避免的，但可以降低其发生率、减轻其产生的严重后果。
因此，我们在细胞培养过程中，要坚持无菌操作的原则，如做好实验室、超净台、实验器械及实验用液的消毒灭菌工作，个人要身着消毒衣帽，佩戴口罩及无菌手套，操作时，酒精灯火焰烧灼消毒器械，避免培养用液长时间暴露在空气环境，禁止吸管接触培养液瓶口等。
防止微生物污染常用的方法是在培养液中加入抗生素，由于抗生素的种类不同，其抗生范围也不尽相同，但多数针对细菌感染为主，常用青霉素和链霉素联合应用。
需要指出的是，抗生素的抗生范围有限，且污染发生具有隐匿性，出现后往往后果严重，所以抗生素仍不能替代无菌操作，而且过度的强调抗生素的作用，会使实验者淡化甚至忽视无菌操作，滥用也会导致产生耐药菌，因此，只有无菌操作才是防止细胞污染的最好手段。
除了以上说的无菌操作还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道，比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会。
(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染。
(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则
既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率。
4．心肌细胞纯化
在心肌细胞培养中，成纤维细胞具有分裂增殖能力，且生长迅速，比心肌细胞更早贴壁，如不加以控制，常可生长为优势细胞。
细胞纯化方法有很多因此，目前，常用化学试剂抑制法和差速贴壁分离法来抑制其生长，而化学试剂势必对培养细胞生长环境有一定影响，因此，依据心肌细胞与成纤维细胞贴壁时间不同的原理做差速分离，成了广泛采用的纯化方法，其优点是对目的细胞影响小，经比较，结果显示差速贴壁在60min、90min时最为理想[2]方法简便，纯化率较高，可达到95%以上。
经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞。
因此再加上化学试剂抑制，加入分裂抑制剂(如丝裂霉素c)，有时在培养早期如入溴脱氧脲苷，或加入不利非心肌细胞生长的成分(如谷氨酰胺)。
如溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine，BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长，但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长。
改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90%以上的心肌细胞[3]。
离心淘洗:通过各种转子速度和淘洗介质流速的选择对心肌细胞进行纯化，如转速度3 200 r/min，泵速设定20-80 mL/min，在80 mL/min时回收心肌细胞。
结果表明：差速贴壁易于实施，对细胞损伤小，但非心肌细胞不能彻底除去，离心淘洗能够得到较为理想的纯化目的，但代价高，梯度离心既便于实施也能较为彻底地除去非心肌细胞[4]。
5．细胞接种密度
分离得到的心肌细胞在接种前，应精细计算细胞数量。
若接种数过大，可致过量心肌细胞无法贴壁生长而漂浮，过快耗尽培养液营养成分，影响正常贴壁细胞的生长及观察;若接种数过少，细胞间隙过大，难以进行细胞间信号通讯，不利于心肌细胞生长、产生一致性搏动。
同时，不同实验目的对接种细胞数有不同的要求，如用于基因及蛋白表达检测时，细胞接种数可在5~6 105/m，l用于心肌细胞形态观察时，细胞接种数可在1~2 105/ml[3]。
6．换液时间
进行心肌细胞形态学观测时。
接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少。
为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液。
这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加。
而且BrdU作用时间较长。
对成纤维细胞的抑制作用更确实。
此外，去血清后可用ITS和0。
1 g·L-1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响。
之后换不加BRDU的培养液，每两天换一次。
7．培养液PH值控制注意
适宜的pH范围在7。
2—7。
4之间，配制及使养液时应注意:(1) pH值会在过滤后上升0。
10。
3。
(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低程度与血清品质和含量有关。
(3)应及时换液。
(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃。
这是因为培养液中的CO2会溢出，使培养液pH上升。
每次配好的培养液尽量
在2 wk内用完，否则应部分置于-20℃保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3，再次过滤后方可使用。
8．培养心肌细胞存活的形态标志
倒置显微镜下观察刚分离的心肌细胞呈球形; 4h后开始贴壁生长; 19~24h时完全贴壁，细胞呈球形和梭形，以梭形为主，偶见单个细胞搏动。
心脏中有多种细胞，但能够产生自发搏动的只有心肌细胞。
48h后心肌细胞伸出伪足，且部分细胞间形成交联，这是心肌细胞存活的形态标志。
细胞核大且胞浆丰富，立体感明显，折光性强。
单个的细胞搏动频率较低，细胞交联后搏动的频率明显增加。
9．应用与讨论
心肌细胞培养已成为心血管研究的基本方法和手段之一，在医学领域有着广阔的应用前景体外培养心肌细胞，可建立多种心肌细胞病理模型，优点是: 1.可观测药物对心肌组织中细胞的直接作用。
2.通过染色等方法可直接观察到各种药物对活细胞影响的动态过程。
3.方法简便，可提高效率。
缺点是: 1.失去了整体调节、内环境及正常细胞比例和相互影响。
2.影响因素多，实验操作要求严格。
参考文献
1．郭军，鲍翠玉，林国生等·新生大鼠心肌细胞培养方法的改进[J]·心血管康复医学杂志，2006，15: 539。
2．邵华，金秀东，梁军等·不同差速贴壁时间对心肌细胞培养的影响实验性研究[J]·牡丹江医学院学报，2008，29: 3-4。
3．王涛，余志斌，谢满江，车红磊·新生大鼠心肌细胞培养技巧[J]·第四军医大学学报，2003，24（2）
4．宋新爱，林元喜，樊小力·心肌细胞的纯化[J]·中国病理生理杂志，2010，26（10）。
