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成年SD大鼠心肌细胞分离及其胞内钙离子动态变化测定（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的：建立稳定的成年SD大鼠心肌单细胞分离方法，并对心肌细胞内Ca2+动态变化进行测定。
方法：用改进的Langendorff装置，行大鼠主动脉插管逆向灌流(温度、pH、水质恒定)，用混合液(0.6mg/mL胶原酶Ⅱ+0.06mg/mL蛋白酶+1mg/mL牛血清白蛋白)消化心脏，经3次不同浓度含钙台式液复钙后得到钙稳态心肌细胞；室温静置1～2h后于激光共聚焦显微镜下测定Ca2+的动态变化。
结果：得到70%～90%长杆状活细胞，钙稳态心肌细胞可占40%～60%；fluo_4 AM负载染色后可记录到典型的诱发钙瞬变。
结论:胶原酶和蛋白酶混合液主动脉逆向灌流方法可以得到具有正常生理功能的钙稳态心肌细胞，可用于心肌细胞内钙信号研究。
【关键词】大鼠心肌细胞细胞分离激光共聚焦显微镜Cardiomyocyte Isolation from Adult SD Rat Heart for Confocal Microscopic Intracellular Ca2+ Imaging［Abstract］Objective: To develop a stable method for adultSD rat single cardiomyocyte isolation，and then to determine the intracellular Ca2+ signalling by confocal imaging. Methods: Rat heart was digested by aorta retrograde perfusion with mixture ［collagenaseⅡ(0.6 mg/mL), pronase(0.06 mg/mL)and bovine serum albumin(1 mg/mL)］using a modified Langendorff system. The temperature, pH and water quality should be properly controlled in the process of digested rat heart. Three times of re_calcification with different concentration of Ca2+ Tyrode solution were used to procure calcium homeostasis ventricular cardiomyocytes. Single cell was used for confocal microscopic Ca2+ imaging after storage at room temperature for 1～2 hours. Results: There were about 70%～90% rod_shaped fresh viable cells, in which 40%～60% were calcium homeostasis cells. In single calcium homeostasis cardiomyocytes calcium transients could be evoked by a stimulator and recorded with an LSM510 confocal microscopic system after incubation with fluo_4 AM. Conclusion: Aorta retrograde perfusion with collagenaseⅡand pronase is a proper method to procure single calcium homeostasis cardiomyocytes from adult SD rat with normal physiological features, and fit for confocal microscopic Ca2+ imaging.［Key Words］rat; cardiomyocyte; cell isolation; laser scanning confocal microscopy随着心脏疾病研究的不断发展，具备正常生理功能的单个心肌细胞已成为研究心脏代谢、功能、病理生理机制的重要基础，心肌细胞内钙离子浓度(［Ca2+］i)变化是一系列心脏疾病的诱因及病理基础。
贯叶金丝桃苷对心肌细胞作用的初步研究覃振明;孔晓龙;梁凯;莫凤珍;黄绍德;汪永玲;李云龙【期刊名称】《齐齐哈尔医学院学报》【年(卷),期】2011(032)016【摘要】目的研究贯叶金丝桃苷(Hyp)对原代培养大鼠心肌细胞的初步作用.方法对出生1～3 d的SD大鼠乳鼠分离心肌细胞进行原代培养,以不同浓度的贯叶金丝桃苷给药,采用四甲基噻唑蓝(MTT)法检测Hyp对心肌细胞的毒性,并观察Hyp对H2O2损伤心肌细胞的影响.结果 Hyp体外对心肌细胞的TC50 =8.946g/L,TC10=0.028 g/L.Hyp各剂量组可显著降低H2O2损伤的心肌细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)含量,同时可以降低H2O2损伤所导致的心肌细胞死亡.结论 Hyp 对心肌细胞的生长抑制率低；可以对抗H2O2所造成的损伤,对心肌细胞有保护作用.【总页数】2页(P2572-2573)【作者】覃振明;孔晓龙;梁凯;莫凤珍;黄绍德;汪永玲;李云龙【作者单位】广西医科大学药学院药理教研室,南宁;广西医科大学药学院药理教研室,南宁;广西医科大学药学院药理教研室,南宁;广西医科大学药学院药理教研室,南宁;广西医科大学药学院药理教研室,南宁;广西医科大学药学院药理教研室,南宁;苏州大学附属第一医院,江苏,530021【正文语种】中文【相关文献】1.酶法提取贯叶金丝桃中金丝桃苷的工艺 [J], 宁娜;韩建军;胡宇莉;邹宗尧;郁建生2.HPLC法同时测定贯叶金丝桃中芦丁、金丝桃苷和槲皮素的含量 [J], 传娟娟;张宝阳3.HPLC法测定药材贯叶金丝桃中金丝桃苷和槲皮素的含量 [J], 田红林;成杰;轩辕欢4.槲皮素与贯叶连翘提取物合用抗抑郁作用初步研究 [J], 刘健翔;方吟荃;魏峥曦;杨幸巧;曾玲晖5.贯叶连翘提取物中金丝桃苷的分析鉴别与稳定性研究 [J], 王怀冲;范国荣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
藤茶中杨梅素和二氢杨梅素的分离及抗心肌细胞凋亡作用姜仕先;董乃维;张婧;甘春丽;刘凤芝【期刊名称】《哈尔滨医科大学学报》【年(卷),期】2008(42)1【摘要】目的利用聚酰胺法从藤茶中分离得到杨梅素（MYR）和二氢杨梅素（DMY），研究其对心肌细胞的保护作用。
方法通过水提法得到总黄酮，上聚酰胺柱，以醇水梯度洗脱分离，收集30％～50％醇馏分得DMY的单体，60％～70％醇馏分中收集到MYR单体。
用流式细胞仪（FCM）检测两种化合物对心肌细胞凋亡的影响。
结果FCM检测结果显示，MYR和DMY对H2O2诱导的心肌细胞凋亡有明显抑制作用。
结论聚酰胺法能够分离得到MYR和DMY单体；MYR及DMY有抑制心肌细胞凋亡作用。
【总页数】4页(P4-6)【关键词】杨梅素;二氢杨梅素;心肌细胞;凋亡;聚酰胺法【作者】姜仕先;董乃维;张婧;甘春丽;刘凤芝【作者单位】哈尔滨医科大学药学院药物化学与天然药物化学教研室【正文语种】中文【中图分类】R284.2【相关文献】1.UPLC法测定藤茶中二氢杨梅素与杨梅素的含量及其热稳定性 [J], 樊兰兰;何丽丽;韦玮;曹芬;张亚洲;缪剑华2.高效液相色谱法测定藤茶中二氢杨梅素和杨梅素含量 [J], 陈图锋;高文华;唐敏3.HPLC法同步测定莓茶中二氢杨梅素、杨梅苷、杨梅素含量 [J], 张学英4.藤茶双氢杨梅树皮素对人视网膜母细胞瘤HXO-RB_(44)细胞凋亡的诱导作用 [J], 唐琪;郑作文;蒋林志;严宇清;何剑峰;梁皓5.利用高速逆流色谱法同时纯化藤茶中的二氢杨梅素和杨梅素 [J], 张友胜;施英;徐玉娟;肖更生;刘学铭因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
乳鼠心肌细胞培养经验谈1. 心肌细胞搏动差，取材后2、3天细胞活力明显下降：胰酶＋胶原酶II混合消化的方法,并且每次消化前都轻柔的吹打让组织充分和消化液混合，消化后也充分吹打后静置1－2分钟再吸上清，最后离心完成后，用培养基重悬沉淀是要充分吹打，以避免再下一步过滤时大量的丢失细胞。
还要保证种板的密度，一般24孔板我们用2。
5×105，每孔1ml，这样24h后就可以很漂亮的看到细胞搏动了，一般72h后搏动就是统一的频率了。
经验一：总结来说:1。
0.08%胶原酶II＋0。
125%胰酶等比混合后消化2.消化前后一定要轻柔吹打3.重悬时要充分吹打,动作轻柔（100次）4。
种板密度要合适5.当然血清,板都要进口，别图便宜6.别忘了检查CO2温箱的情况2.消化时总是出现冻冻状东西啊,吸时会把组织快吸走：胶冻样的东西应该是组织间未消化掉的胶原吧,或消化后的碎细胞ＤＮＡ．用ＤＮＡ酶消化后就没了。
经验二:1:首先是选择乳鼠时最好是出生3天内的,活力是较好的,皮肤看起来是暗红色的,再大一点的话,皮肤变厚，变白，不过也能养活，而且1个25CM2的培养瓶3只足够了，当然这里说的是SD的。
2：胰酶加胶原酶消化，消化过程中出现絮状物，可能是消化有些快了，处理：如果样品足够多就可以将之丢去；样品少的话，可以先将所有的样品吸入另一新的离心管，重新在这个管字消化，将细胞悬液用5％血清培养液中止消化，而且一定得尽快中止，离心后再中止一次即可。
离心1000转4分钟.3：四季清的胎牛血清,180元一瓶，很便宜，进口的没用过,我们隔壁有人用2000元一瓶.这个和老板有没有钱有关系,要是有钱，我建议用进口的。
我们用的是15%的浓度。
（注意:终止液和培养液浓度是不同的，终止液没必要用那么高浓度，有点浪费）,我们用高糖的DMEM，感觉不错。
在这里我感觉最重要的培养液的PH 值，尽量在7。
2—7。
4之间,刚开始我们还有仪器测，后来就观察颜色了,觉得不行就用HCL或NAOH调，大部是高，没有低的。
司型！ｊ医刊 ０（】苎生 登型ｌｏ—基 ！三 ｒ—ｎａｉ…ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍ—ｅｄｉｃｉｎｅ Ｍａｙ． 呈 ｖ一 ， ： Ｑ ・１・ ・论 著・ 心力衰竭大鼠心肌细胞的分离培养和病理生理特性研究
王彤 万智 黄辉 符岳 黄子通 （１．中山大学附属第二医院，广州 ５１０１２０；２．四川大学华西医院急诊科）
【摘要】 目的 分离培养，，２２力衰竭（心衰）大鼠心肌细胞，以及利用ＩｏｎＯｐｔｉｘ‘ 系统观察心衰大鼠离体心肌细胞的收缩 舒张特性，并与正常的心肌细胞进行对比。方法开胸结扎５只大鼠左前降支冠状动脉，４周后将心衰后的大鼠心脏挂 于Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆ装置上灌流，胶原酶消化分离大鼠心肌，Ｌａｍｉｎｉｎ附壁无血清培养心衰后的心肌细胞。光镜观察心衰后心 肌细胞的形态学特点，用含氧台氏液灌流并予电场刺激（０、５ Ｈｚ，３ ｍｓ），利用ＩｏｎＯｐｔｉｘ 系统检测其收缩／舒张功能并与５ 只正常大鼠心肌细胞进行对比。结果心力衰竭大鼠有明显的心衰症状。Ｂ超显示心衰大鼠射血分数与结扎前相比明 显降低［（５５ ４－３）％和（７８ ４－４）％，Ｐ＝０、００００２］。平均单个心衰的心脏所分离的心肌细胞的收获量明显比正常心脏少 ［（５．６±０、３）ｘ １０。和（８、１±１、２）ｘ １０ ，Ｐ＝０．００１４］。与正常心肌细胞相比，心衰大鼠长杆状心肌细胞显著变长 ［（１５２ ４－１９） ｍ和（１３３ ４－１７） ｍ，Ｐ＝０．０３］；收缩幅度显著减少［（７、５±３、２）％和（１２．６ ４－３．０）％，Ｐ＝０、００１６］；收缩速 度显著减慢［（３６ ４－１８）ｉ￣ｍ／ｍｓ和（６０ ４－１９）ｐｍＣｍｓ，Ｐ：０．００９］。结论与正常大鼠心肌细胞相比，心衰大鼠心肌细胞具 有显著的病理生理学特性，因而可用于病理及药物干预下心衰大鼠心肌细胞功能变化的研究。 【关键词】 心肌细胞；心力衰竭；细胞分离；ＩｏｎＯｐ！ｉｘ 系统；心功能；大鼠 Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ ａｎｄ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐａｔｈ０ｐｈｙｓｉ０ｌ０ｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ＷＡＮＧ ７ｂｎｇＬ，ＷＡＮ Ｚｈ ，ＨＵＡＮＧ Ｈｕｉ Ｌ，ＦＵ Ｙｕｅｌ，ＨＵＡＮＧ Ｚｉｔｏｎｇ１．、．Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ ａｆｆｉｌｉａ— ｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａ ，Ｓｕｎ Ｙａｔ—Ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅ￣ｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０１２０，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＥｍｅｒｇｅｎｃｙ， ｚ — ｎａ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｅｙｔｅｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ ａｎｄ ｏｂｓｅｒｖｅ ｐａｔｈ０ｐＩ１ｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈ ａ［ｏｎＯｐｔｉｘ’”ｓｙｓｔｅｍ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｏｐｅｎｅｄ ｃｈｅｓｔ ０ｆ ５ ｒａｔｓ ａｎｄ ｌｉｇａｔｅｄ ｔｈｅ １ｅｆｔ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ（ＬＡＤ）．Ｆｏｕｒ ｗｅｅｋｓ ｌａｔｅｒ，ｆｉｎｉｓｈｅｄ ｅｅｈｏｅａｒ— ｄｉｏｇｒａｐｈｉｃａｌｌｙ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｅｊｅｃｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ（ＥＦ），ｔｈｅ ｈｅａｒｔ ｗａｓ ｃｕｔ ａｎｄ ｈａｎｇｅｄ ｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ｐｅｆｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ｔ１１ｅ ｓｉｎｇｌｅ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｓｅｒｕｍ—ｆｌｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ｌａｍｉｎｉｎ—ｃｏｖｅｒｅｄ ｄｉｓｈｅｓ．Ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ。 Ｗｉｔｈ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｅｌｄ—ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ（０．５ Ｈｚ，３ ｍｓ），ｔｈｅ ｃａｒｄｉ０ｎ１ｙ０ｃｙｔｅｓ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｉｍ— ｕｈａｎｅｏｕｓｌｙ ｒｅｃｏｒｄｅｄ ｂｙ １ｏｎＯｐｔｉｘ” ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｅｙｔｅｓ ｏｆ ５ ｎｏｒｍａｌ ｒａｔｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｏｂｖｉｏｕｓ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ ｒａｔｓ．ＥＦ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｒａｔｓ ４ ｗｅｅｋｓ ａｆｔｅｒ ＬＡＤ ｌｉｇａｔｅｄ ｆ（５５±３）％ｖｓ（７８±４）％．Ｐ＝０．００００２ ｆ．Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｏｆｆｌｅｓｈｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ ｒａｔｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｎｏｒｍａｌ ｒａｔｓ［（５．６±０．３）ｘ １０。ｖｓ（８．１±１．２）ｘ １０。．Ｐ＝０．００１４］．Ｒｏｄ— ｓｈａｐｅｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ ｒａｔｓ ｂｅｃａｍｅ ｌｏｎｇｅｒ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｔｈａｎ ｒｏｄ—ｓｈａｐｅｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｒａｔｓ［（１５２±１９） Ｉ，ｔｍ ｖｓ（１３３±１７） ｎｌ，Ｐ＝０．０３］．Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｏｆ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ／ｒｅｌｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ ｒａｔｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｅｓｓｅｎ ｔｈａｎ ｔｈｅｓｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｒａｔｓ［（７．５±３．２）％ｖｓ（１３± ３）％，Ｐ＝０．００１６；（３６±１８）￣ｍ／ｍｓ ｖｓ（６０±１９）ｂ￣ｍ／ｍｓ，Ｐ：０．００９］．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｅａｒ— ｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｎｏｒｍａｌ ｒａｔｓ，ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ ｒａｔｓ ｈａｖｅ ｏｂｖｉｏｕｓ ｐａｔｈｏ— ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｔｈｅｓｅ ｄａｔａ ｃａｎ ｄｅｓｃｒｉｂｅ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｌｅｖｅｌ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｌｌｄ ｄｍｇｓ ｔｒｅａｔｎｌｅｎｔ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ；Ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ；Ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ＩｏｎＯｐｔｉｘ。。 ；Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ；Ｒａｔ 心 管疾病是发达国家和地区发病和死亡＝的最主 要原因，在美国大约占所有死亡病例的４０％【ｌ Ｊ。心脏 疾病及功能不伞的细胞学基础是由于心肌缺血及心肌 梗死造成大量有收缩能力的心肌细胞的丢失 ，加上 内源性修复机制的缺失，这是心血管疾病发展为心力衰 竭的重要原因 。心肌损伤之后的左心搴病砰 建，往 往由非心肌细胞所产生的细胞外基质为主的纤维瘢痕 所取代，从而导致左心室功能的丧失 。。尽管心血管疾 病治疗手段不断的多样化，治疗水平也不断提高，例如 持续的药物治疗和血管再通技术的发展，但超过５０％的 病人仍然在初步诊断为心力衰竭之后的５年内死亡 。 心力衰竭是心脏病发展到晚期的主要表现。探索心力
心脏细胞肌动蛋白结构与功能的研究心脏是人类身体里最重要的器官之一，它的正常工作对人类的生命至关重要。
其中起到至关重要作用的就是心肌细胞。
而心肌细胞的功能和结构与肌动蛋白密不可分。
肌动蛋白是心肌细胞内最重要的结构蛋白质之一，而心脏是人类身体中需要最多肌动蛋白的器官之一。
近年来，关于心脏细胞肌动蛋白结构与功能的研究一直是心血管医学领域中的热门话题。
1. 肌动蛋白的结构肌动蛋白是人类身体中最重要的细胞骨架蛋白之一，它是一种螺旋状的结构分子。
肌动蛋白分子的其中一个端部是肌动蛋白头（myosin head），这是肌动蛋白分子中最活跃的部分，负责肌肉的收缩。
肌动蛋白的另外一个端部是肌动蛋白尾（myosin tail），此为它的结构区域。
在心肌细胞中，肌动蛋白是以纤维形式存在的，在细胞内形成复杂的肌纤维束。
2. 肌动蛋白在心肌细胞中的功能肌动蛋白是心肌细胞中收缩和松弛过程中关键的蛋白质。
在心肌细胞收缩时，肌动蛋白分子的肌动蛋白头部分将ATP分子转化为能量，同时通过肌球蛋白（troponin）和辅助蛋白（tropomyosin）控制肌动蛋白头部与肌动蛋白纤维的结合与分离，从而实现心肌细胞的收缩。
同理，在心肌松弛的过程中，肌动蛋白的ATP酶活性降低，肌球蛋白和辅助蛋白也控制着肌动蛋白与肌纤维的分离。
通过肌动蛋白在心肌细胞中的这一作用，心肌细胞可以完成收缩和松弛，并通过上述过程将血液送出到人体各个部位。
3. 肌动蛋白研究中的突破与进展近年来，心血管疾病越来越成为世界上人类的重要健康问题。
而心血管疾病的治疗与研究跟人类对心脏肌肉的研究密切相关。
不过，尽管该领域的研究已经持续了几十年，我们对于肌动蛋白的细微结构和动态蛋白网络的总体理解还是相当有限的。
近年来，蛋白质学的快速发展，使得科学家们可以对心肌细胞中肌动蛋白蛋白质进行更深入的研究。
研究人员发现肌动蛋白蛋白质复杂的动态性质、活动过程和肌肉收缩过程中肌动蛋白头和肌动蛋白纤维的结合方式。
急性分离大鼠心肌细胞：1，准备工作：a，器械：恒温水浴锅，langendorff装置，氧气，剪刀，止血钳，平镊，弯镊，眼科剪，平皿2个，500ml烧杯2个，100ml量筒1个，100ml注射器1个，1ml注射器2个，试管5-7个，吸管2个b，液体：母液，NaOH(3mol/L),CaCl2(0.9mol/L),葡萄糖（细胞营养），II型胶原酶，BSA（胎牛血清蛋白，心肌细胞保护作用使其不至被酶损害），KB液（细胞保存液）。
2，步骤：a，打开水浴锅，调节温度到37-37.5℃，提前拿出-20℃的KB液放在水浴锅中融化。
b，洗涤所有玻璃器皿，并用去离子水冲洗。
c，用去离子水从上倒入冲洗langendorff装置，用注射器从装置下端打入弯管中冲洗3遍。
最后用少量去离子水液封装置，避免灰尘进入。
d，配制无钙液：60ml台氏母液＋540ml去离子水＋葡萄糖1.2g（100ml/0.2g），充氧30-50min （一般可充40min），用NaOH调节PH至7.35-7.40。
e，配制有钙液：每100ml台氏液加0.2ml CaCl2，混合均匀。
一般取300ml无钙液。
f，酶液配制：10mg II型胶原酶＋10mgBSA＋50ml无钙液溶解（酶液在取挂心脏结束后，再配制，避免酶液降解；先称取的酶应放于抽屉中避光保存。
）g，将有钙液用注射器从langendorff装置下端打入弯管中至上端脖颈处，注意不要有气泡，并将无钙液从装置上端倒入，打开氧气，将氧气针头插入langendorff管内。
（PS：如果出现气泡反复挤压灌流装置下端胶管，将气泡挤到弯管上端）h，将针头安装在langendorff装置最下端，注意不要有气泡。
（PS：可将三通装置的灌流方向堵住，轻推注射器使有钙液流出，用液体流的冲击力冲破针头安装处的表面张力，消除气泡。
）i，取成年大鼠一只，雌雄不限，给一定剂量的麻药（依据体重）将大鼠麻倒。
(或断髓) j，打开恒温水浴锅外循环，维持灌流液温度。
k，取心脏，挂心脏(取时速度要快，避免心腔淤血，影响灌流)（１）用止血钳夹住剑突下皮肤，剪刀垂直向下剪，待剪开皮肤后，水平向两侧剪，注意不要剪开胸膜。
（２）用止血钳夹住剑突，剪开膈，从顶部剪，暴露心脏，撕开心包膜，用弯镊将肺向下拉，带动心脏向下，注意镊子不要碰触心脏，用眼科剪将主动脉剪断，用左手轻拖住心脏，将心脏取下。
（３）将心脏放入预先4℃保存的有钙液中，并置于冰上修剪心脏，有血液泵出，或肺动脉圆锥附近，即为主动脉，用镊子和剪刀将主动脉的边缘修剪平整。
（PS：在修剪心脏时维持低温环境是减轻心脏跳动力，影响修剪。
修剪时，不要将心脏提出液体外，避免空气进入，影响灌流。
可将主动脉口用直镊夹住，然后用直剪进行修剪。
）（４）将langendorff装置打开一半，注意液体流速不要太快，成股即可，用平镊和弯镊将主动脉夹住（PS：不要将主动脉夹伤），顺着液体流提升并悬挂于langendorff装置下端针头处，不要太深，最后用平镊夹住主动脉，在贴近平镊下方用线系紧主动脉。
l，完全放开langendorff装置阀门，让液体以恒速流入心脏，由于流速较快，注意管上方要保持有液体，否则有大量气泡进入弯管，造成分离失败。
m，一直用无钙液冲洗心脏，至心脏颜色变浅，冠脉突出，心脏停止跳动。
（PS：右心房是最后停跳的。
）n，用酶液进行消化，待心脏停止跳动5-8min加入酶。
（PS ：有争议，通常实验时心脏一停跳，就加入酶消化。
但过多的钙存在时，应用胶原酶或蛋白酶会引起心肌细胞膜破裂。
）o，用50ml烧杯，接取前20ml流下的液体弃去，自此后接取的消化液要循环利用，消化开始，开始计时，计滴速。
p，消化过程，滴速由快变慢，由慢迅速变成滴下的液体有拉丝，心脏表面变粘（胶原等物质在消化液中存在），消化20-25min（仅做参考，冬夏季消化时间有差异），至表面韧性变低即可。
t，KB液充氧后，微调PH至7.20，将KB液装入标好的离心管中，分别剪右室，室间隔，左室，剪碎组织，放入离心管中吹打，弃去组织。
r，将细胞悬液放入4℃冰箱中稍静置1h。
PS：消化判断终点时，可先终止灌流，剪下右室下方组织，吹散在显微镜下观察细胞活性，决定灌流是否继续。
或者可先将灌流装置终止，用手慢慢轻压心脏，避免伤害心脏，将心腔中消化液挤出，观察心脏形变不恢复即可。
消化不要过。
有钙液和细胞悬液必须放于4℃贮存待用（尤其在夏季），否则会造成细菌污染，影响实验。
Tips：有钙液灌流—让心脏跳动，心腔中的血泵出；灌流时不至于淤血堵塞血管，影响灌流。
无钙液灌流—将心腔中的有钙液冲洗出，使心脏停止跳动；加入的无钙液不能过多，否则细胞不耐钙，分离出的细胞抖。
酶消化液灌流—消化连接心肌细胞的胶原等结缔组织，使心肌细胞分离。
灌流液应始终维持氧饱和，不使心肌细胞缺氧。
通常分离大鼠心肌细胞采用胶原酶，而分离豚鼠心肌细胞采用蛋白酶。
用无钙液冲洗时，使心脏组织疏松，灌流滴数加快，若滴数无明显变化为灌流不完全。
可用平镊夹持系线处水平旋转心脏，使灌流充分。
膜片钳使用流程１，打开总稳压电源２，打开不间断电源，数模转换器电源３，打开显微镜开关４，实验准备５，打开电脑，放大器，进行试验６，实验结束后，先关闭放大器７，关闭电脑—显微镜—清理试验台８，检查三维液压是否归零，检查显微镜，检查粗调是否归中，检查氮气是否关闭９，清理实验室，并闭室内电源，水闸打开电脑→将桌面上clampex软件打开→File→set Date File Index→向上→D盘→ftm→date →点新建文件图标→修改文件名，并将下面4个数字归零→保存关闭→clampex软件左上方图标（open protocol）→向上→D盘→ftm→protocol→#protocol#→zero pro→打开放大器→MAND至on→记录电流调I及V-clamp→有钙液灌流，洗细胞，压好液接电位，形成电流回路→按Ω0钮（seal test）→上电极时应注意，不要将银丝碰弯，碰断；找电极，电极入液，显示电极阻值（1-3MΩ）若入液后，电极阻值达到KΩ，则说明电极尖断了，应将电极出水换电极→先粗调，后微调将电极针压上细胞，电极阻值上升大约0.5 MΩ说明电极已压上细胞→full scale→调转PIPETTE OFFSET钮，调基线，使电流归零→负压吸引并维持负压，阻值约20 MΩ时，调节钳制电位Holding -20，-40，-60mv基线平稳缓慢调节→使阻值上升至约100-120MΩ时，将负压放掉使阻值继续上升，电流下降，在维持基线平稳的基础上，为保证阻值上升，给予适当的负压→直至基线归零“平”并且阻值上GΩ，给予负压吸引“破”膜，并记录电流（记录中需维持负压，防止破开的膜关闭）→Edit保存至新建文件夹→记录结束后需记录最大膜电容。
打开放大器→MAND至on→记录动作电位→调V及I-clamp NORMAL→记录。
PS：同一细胞可记录多次，但如果每次重新破膜，需重新记录膜电容。
确定细胞是否破膜：①MAND至OFF→调I RMS→电流值在3左右，即可确定破膜→重调至I，on→记录电流。
②观察电流夹角变得光滑，即可确定破膜。
确定破膜后，若基线未平，说明有漏电流，需补leak→调转leak钮，补充漏电流。
重新记录电流和最大膜电容。
PS：放大器开关：power开，调I及V-clamp，再打开控制电钮；关，先关控制电钮，track，V-track，再关power。
调节条件，在关闭控制电钮时才可进行。
放大器打开后至少1h方可关闭。
PS：开始试验前20min用有钙液贴槽子，恢复细胞耐钙，并使细胞贴壁，细胞不用过多；贴好槽子后，可用灌洗液（有钙液）灌洗细胞表面（速度要慢，避免贴壁细胞被吹起；灌洗装置为自制的注射器抽吸装置，每次替洗1/5浴液，清洗到视野清晰即可），使细胞表面光滑，有利于与微电极尖端形成高阻封接；使用显微镜前先将三维液压调到1左右，并在上下0.5的范围内使用；使用显微镜找电极，先粗调，用细胞找电极，然后用微调压住细胞，开始试验。
微电极的制备1，采用两步拉制法，拉制电极（垂直拉制）（１）设定两步拉制的温度step1:72℃；step2:51.9℃。
（２）将毛细玻璃管放在拉制仪上，打到step1的温度，拉出一个7-10mm的细杆（３）再从细杆的中间偏下部位，用step2温度，将杆拉断，拉出两根玻璃电极PS：拉制好第一步后，需等电极冷却后，拉制第二步，否则会使电极尖端变短变粗，电极阻值变大，影响实验。
2，充灌电极液微电极在使用前要充灌电极液，用注射器将电极液充入玻璃微电极中，在充灌过程中，应尽量避免电极内出现气泡，如出现了可将电极尖端向下，轻敲壁除去气泡。
PS：微电极应拉制的长短均匀，电极阻值相近，方便实验，一般拉制成功后，有1~3MΩ的电阻，常用于全细胞记录模式。
避免碰触微电极尖端，灰尘进入堵住电极，影响试验。
充灌电极液不应过多，大概1cm。
充灌时首先将电极尖端浸入电极内液，利用毛细管虹吸作用使尖端部分充满液体，然后再从电极尾端充灌。
在充灌中应避免电极内出现气泡，如有气泡可使电极尖端向下，轻敲管壁除去。
也应避免充灌电极内液太多，否则电极内液溢出会使支持器表面变湿、形成薄膜而产生热噪声，影响实验噪声基线。
用仪器记录数据在细胞进行封接以前，要用有钙液灌流复钙（约20min），使心肌恢复正常，才能记录心肌细胞中各种电位及动作电位。
PH剂较正操作步骤：1，准备：（1）电极，仪表的BNC插头，连接温度传感器到HTC（2）用变压器把仪表连接到电源（3）按PH（mv）键，设置PH模式2，较正：（1）按set up，显示“clear buffer”按Enter（2）按set up，直至显示缓冲液组“1.68,4.01,6.86,9.18,12.46”或所需的其他缓冲液组，按Enter（3）将电极清洗，擦干，浸入第一种4.01缓冲液中，等数值稳定，出现s时，按standarize，仪器自动校准，如时间较长，可按Enter手动校准，作为第一点校准，被储存显示“”。
（4）清洗电极，擦干，放入6.86缓冲液中，校准方法同上，但显示“”和**% “slape x good electrode”**显示测量的电极斜率，如在90-105%范围内可接受，如不，则证明与理论值有较大差异，应重新校正，显示“Err”。
（5）再清洗电极，擦干，放入9.18，再进行校正，一般为3点校正。
一些常用的液体成分：，IK，Ito）母液(台母)CaCl2 1.8 147.030.9mol/L每100ml无钙液中加0.2mlCaCl2（0.9mol/L：6.6g/50ml）用NaOH调PH值（7.40，一般7.35以上即可）NaOH配制：3.6gNaOH溶于30ml去离子水中２，配制KB营养液（细胞保存液）用KOH调节PH至7.35用5mol/L KOH调节PH（28gKOH溶于100ml去离子水中）PS:先直接加固体KOH调节至7.2左右，再加液体KOH。
