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大鼠成体心肌细胞的分离和培养王亭忠;席雨涛;吴格如;马爱群【期刊名称】《第四军医大学学报》【年(卷),期】2005(26)17【摘要】目的: 探索稳定的大鼠成体心肌细胞的分离和培养方法. 方法: 应用主动脉逆行生物酶(5 g/L胰蛋白酶及1 g/L胶原酶)灌流法分离大鼠成体心肌细胞,免疫荧光染色法鉴定分离的心肌细胞,比较有无血清培养对心肌细胞的影响. 结果: 心肌细胞的存活率为95%以上;存活细胞呈杆状,形态完整,长宽比约为4～6∶ 1;无血清培养心肌细胞只能存活1 wk,形态不发生改变;而加血清培养心肌细胞可存活2 wk以上,但超微结构发生了改变,且不同血清浓度对成纤维细胞生长具有不同的作用. 结论: 主动脉逆行生物酶(胶原酶和蛋白酶)灌流法是比较理想的心肌细胞分离方法;血清对成体心肌细胞的培养起着重要作用.【总页数】3页(P1544-1546)【作者】王亭忠;席雨涛;吴格如;马爱群【作者单位】西安交通大学第一医院心血管内科,教育部环境与疾病相关基因重点实验室,陕西,西安,710061;西安交通大学第一医院心血管内科,教育部环境与疾病相关基因重点实验室,陕西,西安,710061;西安交通大学第一医院心血管内科,教育部环境与疾病相关基因重点实验室,陕西,西安,710061;西安交通大学第一医院心血管内科,教育部环境与疾病相关基因重点实验室,陕西,西安,710061【正文语种】中文【中图分类】R329.28【相关文献】1.组织块法体外分离培养大鼠脊髓成体神经干细胞 [J], 张辉;张硕;江正;余涛;钟林;尹宗生2.成体大鼠的骨髓间充质干细胞分离和体外培养的初步研究 [J], 何少健;陈维平;邝晓聪3.大鼠视网膜微血管内皮细胞的分离培养及血管形成体系的建立 [J], 崔丹;王哲;杨向红4.两种分离方法培养成体大鼠骨髓间充质干细胞的比较分析 [J], 高建鹏;龙琼先;张志波;侯宗柳;王辉;余小鸣5.大鼠成体肝卵圆细胞分离培养及诱导分化的初步研究 [J], 金世龙;刘宝华;刘宏鸣;杨俊涛;顾红光;申海军;肖静因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一种有效急性酶分离大鼠心肌细胞及复钙的方法程俊;曾晓荣;谭晓秋;李鹏云;文静;毛亮;杨艳【期刊名称】《泸州医学院学报》【年(卷),期】2016(39)1【摘要】目的：：本研究旨在探讨一种既简便又高效的急性酶分离大鼠心肌细胞及有效复钙的方法，拟建立一种稳定高效分离大鼠心肌细胞且复钙后细胞成活率高的方法，为进一步研究单个心肌细胞的各种生理机制等诸多实验提供有利的前提保障。
方法：应用II型胶原酶于Langendorff灌流装置下进行恒压或恒流灌流，得到横纹清晰、立体感较强的大鼠心肌细胞，然后应用三步法对心肌细胞进行复钙。
结果：应用Langendorff灌流系统对大鼠心脏进行恒压或恒流灌流II型胶原酶，成功得到横纹清晰、立体感较强的大鼠心肌细胞，且复钙后在台式液中存活率仍然高达50%。
结论：成功建立了一种既简便高效又稳定的急性分离大鼠心肌细胞且复钙后心肌细胞成活率较高的方法，为今后研究大鼠心肌细胞舒缩功能及其基本生理特性提供良好的单个细胞。
%Objective To establish a simple and efficient method for acute isolation of myocardial cells and effective recovery of calcium in rats, so as to provide a favorable prerequisite protection of cardiomyocytes for further downstream studies of the physiological mechanism of single myocardial cell and many other experiments. MethodsUsing type II collagenase in Langendorff irrigation flow device under constant pressure or constant flow perfusion, cardiomyocytes were isolated from rats, followed by a three-step calcium recovery was applied. Results Cardiomyocytes were successfully isolated from rats usingLangendorff irrigation flow system at a constant pressure or constant flow perfusion of collagenase type II, which showed a clear cross striations and strong three-dimensional sense of myocardial cells. After calcium recovery, the survival rate of cardiomyocytes remains as high as 50% in Tyrode solution. Conclusion A new and high efficient method of acute isolation of cardiomyocytes in rats was established successfully, which can provide functional single cardiomyocyte for further downstream studies.【总页数】3页(P31-33)【作者】程俊;曾晓荣;谭晓秋;李鹏云;文静;毛亮;杨艳【作者单位】医学电生理学教育部重点实验室，四川医科大学心血管医学研究所，四川泸州646000;医学电生理学教育部重点实验室，四川医科大学心血管医学研究所，四川泸州646000;医学电生理学教育部重点实验室，四川医科大学心血管医学研究所，四川泸州646000;医学电生理学教育部重点实验室，四川医科大学心血管医学研究所，四川泸州646000;医学电生理学教育部重点实验室，四川医科大学心血管医学研究所，四川泸州646000;医学电生理学教育部重点实验室，四川医科大学心血管医学研究所，四川泸州646000;医学电生理学教育部重点实验室，四川医科大学心血管医学研究所，四川泸州646000【正文语种】中文【中图分类】R33-33【相关文献】1.豚鼠心肌细胞急性酶分离方法 [J], 周亮;曾晓荣;杨艳;刘智飞;李妙龄;裴杰2.大鼠心肌细胞急性分离方法及影响因素探讨 [J], 任静娜;马宏昕;饶本龙;许正新3.膜片钳研究中的钙耐受大鼠心肌细胞分离方法 [J], 徐华娥;陶金;陈洁;汪红仪;李胜男4.成年大鼠心肌细胞的急性分离方法 [J], 韦丽兰;莫书荣5.一种改良的原代大鼠乳鼠心肌细胞分离及培养方法 [J], 程俊;曾晓荣;谭晓秋;李鹏云;文静;陈琳琳;杨艳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大鼠原代心肌细胞提取方法原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。
乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点：1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。
新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。
因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。
建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。
2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。
常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。
3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。
新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。
消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。
4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。
分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。
成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。
溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。
由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。
5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。
操作过程：手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5）放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。
大（小）鼠心肌细胞的急性分离准备工作:1 器械：恒温水浴锅（泵）Langendorff装置氧气手术器械平皿烧杯50ml注射器玻璃离心管吸管冰袋步骤: 1用去离子水清洗器械和Langendorff装置、打开恒温水浴、提前拿出-20℃的KB液放到水浴中使之融化。
2 配置无钙液：50ml的10X台式母液+450mlddH2O+1g葡萄糖，用NaOH调节PH至7.35～7.45。
将无钙液通氧5min。
3 配置有钙液：200ml无钙液+0.4ml 0.9MCaCl2。
4 配酶：10mgⅡ型胶原酶+10mgBSA溶解到80ml无钙液中。
5 将70ml有钙液从Langendorff装置下端注入弯管中，注意千万不要有气泡，然后将氧气针头插入Langendorff管中，打开氧气。
6 取心脏，修理主动脉边缘至平整，助手将Langendorff装置打开，速度不能太快，1滴1滴即可。
7 用平镊和弯镊夹住主动脉，迅速挂在Langendorff装置上，用线系紧，注意：针管不能深也不能浅，心脏挂上后能横过来就可以，系线时不要系到组织。
8 打开装置阀门，让液体以固定的流速流入心脏，注意装置上方要保持有液体，否则大量气泡进入会导致分离失败。
9 有钙液泵完时，加入无钙液至心脏停跳，此时加入酶。
10 用烧杯接下45ml左右的液体弃掉，此时开始计时，其余液体循环利用，消化开始。
11 消化的过程是快—慢—快，当流下的液体变得粘稠，心脏松软粉嫩时即可，大约30min。
12 将通过氧的KB液装入准备好的离心管中，剪下左心室组织，剪碎，吹打，将细胞吹下后弃去组织。
剩下的细胞悬液放到4℃冰箱中，静置1—2小时待用。
实验所需药物及液体的配置：1 台式母液(10x、g/500ml)NaCl：39.74 KCl：2.01 HEPES：11.915 MgCl2.6H2O：1.0165 2 KB营养液（—20℃保存、g/500ml）用KOH调节PH7.35-7.45GLutamic acid：5.15 T ourine：0.9375 KCl：1.1185 HEPES：1.1915 MgCl2.6H2O：0.05075 EGTA：0.095 Glucose：0.991KH2PO4：0.683CaCl2母液：0.9mol/L或1.8mol/L4无钙液：50ml台式母液+450mlddH2O+1g葡萄糖5有钙液：200ml无钙液+0.4ml的0.9mol/L CaCl2母液或0.2ml的1.8mol/L CaCl2母液6酶：10mgⅡ型胶原酶+10mgBSA溶解到80ml无钙液中7F-127：2mg+1ml有钙液（4℃保存）8Flou-3：一管新的+50ulDMSO(-20℃保存)9染色液：894μl有钙液+100μl F-127+6μl Flou-310KCl：0.09g溶于1mlddH2O中（这样保证浴槽中的浓度为30mmol/L）11BSA：40mg溶于1mlddH2O中（用来保护心肌细胞）。
成年大鼠心室和窦房结细胞急性分离方法和动作电位比较范茁【期刊名称】《《实验技术与管理》》【年(卷),期】2019(036)010【总页数】3页(P86-88)【关键词】心室肌细胞; 窦房结细胞; 动作电位; 动作电位时程; 静息电位【作者】范茁【作者单位】华南理工大学生物科学与工程学院广东广州 510006【正文语种】中文【中图分类】R-332心脏是人及动物重要的供血器官，它靠有规律的博动向周围器官和组织运输新鲜血液，供应氧气和各种养分，使其维持正常的代谢功能[1]。
心脏规律性搏动的本质是动作电位的产生和传导引起的心肌细胞的扩布性舒缩[2-3]。
窦房结（sinoatrial node，SAN）位于上腔静脉和右心房交界处的界沟上端，其作为心脏的起搏点，控制心脏正常的节律性活动，窦房结的起搏细胞（P细胞）产生自发兴奋性动作电位，并将冲动传至新房肌细胞、房室结，进而由房室束传至心室肌细胞，引起心室收缩[4-6]。
在细胞水平研究心脏生理及病理条件下的功能、信号转导机制及药物作用机制在基础研究和临床应用领域都有很重要的作用。
酶解法是获得成年大鼠心肌细胞的主要方法[7-9]，膜片钳实验方法则是研究心肌细胞电生理的主要技术手段[10-12]。
本文介绍成年大鼠心室肌细胞和窦房结细胞的急性酶解分离方法，通过膜片钳技术手段记录二者的动作电位波形，并对二者动作电位形态、时程、静息电位等参数进行分析和比较。
（1）台式液（Tyrode, in mM）：NaCl(120), KCl(5.4), HEPES(25), MgCl2 (0.5), NaH2PO4(0.33), Taurine(10), Glucose(20). 室温调节PH值至7.2。
（2）KB液（in mM）：KOH(80), KCl(40), NaH2PO4(25), MgSO4(3), L-glutanic acid(50), Taurine(20), EGTA(1), HEPES(10), Glucose(10). 室温调节PH值至7.2。
成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察北京心肺血管疾病研究所细胞免疫室许秀芳 李温斌* 陈宝田* 吕燕宁 赵莉敏 陈 燕提要:为探索稳定的成年大鼠心肌细胞的分离和培养方法,应用生物酶(5g/L胰蛋白酶及1g/L胶原酶)灌注法分离成年大鼠心肌细胞,用形态学及台盼蓝染色法鉴定分离的心肌细胞,并在光镜和电镜下观察和摄像记录。
结果:心肌细胞的存活率为91.7%;存活的心肌细胞静止地贴在培养板底上,细胞完整,呈杆状,长宽比约为4~6 1。
结果提示:该方法是比较理想的心肌细胞培养法。
关键词:成年大鼠心肌细胞;胰蛋白酶;胶原酶;分离技术中图分类号:Q253;R322.1+1自从1953年Durrows和M oscona首次成功地应用生物酶分离出鸡胚心肌细胞后[1],其分离培养技术不断发展,逐渐发展为3种分离方法:离体心脏灌注法、心肌细胞浸泡法和贴块培养法。
对动物而言,离体心脏生物酶灌注法分离心肌细胞的质量及数量最佳。
成年心肌细胞的分离较幼年及新生动物心肌细胞的分离更为困难,但成年心肌细胞做为一种生物学实验工具是其他心肌细胞不可替代的。
国内仅有少数单位分离培养成功成年动物心肌细胞。
1992年1月至1998年12月,我们建立了成年大鼠心肌细胞分离培养方法并进行了形态学观察。
1 材料和方法1.1 材料实验动物为成年Wistar大鼠,体质量150~200g,由本研究所实验动物室提供。
DMEM培养液、胰蛋白酶均购自美国GIBC公司;胶原酶购自美国Sigma公司;牛血清白蛋白购自美国BM公司;胎牛血清由金华生物制品公司提供;淋巴细胞分离液由中科院血液学研究所出品;安贞号心脏停跳液由本院体外循环组提供。
实验药物及试剂的配制:2%胎牛血清20 mL加DMEM培养液100mL,青霉素100mg/ L,链霉素100万U/L,pH7.2~7.4,过滤除菌。
酶消化液:胶原酶0.1g加胰蛋白酶0.5 g、牛血清白蛋白1g,加入DM EM培养液100 mL,于使用前配制。
成年SD大鼠心肌细胞分离及其胞内钙离子动态变化测定（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的：建立稳定的成年SD大鼠心肌单细胞分离方法，并对心肌细胞内Ca2+动态变化进行测定。
方法：用改进的Langendorff装置，行大鼠主动脉插管逆向灌流(温度、pH、水质恒定)，用混合液(0.6mg/mL胶原酶Ⅱ+0.06mg/mL蛋白酶+1mg/mL牛血清白蛋白)消化心脏，经3次不同浓度含钙台式液复钙后得到钙稳态心肌细胞；室温静置1～2h后于激光共聚焦显微镜下测定Ca2+的动态变化。
结果：得到70%～90%长杆状活细胞，钙稳态心肌细胞可占40%～60%；fluo_4 AM负载染色后可记录到典型的诱发钙瞬变。
结论:胶原酶和蛋白酶混合液主动脉逆向灌流方法可以得到具有正常生理功能的钙稳态心肌细胞，可用于心肌细胞内钙信号研究。
【关键词】大鼠心肌细胞细胞分离激光共聚焦显微镜Cardiomyocyte Isolation from Adult SD Rat Heart for Confocal Microscopic Intracellular Ca2+ Imaging［Abstract］Objective: To develop a stable method for adultSD rat single cardiomyocyte isolation，and then to determine the intracellular Ca2+ signalling by confocal imaging. Methods: Rat heart was digested by aorta retrograde perfusion with mixture ［collagenaseⅡ(0.6 mg/mL), pronase(0.06 mg/mL)and bovine serum albumin(1 mg/mL)］using a modified Langendorff system. The temperature, pH and water quality should be properly controlled in the process of digested rat heart. Three times of re_calcification with different concentration of Ca2+ Tyrode solution were used to procure calcium homeostasis ventricular cardiomyocytes. Single cell was used for confocal microscopic Ca2+ imaging after storage at room temperature for 1～2 hours. Results: There were about 70%～90% rod_shaped fresh viable cells, in which 40%～60% were calcium homeostasis cells. In single calcium homeostasis cardiomyocytes calcium transients could be evoked by a stimulator and recorded with an LSM510 confocal microscopic system after incubation with fluo_4 AM. Conclusion: Aorta retrograde perfusion with collagenaseⅡand pronase is a proper method to procure single calcium homeostasis cardiomyocytes from adult SD rat with normal physiological features, and fit for confocal microscopic Ca2+ imaging.［Key Words］rat; cardiomyocyte; cell isolation; laser scanning confocal microscopy随着心脏疾病研究的不断发展，具备正常生理功能的单个心肌细胞已成为研究心脏代谢、功能、病理生理机制的重要基础，心肌细胞内钙离子浓度(［Ca2+］i)变化是一系列心脏疾病的诱因及病理基础。
成年大鼠心肌细胞的分离和培养技术Ξ王 影1,孙 红2,范乐明1,周 峰2(1.南京医科大学动脉粥样硬化研究中心,江苏南京210029;2.徐州医学院生理学教研室,江苏徐州221002) 摘要:目的 建立稳定的成年大鼠心肌细胞分离和培养方法,以便进行成年大鼠心肌细胞收缩功能的研究。
方法 将成年大鼠心脏挂于Langendorff装置上灌流,胶原酶消化分离成年大鼠心肌,无血清悬浮培养心肌细胞。
光镜观察,结合形态学和收缩功能评价心肌细胞。
结果 新分离的心肌细胞的收获量为(4～6)×106个,杆状和圆形,其中长杆状细胞大于75%,横纹清晰,收缩幅度(12.00±2.68)%。
无血清培养24h后,细胞保持完整的形态结构,长杆状心肌细胞占总数的70%以上,收缩幅度(11.78±1.59)%,与刚培养时的细胞相比,无显著差别(P >0105)。
结论 通过本方法可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离培养。
关键词:心肌细胞;细胞分离;细胞培养;大鼠中图分类号:Q813.1+1 文献标识码:A 文章编号:1000-2065(2005)05-0393-04Isolation and culture of adult rat cardiomyocytesW ANG Y ing,S UN H ong,FAN Le-ming,et al(Atherosclerosis Reserch Center,Nanjing Medical University,Nanjing,Jiangsu210029,China)Abstract:Objective T o build a stable method for is olation and culture of adult rat cardiomy ocytes.Methods The is o2 lated adult rat heart was m ounted on to the Langendorff apparatue for perfusion and hallogenase digestion.The treated heart was processed to get the suspension of single cardiomy ocytes for culture in serum-free DME M medium.The m orphology and cont2 ractile function of the cardiomy ocytes were studied under optical microscope to compare the fresh and cultured cardiomy ocytes. R esults The total of freshly is olated adult rat cardiomy ocytes was(4-6)×106and m ore than75%of them were rod-shaped cells with clear cross-striations.The amplitude of unloaded shortening in fresh cardiomy ocytes was(12.00±2.68)%.In the 24h cardiomy ocyte culture,the rod-shaped cells accounted for m ore than70%and their amplitude of unloaded shortening was (11.78±1.59)%.N o differences were noticed between the freshly is olated cells and the cultured ones(P>0.05).Conclu2 sion Adult rat ventricular cardiomycytes can be well is olated and cultured by using the stated method.K ey w ords:cardiomy ocytes;cell is olation;cell culture;rat 随着科学技术的进步和心脏研究的不断发展,单个心肌细胞已成为研究心脏结构、代谢、功能、病理生理及其机制的重要工具,特别是近年来,心肌细胞电生理和分子生物学研究及心肌中功能相关基因研究的兴起,使得成熟心肌细胞被越来越多地应用于心血管病理生理的研究。
