下载文档原格式
小鼠心肌细胞的体外培养刘雨潇;华进联;张慧茹;窦忠英【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2005(033)001【摘要】对采用组织块法和酶消化法体外培养小鼠心肌细胞的结果进行了比较,并对体外培养心肌细胞的生理活性进行了初步测定.结果表明,用组织块法分离培养胎、乳鼠心肌可得到自主节律性搏动的心肌细胞;分别用1 g/L胶原酶+10 g/L BSA,0.5 g/L胰酶+1 g/L胶原酶,1 g/L胰酶分离培养胎、乳鼠心肌,均可得到大量心肌细胞,且细胞活力较好,能自主博动20 d以上;用上述2种方法分离培养成年鼠心肌,结果均不理想;在载有自主节律性搏动的小鼠心肌功能性细胞团的培养皿中加入Ca2+和肾上腺素后,细胞团搏动速度加快,搏动力加强;加入K+后则细胞团搏动速度减缓,搏动力减弱,其对钾、钙、肾上腺素的反应与在体内基本一致,表明体外培养的小鼠心肌细胞具有与在体心肌细胞相似的功能.【总页数】4页(P5-8)【作者】刘雨潇;华进联;张慧茹;窦忠英【作者单位】西北农林科技大学,陕西省干细胞研究中心,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,陕西省干细胞研究中心,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,陕西省干细胞研究中心,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,陕西省干细胞研究中心,陕西,杨凌,712100【正文语种】中文【中图分类】S865.1+3;Q954.6-33+2【相关文献】1.苦参碱对体外培养小鼠心肌细胞感染柯萨奇B3病毒的影响 [J], 玄延花;曹春花2.诱导体外培养小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞方法的研究 [J], 曾秋棠;曹林生;祝武强3.促小鼠红细胞生成素对体外培养小鼠成骨细胞成骨作用的实验研究 [J], 廖菲;徐涛涛;肖鲁伟;童培建;吴承亮4.小鼠心肌细胞共培养条件下成纤维细胞向心肌细胞转分化效率的实验研究 [J], 康志骞;刘畅;张洁;彭鲁英5.性成熟小鼠卵巢和性未成熟小鼠体外培养卵泡的雌激素受体α、β亚型表达的研究 [J], 丘彦;贺雪辉;王炼炼因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种重要的研究对象，分离、鉴定和培养大鼠心肌细胞是进行相关研究的基础工作。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养方法。
1. 大鼠心肌细胞的分离方法：a. 准备消化液：将含有0.1%胰酶和0.05%胰蛋白酶的耗氧培养液(如DMEM/F12)预先加热至37℃。
b. 杀死大鼠：快速杀死大鼠，并立即进行心肌细胞的分离。
c. 开胸取心：通过剖开胸腔，将心脏暴露，并迅速取出。
d. 剪开心脏：用剪刀切开心脏的心室部分，将其放入预先加热的消化液中。
e. 贴壁处理：将心室组织液搅拌均匀，并放置在37℃培养箱中酶解。
每隔10分钟，用吸球轻轻吸取上清液，反复操作3-4次。
2. 大鼠心肌细胞的鉴定方法：a. 形态学观察：用显微镜观察分离得到的心肌细胞的形态，心肌细胞呈长条状，具有明显的纵纹和横纹。
b. 钙离子荧光染色：使用荧光染料如Fluo-4 AM来标记细胞内的钙离子，并观察细胞内钙离子的动态变化。
c. 免疫荧光染色：使用心肌细胞特异性标记物如肌球蛋白进行免疫荧光染色，观察标记物的染色情况。
3. 大鼠心肌细胞的培养方法：a. 培养基准备：将DMEM/F12培养液加入10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素溶液和1%胎牛血清补充物。
b. 细胞接种：将分离得到的心肌细胞加入培养基中，浓度为1 * 10^5 cells/ml，并将细胞悬浮液加入培养皿中。
c. 培养条件：将培养皿放入恒温培养箱中，温度设定为37℃，CO2浓度设定为5%。
d. 培养液更换：一般情况下，每2-3天更换一次培养基，同时可添加适量的生长因子和激素。
e. 心肌细胞传代：当心肌细胞达到80-90%的密度时，可以进行细胞传代。
传代方法与培养方法相似，注意细胞的保持适当的密度。
大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养是大鼠心肌细胞研究的关键步骤。
通过合适的操作和条件，可以获得纯度较高的心肌细胞，并进行相关研究。
需要注意的是，心肌细胞的分离和培养过程需要在无菌条件下进行，以避免细菌和其他微生物的污染。
仔猪心肌原代细胞培养及其对口蹄疫病毒敏感性研究王光祥;尚佑军;陈江涛;吉艳红;刘湘涛【摘要】目的旨在建立仔猪原代心肌细胞的培养方法 ,探索O型口蹄疫病毒对易感动物心肌原代细胞的敏感性,为研究O型口蹄疫感染引发幼畜心肌炎致病机理提供细胞模型.方法利用混合消化酶(2g/L 胰蛋白酶(trypsin) 和1g/L Ⅱ型胶原酶(collagenase)1∶1混合)消化法培养原代心肌细胞;相差显微镜观察心肌细胞生长和波动情况;胎盘蓝对细胞染色,鉴定细胞成活率.将生长良好的原代心肌细胞接种口蹄疫O型乳鼠毒观察其敏感性,同时将该毒接种BHK21细胞做平行对比.结果仔猪原代细胞成活率为95.6%;成活细胞形态完整,部分细胞自行蠕动,当生长成片后可见呈岛屿状搏动.仔猪原代心肌细胞对O型口蹄疫病毒敏感.与BHK21细胞相比,结果无明显差异.结论本试验成功培养了仔猪心肌原代细胞,并且培养的原代细胞对O 型口蹄疫病毒敏感.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2010(026)010【总页数】4页(P912-915)【关键词】猪心肌原代细胞;培养;O 型口蹄疫;敏感性【作者】王光祥;尚佑军;陈江涛;吉艳红;刘湘涛【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,国家口蹄疫参考实验室,兰州,730046;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,国家口蹄疫参考实验室,兰州,730046;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,国家口蹄疫参考实验室,兰州,730046;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,国家口蹄疫参考实验室,兰州,730046;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,国家口蹄疫参考实验室,兰州,730046【正文语种】中文【中图分类】R373FMD是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性高度传染性疫病,被国际兽疫局列为A类动物传染病之首。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏组织的重要细胞之一，对于心脏疾病的研究和治疗具有重要意义。
在进行心脏细胞的研究和培养过程中，对大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是非常关键的步骤。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一关键技术。
一、大鼠心肌细胞的分离大鼠心肌细胞的分离是进行心肌细胞培养的第一步，其关键在于有效地分离心肌细胞，保证细胞的纯度和活力。
以下是常用的大鼠心肌细胞分离的方法：1. 心脏采集：首先需要从大鼠体内取出心脏组织，最好选择小鼠、大鼠等小型动物，以便于获取足够数量和较为纯净的心肌细胞。
2. 心室组织的分离：将心脏组织置于含有氧气的离心纯化液中，迅速剪下心脏，并去除心包膜、心尖等结缔组织，然后将心室组织切成小段。
3. 细胞的分离和纯化：将切成小段的心室组织放入含有0.1%胰蛋白酶和0.1%重组胰岛素的胰酶溶液中进行消化，去除结缔组织和细胞外基质，然后用离心分离出心肌细胞。
4. 心肌细胞的过筛和纯化：经过离心后，得到的上清液中含有大量的心肌细胞和其他细胞。
通过过筛的方法，可以进一步提取纯净的心肌细胞，并将其进行鉴定和培养。
1. 形态鉴定：观察分离得到的心肌细胞在显微镜下的形态特征，包括细胞形状、大小、结构等。
正常的心肌细胞应该呈长条形、有交叉条纹，并具有丰富的胞浆。
2. 免疫细胞化学鉴定：通过染色技术，使用与心肌细胞特异蛋白相关的抗体标记心肌细胞，如肌动蛋白、肌钙蛋白等，观察其在心肌细胞中的表达情况，以确定其纯度和特异性。
3. 功能鉴定：通过检测心肌细胞的功能特性，如心肌收缩力、电生理特性等，来判断心肌细胞的活性和健康程度。
可以通过贴壁法、钙离子荧光示踪等技术手段来进行功能鉴定。
通过以上的鉴定方法，可以全面地评估分离得到的心肌细胞的纯度和活性，为后续的心肌细胞培养和实验奠定基础。
在分离和鉴定得到的心肌细胞可以进行培养，为心脏疾病的研究和治疗提供重要的实验材料。
汇报人：日期:目录•疾病概述•诊断与鉴别诊断•治疗与用药•预防与控制•案例分析•讨论与展望疾病概述病因该病主要由病毒感染引起，常见的病毒包括猪流行性感冒病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒等。
定义仔猪心肌炎是一种由病毒感染引起的心脏疾病，主要发生在仔猪中。
定义和病因01传播途径病毒主要通过呼吸道传播，也可通过胎盘垂直传播给胎儿。
02季节性该病的发生无明显季节性，但易受天气变化、管理条件、疫苗接种等因素的影响。
03易感动物仔猪高度易感，成年猪多为隐性感染。
流行病学特点临床症状急性01仔猪突然死亡，无明显症状。
亚急性02仔猪出现食欲不振、精神萎靡、呼吸困难等症状，伴有心肌炎、心包炎和心肌变性等病理变化。
慢性03仔猪生长缓慢，消瘦，呼吸困难，伴有心律不齐和心肌变性等病理变化。
诊断与鉴别诊断仔猪心肌炎的临床症状包括发热、呼吸困难、食欲不振、精神萎靡等，严重时可能导致死亡。
观察临床症状身体检查观察病程通过听诊和触诊检查仔猪的心脏和呼吸情况，以确定是否存在异常。
仔猪心肌炎的病程通常比较短，因此需要及时诊断和治疗。
03临床诊断0201采集仔猪的血液、尿液、组织等样品进行实验室检测。
采集样品通过PCR、ELISA等方法检测病毒核酸或抗体，以确定是否存在病毒感染。
检测病毒检测其他细菌、寄生虫等病原体，以排除其他疾病的可能性。
检测其他病原体实验室诊断与其他病原鉴别对于病毒感染，与其他病原进行鉴别，如伪狂犬病等。
与其他疾病鉴别与其他具有类似症状的疾病进行鉴别，如猪流感、猪瘟等。
根据病程和症状鉴别根据病程和症状的轻重缓急进行鉴别，以确定治疗方案。
鉴别诊断治疗与用药在疾病的早期阶段，可以使用抗生素来控制感染和预防并发症。
常用的抗生素包括氨苄西林、头孢菌素等。
西医治疗早期使用抗生素针对仔猪的症状，如呼吸困难、心脏衰竭等，可以采取相应的对症治疗措施，如使用利尿剂、强心剂等。
对症治疗在疾病的治疗过程中，应尽量减少各种应激因素，如运输、环境变化等，以降低对仔猪的进一步刺激。
梅山猪胎儿成纤维细胞的分离培养及SRY-PCR法快速性别鉴定曹海峰;随刘才;季索菲;李运生;陶勇;张运海;章孝荣【期刊名称】《安徽农业大学学报》【年(卷),期】2011(38)6【摘要】对梅山猪胎儿成纤维细胞的分离培养及性别快速鉴定进行研究,为开展猪体细胞克隆、诱导多能干细胞获取及转基因等提供素材。
通过取组织块培养法和胰蛋白酶消化培养法均成功得到梅山猪的胎儿(胎龄35 d)成纤维细胞,取其中7个梅山猪(msz4、msz5、msz6、msz9、msz11、msz14和msz15)胎儿的原代成纤维细胞,在传代培养至第5代时收集贴壁生长的细胞,提取基因组DNA。
再利用根据SRY及ZFY/X设计的共2对引物进行PCR反应,扩增后进行琼脂糖凝胶电泳,出现166 bp和445/447 bp两条带的为雄性,只有445/447 bp一条带的为雌性。
结果表明梅山猪的细胞系msz6、msz9和msz14为雌性细胞系,而msz4、msz5、msz11及msz15为雄性细胞系。
试验结果证明了该方法可应用于鉴定不同培养方法获得猪成纤维细胞的性别,可为试验后期的转基因细胞制备提供性别依据。
【总页数】4页(P907-910)【作者】曹海峰;随刘才;季索菲;李运生;陶勇;张运海;章孝荣【作者单位】安徽农业大学动物科技学院动物胚胎工程实验室【正文语种】中文【中图分类】S828.81【相关文献】1.版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞的分离培养及性别鉴定2.西藏小型猪胚胎成纤维细胞的分离培养及性别鉴定3.介Sry-PCR法快速鉴定体外培养兔胎儿成纤维细胞系的性别4.奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及SRY基因性别鉴定5.牛胎儿成纤维细胞的培养及性别鉴定因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是研究心脏疾病和心肌细胞功能的重要模型细胞。
分离、鉴定和培养大鼠心肌细胞是心血管研究的基础工作之一，本文将介绍关于大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 材料准备（1）取得3-5天大的小鼠；（2）取得适合的心肌分离培养试剂盒，如Worthington试剂盒；（3）取得离心机和培养箱等实验设备。
2. 心肌细胞的分离（1）将小鼠处死，取出心脏放置在含有生理盐水的培养皿中；（2）迅速将心脏移至足够的胶原酶/胶原酶B混合液中，加入2-3ml的混合液，用剪刀将心脏切成小块；（3）将含有心肌切块的培养皿放入37度水浴箱中37±1度水浴中消化，酶解30-50min，要不断观察；（4）将消化液收集至15ml离心管内，并逐渐加入适量的生理盐水；（5）将含有细胞的离心管放入离心机，1500rpm离心去沉淀心肌细胞；（6）吸去上清液，加入足够的DMEM/F-12培养基，轻轻振动混匀；二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 细胞形态鉴定（1）将培养皿内心肌细胞移至显微镜下观察细胞形态；（2）通过显微镜观察细胞的形态、大小、颜色等；（3）正常大鼠心肌细胞呈长条形，且贴附于培养皿底部。
2. 免疫荧光染色鉴定（1）将培养皿内的细胞进行PBS溶液洗涤；（2）加入4% paraformaldehyde固定细胞，洗涤；（3）加入常用的抗心肌肌动蛋白抗体，孵育；（4）洗涤后加入FITC标记的二抗或荧光素进行荧光染色；（5）用荧光显微镜观察细胞的荧光情况，确定心肌细胞的特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 培养基的配制（1）将DMEM/F-12培养基加入10%的胎牛血清、1%的青霉素和链霉素，混匀；（2）将培养基过滤灭菌后，置于4度冰箱储存备用。
2. 心肌细胞的培养（1）将心肌细胞悬液加入到预先涂覆明胶的培养皿中；（2）将培养皿放入CO2培养箱中37度培养，第二天更换新的培养基；（3）每2-3天更换一次培养基，直至细胞形成充分的单层。
仔猪心肌细胞分离及培养方法研究吴旭颖,郭亮(天津农学院动物科学系,天津 300384)摘要:为探讨仔猪心肌细胞的分离及培养方法,采用胶原酶 型和胰酶同时消化心肌组织,用10%胎牛血清终止消化,并用100目细胞筛过滤后,1200r/min离心沉淀细胞,再加入培养液重悬细胞。
采用差速贴壁法纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育。
结果显示,未贴壁时心肌细胞呈圆形,培养12~24h心肌细胞开始贴壁生长,细胞伸出伪足呈梭形、多角形,3~4d后形成细胞簇,5~7d后细胞汇合成片。
因此,同时使用胶原酶 型和胰酶消化仔猪心肌可简便、快速地获得高活力的心肌细胞。
关键词:心肌细胞;细胞培养;仔猪中图分类号:S816.79 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2010)03-0052-03心肌细胞分离培养是一种研究心脏和心肌细胞的有效方法,也是简化分析心肌细胞功能的有效方法之一。
心肌细胞培养还有助于研究心脏疾病的病理机制,在哺乳动物上,人们利用小鼠的心肌细胞为模型研究人类相关的心血管疾病(Zhang等,2006;牛建立等,1997),关于小鼠心肌细胞原代培养的方法已较为成熟。
然而在猪上的相关研究,尤其是出生后仔猪心肌细胞培养的相关报道还较少。
随着对猪心脏显微解剖、细胞与分子生物学特性的不断深入研究,猪逐渐被认为是潜在的器官提供者。
Rose 等(2000)研究结果证明,向猪心内皮细胞转入DAP、MCP及CD59补体调节蛋白基因能克服人体对异种器官与组织的超急性排斥反应。
因而,猪心逐渐成为矫治人类各种心脏疾病的适宜材料来源,因此需要尽快探索出一种细胞分离培养方法来获得仔猪心肌细胞,以便对猪心脏进行更深入的研究。
1 材料与方法1.1 试验动物 试验动物均选取刚出生7日龄的健康原种仔猪,大约克夏 长白猪原种子一代,品种为二元长白种猪,出生时平均体重为1.32kg,购自天津国家级宁河原种猪场。
1.2 主要试剂和仪器 无钙镁PBS购自美国Cam brex公司;0.25%胰蛋白酶、0.1%胶原酶 购自美国M ediatech公司;IM DM培养基、胎牛血清(FBS)购自美国H y clo ne公司;青霉素、链霉素购自收稿日期:2009-08-28作者简介:吴旭颖(1983-),女,天津人,硕士生,研究方向:动物疾病病原学与免疫学。
通信作者:郭亮(1964-),女,山东人,教授,主要从事生物细胞研究。
E-mail:liangguo177@ 哈药集团制药总厂; -巯基乙醇、台盼蓝购自美国Sigm a公司;0.9%生理盐水购自华北制药股份有限公司;培养液组成:IM DM、10%胎牛血清、0.1 m mol/L -巯基乙醇、100U/mL青霉素G及100 g/mL链霉素。
M CO-17AIC CO2培养箱(日本三洋株式会社);倒置相差显微镜日本(OLYMPUS);电子分析天平、恒温磁力搅拌器、电热恒温水箱(北京长安科学仪器厂);电热鼓风干燥箱(天津市中环是验电炉有限公司);普通光学显微镜、数码照相机、手提式压力蒸汽消毒器、超净净工作台、高速台式离心机、超低温冰箱、滤器、培养皿、微量加样枪、100目细胞筛、血球计数板等。
1.3 试验方法1.3.1 采集心脏 取出生7d的仔猪,从养殖场运回实验室,放血致死,用含双抗生理盐水冲洗仔猪3次,每次5min。
固定仔猪,然后用75%的酒精消毒胸腹部皮肤。
用灭菌的手术刀将仔猪胸部皮肤切开,立即用酒精棉球擦拭胸腹部肌肉消毒。
用灭菌剪刀沿最后一根肋骨向前剪开胸腔,暴露心脏,用无菌剪刀剪开心包膜,取下心脏,立即放入盛有50mL 预冷的无钙镁PBS的烧杯中,洗去血细胞和血凝块。
放入4 冰箱保存,12h内处理。
1.3.2 分离心肌细胞 从冰箱取出样品,用镊子将心脏转移到无菌的平皿中,加入适量预冷的无钙镁PBS冲洗,剔除血管、脂肪和结缔组织,再用无钙镁PBS漂洗2~3次。
用眼科剪刀将转移到平皿内的心脏剪成1~2m m3的碎块,将剪碎的心肌组织转移到20m L离心管中,加入无钙镁PBS溶液充分漂洗组织碎块2~3次以洗去血细胞,自然沉淀后弃掉洗涤液留下组织块以备消化。
向离心管内加入52生理生化中国畜牧兽医 2010年第37卷第3期0.1%胶原酶 ,置磁力搅拌器上37 水浴60~80 r/min,消化20min。
消化完毕后用滴管轻轻吹打离心管中组织碎块数次,再加入0.25%胰蛋白酶到离心管中,继续消化约15min。
在显微镜下观察可见细胞变圆、浮起,则立即加入胎牛血清终止消化,消化产物用100目铜网过滤后,以1200r/m in,离心10min,弃去上清液后,用培养液洗涤细胞1次,并重悬细胞,调整细胞接种密度为2 105个/mL,接种于25cm2细胞培养瓶中,37 、5%CO2培养箱中连续2次差速贴壁60m in,分离纯化心肌细胞,并用台盼蓝进行活性鉴定。
24h后换液,换液时充分冲洗细胞以洗去血细胞和未贴壁的细胞,以后每2~3d换液1次。
1.3.3 心肌细胞的形态学观察 用倒置相差显微镜观察培养细胞的形态。
1.3.4 心肌细胞活性检测 台盼蓝染色法检测细胞活性:接种前取部分心肌细胞悬液稀释后,吸取0.5mL细胞悬液,加入0.5m L0.4%台盼蓝溶液混匀,染色3m in后,吸取一滴于血球计数板上,置显微镜下观察心肌细胞成活情况。
死细胞能被台盼蓝染上色,镜下可见深蓝色的细胞;活细胞不被染色,镜下呈无色透明状。
2 结果2.1 心肌细胞形态学的观察 心肌细胞在开始分离时,由于受到生物酶及机械作用的破坏,使刚分离的心肌细胞存在不同程度的皱缩,未贴壁前细胞为圆形,悬浮于培养液中(图1);12~24h后开始贴壁生长,贴壁后逐渐呈扁平形、梭形。
也有的细胞在贴壁后形成三角形,顶部突出,之后细胞展开,伸出伪足,形成不规则星形;随着细胞的生长,3~4d后形成细胞簇(图2),一般5~7d可汇合成单层。
图1 刚开始分离的心肌细胞(100 )2.2 心肌细胞的活性 经台盼蓝染色法检测发现,约有83%的心肌细胞呈杆状,92%的心肌细胞台盼蓝染色呈阴性。
因此,本试验方法获得了高活性的心肌细胞。
图2 培养4d的心肌细胞(100 )3 讨论在心肌细胞培养中,经常遇到杂细胞干扰的问题。
由于动物心脏组织由18种细胞组成(许秀芳, 2000),其中近75%是非心肌细胞,如成纤维细胞、血细胞、血管内皮细胞等,而心肌细胞不易贴壁且只占整个心脏组织细胞的25%(M in等,2002)。
新鲜消化离心后的细胞悬液中有大量成纤维细胞存在,分泌较多胶原,贴壁增殖快,因此在数量上抑制了心肌细胞的分化(Simpso n等,1982),但利用此特点进行差速贴壁,能降低其对心肌细胞的影响(To shiyu-ki等,2000)。
故本试验采用差速贴壁60m in去除其干扰,培养24h后存活的心肌细胞即可贴壁生长,而破坏严重的心肌细胞难于贴壁而悬浮于培养液中并逐渐肿胀、破裂而死,此时换液后可进一步获得高存活率的心肌细胞(王亭忠,2005)。
3.1 关于细胞分离 分离心肌细胞常用的酶有胰蛋白酶、胶原酶(Ko no等,1968)。
胰酶主要用于分解组织间质的蛋白成分,作用很强,容易造成心肌组织消化过度而无法获得足够的心肌细胞,同时对细胞膜也有较强的破坏作用,因此对其要求比较严格。
胰酶消化同时还需根据消化时心肌组织的形态、色泽及消化液的浑浊程度来判断心肌细胞分离的情况,并不断地在显微镜下取消化液来观察其消化程度,以便及时用胎牛血清来终止消化。
而胶原酶主要通过作用间质中的胶原纤维,达到释放心肌细胞的作用,其作用缓和,胶原酶 型较适合心肌细胞的分离(Clark等,1998),它可以和胰蛋白酶同时使用(Suzuki等,1989)或分开使用(Yonem ochi等, 1998;Baltoli等,1997),但应用效果国内外文献报道并不相同,且尚无一致意见。
试验中同时运用这两种酶,0.1%的 型胶原酶37 消化20min,同时再加0.25%的胰酶消化15min,结果能够较好的分离心肌细胞(葛建军等,2005;王娜等,2007)。
而离心速度超过1500r/min,易造成细胞机械损伤;过53中国畜牧兽医 2010年第37卷第3期生理生化小则会引起细胞沉淀不完全,一般不低于800r/min 。
本试验采用1200r /min,离心10m in 。
3.2 关于细胞培养 在细胞培养中,培养液的缓冲作用很关键。
打开培养瓶时,CO 2逸出易引起pH 升高。
为了避免培养液中溶解的CO 2和碳酸盐完全丢失,目前多采用4-羟乙基哌嗪乙磺酸(H EPES),控制pH 在7.2~7.6范围内。
对于消化后培养的心肌细胞的接种密度,国内外报道不一(陈妍等,2006),范围多在1 105~5 105个/mL,接种的细胞数不能太多,也不能太少。
细胞数过多,易发生细胞生长营养不良;而细胞数过少,细胞之间又无法进行信息交流,心肌收缩不易同步。
本试验中首次接种的心肌细胞密度为2 105个/m L,以利于细胞的生长,以后的接种密度比较低些。
4 小结综上所述,本试验认为胶原酶和胰酶共同作用心肌组织,用10%胎牛血清及时终止消化反应,同时又采用连续2次差速贴壁60min 去除成纤维细胞的干扰,可获得数量多、纯度高和活力高的心肌细胞。
参考文献1 牛建立,张宝仁,朱家麟.培养心肌细胞在心肌损伤模型中的应用[J].第二军医大学学报,1997,18(2):192~194.2 王娜,关鹏,段相林,等.新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改进[J].河北师范大学学报(自然科学版),2007,2(31):256~261.3 王亭忠.大鼠成体心肌细胞的分离和培养[J].第四军医大学学报,2005,26(17):1544~1546.4 许秀芳.成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察[J].首都医科大学学报,2000,21(2):104~107.5 吴宏梅,刘帅,包阿东,等.不同胎牛血清对动物细胞体外培养的影响[J ].中国畜牧兽医,2009,36(4):96~99.6 陈妍,王振远,郭秀侠,等.乳鼠心肌细胞的原代培养方法的改进[J].中国生物制品学杂志,2006,19(5):520~521.7 葛建军,周正春,汪学龙.原代培养小鼠心肌细胞的观察与鉴定[J].中国药理学通报,2005,21(11):1402~1403.8 Clark W A,Decker M L,Jan es D M ,et al.C ell con tact as an in -dependen t factor moduletating cardiac myocytes hytertrophy an d su rvival in long -term primary cultu re.J M ol C ell Cardiol,1998,30:139~155.9 Baltoli M ,Clay comb W C.T rans fer of macromolecules into livin gadult cardiomyocytes b y micr oin jection.M ol Cell Biochem ,1997,172:103~109.10Kono T ,Pollman M ,Corvol P,et al.Roles of collagenase an dother proteolytic enzymes in the dispersal of anim al tiss ues.Bio -chem Acta,1968,178:397~400.11M in J Y,Yang Y K,et al.Transplantation of em bryonic stemcells improves cardic function in p os tin farcted rats [J ].Appl Physiol,2002,92(1):288~296.12Ros e A M ,Qazzaz H M ,Zolotarjova N,et al.Sodium pum pisoforms in xen otransplantation:importan ce of biochemical com -patibility.C lin Chem ,2000,46(2):234~241.13Sim pson P,M cGrath A,Savion S.M yocyte h ypertrophy in neo -natal rat cu lture and its r egulation by serum and catech olam ines [J].Circ Res,1982,51:787~801.14Suz uki T ,Ohta M ,Hos h H.S eru m -free,ch emically defined med-ium to evaluate the direct effects of grow th factors and inhibitors on proliferation and fun ction of neonatal rat cardiac m uscle cells in cultu re.I n Vitr o Cell Dev Biol,1989,25:601~606.15T os hiyuki M ,Ryoji,Tets uya O,et al.Ty pe 2angioten sin re -ceptor is dow nregu lated in cardiomyoytes of patients w ith h eart failu re.Cardiovas c Res,2000,46:73~81.16Yonem ochi H,Yasunaga S ,T es hima Y,et al.M echan ism of ad -ren ergic receptor upregulation indu ced by ACE inhibition in cul -tured neon atal rat cardiac m yocytes.Circ Res,1998,97:2268~2273.17Zhang J F,H ou J F,Zhang J ,et al.Study on the clonin g,ex -pres sion,and bioactivity of recombin ant chicken IGF - [J].Ag -ricultu ral Sciences in China,2006,5(6):462~467.Study of Methods on Myocardial Cells Isolation and Culture in PigletsWU Xu -y ing,GU O Liang(Department of A nimal Science,T ianjin A gr icultural College,T ianjin 300384,China)Abstract:T o fo und an easy w ay to isolate and cult ur e myocar dia l cells o f piglets,the hear ts w ere dig ested by collagenasetype and tr ypsin.T he digestio n w as stopped by adding 10%F BS.Ca rdiocyt es were filtered by 100item o f cells sieve and pr ecipitated by centrifug atio n,and t hen added the medium to car diocytes.Cells w ere pur ificated t o reduce fibro blast content by adhere bott le and then incubated in the CO 2incubato r.T he r esults show ed that the cells wer e round before adhesio n;12t o 24ho ur s later ,the cells of fusifor m and polyg on began to adhere and str etch o ut the par apo dium;3to 4days later,cell clust er s formed;5to 7day s later ,the cells g rew tog ether flakily.L arg e ca rdiocyt es w ith w ell morpholog y and hig h livability could be co nv enient and quickly o bt ained by dig esting of collag enase ty pe and t ry psin.Key words:car diocyte;cells culture;piglet54 生理生化中国畜牧兽医 2010年第37卷第3期。
