乳鼠心肌细胞分离步骤

原代小鼠心肌成纤维细胞提取方法1.提前配置0.8%胰酶 3mL、0.1%胶原酶II 10mL（均用DMEM配置），放入37℃水浴锅中预热15min；准备1个50mL的离心管，提前加入10mL含10%FBS的完全培养基，冰浴备用；2.取5-10只7天出生内的C57乳鼠，用灭菌或消毒的组织剪剪开胸腔，迅速取出心脏，置于含2%双抗的预冷的DMEM培养基中；3.将心脏组织转移至超净台，用DMEM反复清洗，取出血液、大血管组织，将组织放入1个1.5mL的EP管中，充分剪碎（小于1mm3）;4.用巴氏管向组织块中加入1mL预热的胰酶，反复吹打、吸入至含胰酶的离心管中，37℃水浴加热3min，适当振荡；[循环1]5.吸取上清液丢弃，余下的组织块中加入2mL胶原酶，37℃水浴加热5min，期间每分钟振荡1次，吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环2]6.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次）后水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环3]7.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀2min后（约30次），此时肉眼可见组织块逐渐变小，呈透明粘液状，随后再次水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环4、5]8.向组织块中再次加入1mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次），此时肉眼可见组织块逐渐消失，消化液变得浑浊，再次水浴消化3min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环6、7]；9.将50mL离心管中的液体分装入2个15mL离心管中，1000rpm离心6min，小心吸去上清液，组织/细胞沉淀加入1mL完全培养基吹打混匀后转移至50mL的培养瓶中，加3mL完全培养基（含4%双抗），2h后可见细胞贴壁，12h内换液；2-3d后常规传代（1:2），P1-2用于实验。

大鼠原代心肌细胞提取方法原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。

乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点：1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。

新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。

因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。

建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。

2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。

常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。

3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。

新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。

消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。

4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。

分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。

成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。

溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。

由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。

5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。

操作过程：手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5）放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。

分离小鼠原代心肌细胞与大鼠原代细胞分离有所不同方法：1、所有器械（四把镊子两把剪刀）放在75%酒精中浸泡6 h以上。

2、用PBS溶液（过滤灭菌）配制0.075%胰酶20mL备用（胰酶原液0.25%，6ml原液可以稀释至20ml）。

3、新生（1天）乳小鼠15-20只，器械在酒精灯上灼烧消毒备用。

4、准备两个冰盒，在其中一个冰盒中放两个平皿，皿内盛放PBS溶液（无色），把灼烧后的一把镊子倒插在该冰盒中（用于涮洗心脏）。

另一个冰盒中同样放两个平皿，其一放PBS溶液，其二放1 mL0.075%胰酶，同样把灼烧后的一把镊子和一把剪刀（用于剪碎心脏）倒插在该冰盒中，所剩的两把镊子和一把剪刀灼烧后倒置用于解剖，切勿污染。

5、乳鼠两只一组处死消毒取样，方法：将其轮流放入装有75%酒精的烧杯中6 s即可。

6、从胸骨下端开始向上解剖乳鼠，剪至颈部，打开胸腔，挤出心脏，用镊子取心脏心室部分放入第一个成有PBS溶液的平皿中，速度越快越好，以保持心肌细胞的活性。

7、待取完所有心脏后，在冰盒中使用冰盒中的镊子涮洗和挤压心脏以尽量除去心脏中的血液，置于冰盒中的另一个平皿中，继续洗去血液，若有心脏上存有心房则用镊子拔去，可使用第二个冰盒中的镊子，依次放入第三个皿（第二个冰盒）中洗净。

8、将洗净的心脏放入第四个放有1 mL 0.075%胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶中，用剪刀剪碎心脏后，吸入所剩的149mL胰酶中4 ℃消化24h。

9、消化24h后，吸出11mL胰酶，加入9 mL0.1%的胶原酶Ⅱ（此时浓度为0.05%，配胶原酶需用0.2 μm滤器过滤），将18 mL的细胞液装入高压过的小烧杯中，加入磁力棒，在磁力搅拌器上搅拌30 min，温度维持在34-35 ℃左右，120 rpm。

10、配制两种培养液，DMEM-F12 10%FBS，DMEM-F12 15%FBS Brdu（10 mg/mL的Brdu母液，在DMEM-F12 15%FBS中每20mL加67μL，心肌细胞对Brdu的耐受性较其他细胞高，以保护心肌细胞减少其他细胞主要是成纤维细胞的污染）。

大（小）鼠心肌细胞的急性分离准备工作:1 器械：恒温水浴锅（泵）Langendorff装置氧气手术器械平皿烧杯50ml注射器玻璃离心管吸管冰袋步骤: 1用去离子水清洗器械和Langendorff装置、打开恒温水浴、提前拿出-20℃的KB液放到水浴中使之融化。

2 配置无钙液：50ml的10X台式母液+450mlddH2O+1g葡萄糖，用NaOH调节PH至7.35～7.45。

将无钙液通氧5min。

3 配置有钙液：200ml无钙液+0.4ml 0.9MCaCl2。

4 配酶：10mgⅡ型胶原酶+10mgBSA溶解到80ml无钙液中。

5 将70ml有钙液从Langendorff装置下端注入弯管中，注意千万不要有气泡，然后将氧气针头插入Langendorff管中，打开氧气。

6 取心脏，修理主动脉边缘至平整，助手将Langendorff装置打开，速度不能太快，1滴1滴即可。

7 用平镊和弯镊夹住主动脉，迅速挂在Langendorff装置上，用线系紧，注意：针管不能深也不能浅，心脏挂上后能横过来就可以，系线时不要系到组织。

8 打开装置阀门，让液体以固定的流速流入心脏，注意装置上方要保持有液体，否则大量气泡进入会导致分离失败。

9 有钙液泵完时，加入无钙液至心脏停跳，此时加入酶。

10 用烧杯接下45ml左右的液体弃掉，此时开始计时，其余液体循环利用，消化开始。

11 消化的过程是快—慢—快，当流下的液体变得粘稠，心脏松软粉嫩时即可，大约30min。

12 将通过氧的KB液装入准备好的离心管中，剪下左心室组织，剪碎，吹打，将细胞吹下后弃去组织。

剩下的细胞悬液放到4℃冰箱中，静置1—2小时待用。

实验所需药物及液体的配置：1 台式母液(10x、g/500ml)NaCl：39.74 KCl：2.01 HEPES：11.915 MgCl2.6H2O：1.0165 2 KB营养液（—20℃保存、g/500ml）用KOH调节PH7.35-7.45GLutamic acid：5.15 T ourine：0.9375 KCl：1.1185 HEPES：1.1915 MgCl2.6H2O：0.05075 EGTA：0.095 Glucose：0.991KH2PO4：0.683CaCl2母液：0.9mol/L或1.8mol/L4无钙液：50ml台式母液+450mlddH2O+1g葡萄糖5有钙液：200ml无钙液+0.4ml的0.9mol/L CaCl2母液或0.2ml的1.8mol/L CaCl2母液6酶：10mgⅡ型胶原酶+10mgBSA溶解到80ml无钙液中7F-127：2mg+1ml有钙液（4℃保存）8Flou-3：一管新的+50ulDMSO(-20℃保存)9染色液：894μl有钙液+100μl F-127+6μl Flou-310KCl：0.09g溶于1mlddH2O中（这样保证浴槽中的浓度为30mmol/L）11BSA：40mg溶于1mlddH2O中（用来保护心肌细胞）。

下文所述程序改编于Speicher和McCarl（1974）的方法。

实验需要两把弯头的解剖剪，两把5号钳子，一个25-ml的带橡皮塞的锥形瓶，内装一搅拌棒。

所有器械使用前均应消毒灭菌。

为了进一步保证无菌条件，最好用一次性无菌塑料用品。

所有的孵育操作均应在高湿度的5% CO237℃孵箱中。

本实验适合处理20~30只幼鼠，若少于20只鼠则可能会发生组织消化过度的情况，若超过30只，则由于准备工作加长降低了细胞的成活性。

组织消化和分离细胞1）在细胞操作间内，放一个加热搅拌台，上放一个装有100-ml灭菌水的容量600-ml的烧杯，加热至37℃。

2）准备胰酶液。

用水浴或温箱使胰酶液温度保持在37℃。

胰酶（0.1）%，100ml盐水A 90ml1%胰酶1:300（GIBCO/BRL）10ml使用当天配制盐水A137mmol/L NaCl4 mmol/L KCl4.2 mmol/L NaHCO35 mmol/L 葡萄糖溶于无菌蒸馏水中3）做一个冰台：将一只平皿装满冰后倒置即可，70%乙醇擦拭平皿后放进操作台。

取3个60-mm的一次性组织培养用平皿，加入5 ml盐水A，标记上1，2，3，放进操作台的冰台上。

4）取一只干净加盖的烧杯，内放一块Metofane饱和的纱布，把0~1日龄的SD幼鼠放进该烧杯中麻醉。

20只幼鼠大约需要5分钟时间。

用70%乙醇擦净烧杯再放进操作间。

5）一次取出一只幼鼠，一定要再盖好盖子，然后将幼鼠躺着放在一块无菌纱布上。

用乙醇擦洗其胸部及腹部。

把鼠肩胛骨往后夹，使突出胸腔，在肋骨下沿胸骨方向拉一口，摘出心脏放进标记着1的培养皿中。

24-mm规格的弯头解剖刀适合用于切口及摘除心脏。

此时幼鼠心脏仍能跳动，故一般很容易找到并摘除。

可用同一把解剖刀将心脏摘出放进盐水A溶液，若需要也可用灭菌的5号钳子。

6）继续处理余下的幼鼠，一定要保持手套及所用器械洁净。

每次解剖约需1分钟。

7）上述操作完成后，用两把5号钳子剔除心脏上结缔组织和血块再转入标记为2的平皿中。

原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定＊程阔菊，黄河，杜智勇，李洪，杨天德△【摘要】目的建立原代乳小鼠心肌细胞的培养方法，评价心肌细胞的存活状况并鉴定心肌细胞纯度。

方法应用胰酶联合胶原酶共同消化3d内C57乳小鼠心脏，台盼蓝染色判断心肌细胞存活率，α－actin免疫荧光染色鉴定心肌细胞纯度。

结果利用3d内乳鼠心脏可成功培养原代小鼠心肌细胞，台盼蓝染色显示细胞存活率大于95%，α－actin免疫荧光染色显示心肌细胞纯度达95%以上。

结论严格控制实验条件，可成功培养高存活率和高纯度的小鼠心肌细胞。

【期刊名称】重庆医学【年(卷),期】2013(000)022【总页数】3【关键词】乳小鼠；心肌细胞；分离；纯化；培养；鉴定各种基因敲除及转基因小鼠已广泛应用于心血管疾病动物模型的建立，已为心血管疾病机制的研究作出了巨大贡献。

体外心肌细胞培养作为一种体外实验研究模型，可以排除神经、体液的干扰而独立地从细胞和分子水平研究心血管疾病的发生、发展机制，但由于小鼠心肌细胞的分离和培养比较困难，所以一直限制了医学科研工作者在细胞生物学水平上对心血管疾病方面的深入研究。

本实验室在以往的经验基础上，摸索出了一套成熟可行、简单可靠的小鼠心肌细胞培养方法，获得的心肌细胞存活率高且纯度高。

本文对此培养方法做一简单介绍，并对其中的关键影响因素做详细的探讨。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物1～3d龄野生型C57新生乳鼠，SPF级，由第三军医大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（渝）2007－0003。

1.1.2 主要仪器与试剂显微眼用镊、眼科剪、显微镊、显微剪（上海医疗器械有限公司），器械使用前清洗干净并经高压灭菌（121℃，20min）。

二氧化碳培养箱、倒置显微镜（OLYMPUS）、超净工作台（苏净安泰）、低温台式离心机（Sigma）。

小牛血清、DMEM／F12、胰酶、胶原酶Ⅱ（GIBCO），BrdU－溴脱氧尿苷（Sigma），青霉素、链霉素（华美生物工程公司），anti－α－actinin（Millipore），组织固定液（Alphelys），Triton X－100（Amresco），SlowFade Gold antifade reagent with DAPI（Invitrogen），Alexa goat anti－mouse IgG（H＋L）（Invitrogen）。

乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养一、实验动物1~3日龄C57小鼠乳鼠10只。

二、试剂及配制高糖DMEM( gibco)、Ⅰ型胶原酶（MP）、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清（gibco 160000-044）、青霉素-链霉素混合液（solarbo）。

培养液: DMEM培养基：FBS：双抗 100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)稀释, 配成0.1%胰蛋白酶消化液;将Ⅰ型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)中, 配成0.1%的胶原酶消化液。

0.1%胰蛋白酶及01% Ⅰ型胶原酶以2∶1混合, 现配现用。

三、实验仪器超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机……四、组织消化和分离细胞1、将乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。

用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用聚维酮碘消毒胸、腹部皮肤。

2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。

用眼科虹膜剪在剑突处正中线稍偏左向上开胸后用剪子压住胸骨右缘, 使心脏自然跳出, 用弯镊子勾住心脏根部, 取出心脏, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。

3、将鼠心脏全部取出后, 剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管, 预冷ＰＢＳ液清洗3次, 去除血污。

4、将心脏剪成约1mm ×1mm×1mm的组织块, 刮入加有搅拌子的锥形瓶中, 酶消化液冲洗剪刀及培养皿, 转移至锥形瓶中。

5、加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍, 37 ℃水浴, 打开磁力搅拌器, 60r/min搅拌10min, 吸管轻轻吹打组织块1min分散细胞, 自然沉降2min后遗弃上清液。

6、再次加入消化酶液8～15ml消化8min。

五、培养细胞1、吸取上清液入离心管, 加入预冷培养液2ml, 吹打均匀后, 1 200r/min离心4min, 弃上清, 细胞沉淀加预冷的培养液吹打后成细胞悬液用封口膜封口放于冰中备用。

乳鼠心肌细胞培养物品准备眼科剪、眼科镊、泡沫板、75%酒精、细胞培养皿、细胞培养瓶、胰蛋白酶、胶原酶II、5-溴脱氧尿苷（Brdu）、离心机、温控水平摇床、二氧化碳培养箱、普通倒置显微镜、细胞计数板、胎牛血清、DMEM培养基、生理盐水、细胞过滤器、除菌过滤器、15ml离心管、50ml离心管试液配制（1）培养液A:按每90ml培养液加入10ml胎牛血清即为10%DMEM培养液（含双抗）。

（2）培养液B:含0.1mmol/LBrdU配制的DMEM高糖型培养液（含双抗）。

（3）消化液：0.1%胰酶和0.1%胶原酶Ⅱ型分装冻存于-20C。

将0.1%胰酶与0.1%胶原酶Ⅱ型混匀，现用现配。

操作步骤（1）取1-3天龄的新生乳鼠，断头处死，固定于泡沫板上;（2）应用75%酒精常规消毒;（3）从左侧肋下缘剪开胸腔,用镊子取出心脏，置入含无血清DMEM培养液的平皿中;（4）全部心脏取出后，剪去心房及周围血管组织，移入一干平皿中;（5）剪碎，用无血清培养液洗1-2遍后，转移入50ml离心管中;（6）加入10ml 消化液，放入37℃摇床 100rpm，15min，弃掉上清，收集沉淀。

（7）沉淀的心室组织中加入10ml消化液，37℃摇床 100rpm，10min，充分吹打后静止，待未消化完全细胞沉淀后小心收集上清（避免吸入组织块）置于 20ml 培养液中。

（8）重复 5-6次消化步骤，至完全消化为止，收集上清。

用200μm 筛网过滤，1000rpm，4℃，离心 8min。

（9）用培养液A将收集到的细胞悬液再次重悬，接种于T25 培养瓶，放入 5%CO2 恒温（37℃）细胞培养箱培养1.5h（即差速贴壁分离法）。

（10）将T25培养瓶中的上清液转移至另一无菌T25培养瓶，放入细胞培养箱培养 1h，进行第二次差速贴壁。

（11）收集上清并计数后，离心 1000rpm，4℃，8min，弃上清，留取细胞沉淀。

（12）用培养基B重悬细胞沉淀，按照1.5×105/10cm2的细胞密度接种于六孔板中，放入细胞培养箱培养。