心肌细胞分离方法

原代小鼠心肌成纤维细胞提取方法1.提前配置0.8%胰酶 3mL、0.1%胶原酶II 10mL（均用DMEM配置），放入37℃水浴锅中预热15min；准备1个50mL的离心管，提前加入10mL含10%FBS的完全培养基，冰浴备用；2.取5-10只7天出生内的C57乳鼠，用灭菌或消毒的组织剪剪开胸腔，迅速取出心脏，置于含2%双抗的预冷的DMEM培养基中；3.将心脏组织转移至超净台，用DMEM反复清洗，取出血液、大血管组织，将组织放入1个1.5mL的EP管中，充分剪碎（小于1mm3）;4.用巴氏管向组织块中加入1mL预热的胰酶，反复吹打、吸入至含胰酶的离心管中，37℃水浴加热3min，适当振荡；[循环1]5.吸取上清液丢弃，余下的组织块中加入2mL胶原酶，37℃水浴加热5min，期间每分钟振荡1次，吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环2]6.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次）后水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环3]7.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀2min后（约30次），此时肉眼可见组织块逐渐变小，呈透明粘液状，随后再次水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环4、5]8.向组织块中再次加入1mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次），此时肉眼可见组织块逐渐消失，消化液变得浑浊，再次水浴消化3min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环6、7]；9.将50mL离心管中的液体分装入2个15mL离心管中，1000rpm离心6min，小心吸去上清液，组织/细胞沉淀加入1mL完全培养基吹打混匀后转移至50mL的培养瓶中，加3mL完全培养基（含4%双抗），2h后可见细胞贴壁，12h内换液；2-3d后常规传代（1:2），P1-2用于实验。

原代乳鼠心肌细胞分离培养的改进包馨慧;李晓梅;杨毅宁;马依彤;陈邦党;陶静;陈小翠【期刊名称】《新疆医科大学学报》【年(卷),期】2015(000)005【摘要】目的：探讨提高细胞纯度、存活率及活性的乳鼠心肌分离培养方法。

方法改进心脏组织的处理方法，用胰酶预处理后再用II 型胶原酶依次处理心肌组织，采用差速贴壁及化学药物纯化心肌细胞。

结果提取的单个心肌细胞结构完整，呈类圆形；12 h 时大部分细胞贴壁；24 h 后几乎全部贴壁，仅见少量漂浮细胞，贴壁细胞伸出伪足，呈梭形、三角形等，细胞出现自主搏动。

48 h 后心肌细胞伪足间形成联接，交织成网状，局部心肌细胞出现同步搏动。

3 d 后心肌细胞聚集成簇，呈岛屿样搏动。

心肌细胞存活率为96．6％，纯度＞96％。

结论此改进方法所提取培养的乳鼠心肌细胞存活率及纯度高，细胞活性好，结构功能完整，可用于相关实验中原代乳鼠心肌细胞的分离培养。

%Objective To improve the traditional method of culturing neonatal rat myocytes for the better purity,survival rate and activity of myocytes in experiments.Methods Trypsin and type Ⅱ collagen en-zyme were used to digest heart tissue and myocytes were purified with differential sticking wall method and chemical purification.Results The extracted single myocyte is of structural integrity and circular shape. Most cells were touching to wall in 12 hours,and all cells sticking to wall in 24 hours,with small amount of floating cells.The touching-wall cells extended pseudopodia in the form offusiformis,triangle and so on,with independent rhythm.Myocardialcells′pseudopodia became connected into webs 48 hours later, with local synchronization rhythm.There days later,myocytes gethered into clusters,with island-like pulse.The activity and purity of myocytes was up to 96%.Conclusion This method helped improve the activity and purity of myocytes,and protect the integrity of cells.The extracted myocytes could be used in relative experiments.【总页数】4页(P564-566,570)【作者】包馨慧;李晓梅;杨毅宁;马依彤;陈邦党;陶静;陈小翠【作者单位】新疆医科大学第一附属医院心脏中心，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院心脏中心，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院心脏中心，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院心脏中心，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院心脏中心，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院心脏中心，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院心脏中心，乌鲁木齐 830054【正文语种】中文【中图分类】Q463【相关文献】1.SD乳鼠原代心肌细胞培养方法的改进 [J], 张晓京;张建栋;来丽娜;宋丽华;张晓一;郭春花;郑王巧;宋晓亮2.乳鼠心肌细胞原代培养方法的改进 [J], 王宁;李应东3.原代SD仔鼠心肌成纤维细胞分离与培养方法的改进 [J], 张平;谭延振;张冰;赵荣;金振晓;易定华;孙阳;易蔚;李香敏4.乳鼠心肌细胞的原代培养方法的改进 [J], 陈妍;王振远;郭秀侠;于洪涛;邓英杰5.一种改良的原代大鼠乳鼠心肌细胞分离及培养方法 [J], 程俊;曾晓荣;谭晓秋;李鹏云;文静;陈琳琳;杨艳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养一、实验动物1~3日龄C57小鼠乳鼠10只。

二、试剂及配制高糖DMEM( gibco)、Ⅰ型胶原酶（MP）、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清（gibco 160000-044）、青霉素-链霉素混合液（solarbo）。

培养液: DMEM培养基：FBS：双抗 100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)稀释, 配成0.1%胰蛋白酶消化液;将Ⅰ型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)中, 配成0.1%的胶原酶消化液。

0.1%胰蛋白酶及01% Ⅰ型胶原酶以2∶1混合, 现配现用。

三、实验仪器超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机……四、组织消化和分离细胞1、将乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。

用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用聚维酮碘消毒胸、腹部皮肤。

2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。

用眼科虹膜剪在剑突处正中线稍偏左向上开胸后用剪子压住胸骨右缘, 使心脏自然跳出, 用弯镊子勾住心脏根部, 取出心脏, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。

3、将鼠心脏全部取出后, 剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管, 预冷ＰＢＳ液清洗3次, 去除血污。

4、将心脏剪成约1mm ×1mm×1mm的组织块, 刮入加有搅拌子的锥形瓶中, 酶消化液冲洗剪刀及培养皿, 转移至锥形瓶中。

5、加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍, 37 ℃水浴, 打开磁力搅拌器, 60r/min搅拌10min, 吸管轻轻吹打组织块1min分散细胞, 自然沉降2min后遗弃上清液。

6、再次加入消化酶液8～15ml消化8min。

五、培养细胞1、吸取上清液入离心管, 加入预冷培养液2ml, 吹打均匀后, 1 200r/min离心4min, 弃上清, 细胞沉淀加预冷的培养液吹打后成细胞悬液用封口膜封口放于冰中备用。

心肌细胞培养实验方法[基本原理]心肌细胞培养用机械方法及酶消化法，将心肌细胞分离成单个细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，在体外适宜条件下使之生长繁殖，并保留其结果与功能特性。

[设备及试剂]1 仪器设备：超净工作台、二氧化碳培养箱(可用恒温培养箱代替)、离心机、电磁搅拌器、恒温水浴、PH值测定仪、普通及倒置显微镜等,以及一般实验室设备.2 常用试剂有以下几种：培养基：常用Eagle、199、1640、F10、F12、PuckN-16B SM20等。

其中国产的Eagle培养基（MEM)较为常用，根据实验的特殊要求，可选用无糖、缺氧，不同浓度的各种无机离子等特殊培养基。

平衡盐溶液：常用磷酸缓冲盐溶液（P、B、S），无钙镁磷酸缓冲盐溶液（CMF-PBS）及Hank’S液等。

消化液：常用胰蛋白酶（Difco 1:250)，必要时加用胶原酶，弹性蛋白酶等。

抗菌素溶液：取青霉素100万单位，链霉素1g，用双蒸馏水或磷酸缓冲液100ml，配成双抗液备用。

[操作步骤]1 心肌组织的选择：选择乳鼠的心脏。

2 心肌组织块的制备：乳鼠用75％乙醇或1％新洁尔灭消毒皮肤，固定四肢，胸部向上，再用2％碘酊及75％乙醇分别消毒胸腹部皮肤，用虹膜剪剪开胸部皮肤，暴露皮下组织，再用碘酊及乙醇消毒皮下组织，更换剪子及镊子，开胸取心，在盛有磷酸缓冲液或Hanks 液的瓶皿中洗涤后，剪去心房，将心室放入另一平皿中，用吸管吸取磷酸缓冲液反复冲液三次，洗净残留积血。

将一定数量的心室放入三角瓶或离心管的侧壁上，用虹膜剪剪成1mm3碎块，以备消化。

3 心肌细胞悬液的制备：根据实验要求，可选用一次或分次消化法制备细胞悬液。

后者较为常用，在大离心管中放入组织碎块及0.06~0.25% 的胰蛋白酶溶液8~15ml，加入磁棒两根，在磁力搅拌器上，37℃水浴中消化10分钟，自然沉淀，弃去上清，再加入胰蛋白酶液8~15ml，消化10分钟，再用吸管吹打组织块1分钟，自然沉降后，将上清液及沉淀物分别处理。

酶解法分离犬肺静脉肌袖和心房肌细胞黄焰;侯月梅【摘要】目的:探索简单实用重复性好的犬肺静脉肌袖和心房肌细胞的分离方法.方法: 采用两步酶解法,分离得到犬肺静脉肌袖细胞和心房肌细胞,用形态学和台盼蓝染色鉴别分离的心肌细胞,使用倒置显微镜观察和摄像记录.结果: 分离心肌细胞的存活率为30%～60%,形态呈杆状、折光性好、横纹清晰,膜状态良好.结论: 使用两步酶解法能获得存活率高,数量较多的心肌细胞,是一种简单实用的分离心肌细胞的方法.【期刊名称】《新疆医科大学学报》【年(卷),期】2008(031)011【总页数】3页(P1513-1515)【关键词】犬;酶解法;肌袖;心房肌细胞【作者】黄焰;侯月梅【作者单位】新疆医科大学第一附属医院心脏中心,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学第一附属医院心脏中心,新疆,乌鲁木齐,830011【正文语种】中文【中图分类】R-332;R542.220世纪70年代以来，国外就已开展胶原酶二步灌流法分离哺乳动物的心肌细胞[1]。

细胞制备的质量直接影响实验的成功率。

因此，制备合适的细胞标本是非常重要的。

现在多用酶解分离成年动物心脏作细胞标本，心脏各部位组织细胞的电生理特性不尽相同，所以使得人们把最初集中于对心室肌细胞的研究逐步扩展到对心脏各部位的组织细胞中。

这项技术在我国开展不多，本研究采用胶原酶二步消化法对6只成年家犬心肌细胞进行了成功的分离,现报道如下。

1 材料和方法1.1 实验动物健康成年杂种犬(普通级)6只，体重15～20 kg，雌雄不拘，新疆医科大学第一附属医院医学实验动物中心提供，试验方案经伦理委员会审议同意并签署批准意见。

1.2 试剂和溶液的配制胶原酶(worthington公司，392 U/mg)；无钙液(mmol/L)：NaCl 137，KCl 5.4，MgCl2 1，NaH2PO4 0.33，HEPES10(SIGMA公司)，葡萄糖10，用NaOH调pH至7.4。

一、实验目的1. 了解异丙肾上腺素对心肌细胞收缩力的影响；2. 掌握心肌细胞收缩力测定的方法；3. 分析异丙肾上腺素对心肌细胞收缩力的影响机制。

二、实验原理心肌细胞收缩力是指心肌细胞在收缩过程中产生的力量。

异丙肾上腺素是一种儿茶酚胺类物质，具有激动β受体、增强心肌收缩力的作用。

本实验通过测定异丙肾上腺素对心肌细胞收缩力的影响，探讨其对心肌细胞收缩力的调节作用。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜心脏组织、异丙肾上腺素、生理盐水、磷酸盐缓冲液（PBS）、氯化钾、钙离子载体、荧光染料等；2. 实验仪器：显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、细胞培养箱、酶标仪等。

四、实验方法1. 心肌细胞分离：取新鲜心脏组织，剪去血管和脂肪，将心肌组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，用酶消化法分离心肌细胞；2. 心肌细胞培养：将分离得到的心肌细胞接种于培养皿中，在细胞培养箱中培养至细胞密度达到80%；3. 异丙肾上腺素处理：将培养好的心肌细胞分为实验组和对照组，实验组加入一定浓度的异丙肾上腺素，对照组加入等体积的生理盐水；4. 心肌细胞收缩力测定：利用激光共聚焦显微镜观察心肌细胞在异丙肾上腺素处理前后的收缩情况，并通过荧光分光光度计测定心肌细胞收缩力；5. 数据分析：对实验数据进行分析，比较实验组和对照组心肌细胞收缩力的差异。

五、实验结果1. 实验组心肌细胞在异丙肾上腺素处理后，收缩幅度和速度明显增加，与对照组相比，收缩力显著增强（P<0.05）；2. 异丙肾上腺素处理后，心肌细胞内钙离子浓度升高，表明异丙肾上腺素通过增加心肌细胞内钙离子浓度来增强心肌细胞收缩力。

六、讨论1. 异丙肾上腺素是一种重要的儿茶酚胺类物质，具有增强心肌收缩力的作用。

本实验结果表明，异丙肾上腺素可以显著增强心肌细胞收缩力，这与异丙肾上腺素激动β受体的作用有关；2. 异丙肾上腺素增强心肌细胞收缩力的机制可能是通过增加心肌细胞内钙离子浓度来实现的。

心肌细胞的分化和再生机制探究心脏是人类生命中最重要的器官之一，而心肌细胞是心脏运行中不可或缺的组成部分。

相对于其他组织，心肌细胞的再生能力非常有限，因此患上心脏疾病等疾病后对心脏功能修复和恢复具有重要的指导意义。

在本文中，我们将探讨心肌细胞分化和再生机制的相关内容。

一、心肌细胞分化与再生的基本原理心肌细胞是一种高度专业化的细胞类型，主要特征是表达心肌特异性基因，并拥有传导电信号的能力。

在心肌细胞的发育过程中，主要有两个阶段。

第一个阶段是心肌细胞的增殖期，这一时期主要发生在不长的胚胎时期和早期新生儿期。

第二个阶段是心肌细胞的差异与成熟期，这一时期主要发生在胎儿期后和成年期。

在心肌细胞分化和再生中，一些关键的信号通路和分子非常重要。

例如，Wnt 信号通路和丝裂素原象调节因子SMAD等在心肌细胞的增殖和分化中发挥着至关重要的作用。

此外，一些微环境因素如细胞外基质，细胞因子和细胞-细胞相互作用等也对心肌细胞分化和再生起着重要的影响。

但是，我们需要清楚地认识到，相对于其他组织，心肌细胞分化和再生的能力非常有限。

通常情况下，心肌细胞在成年期内并不会进行显著的增殖，且心肌细胞的再生能力是非常有限的，因此一旦心肌细胞遭受到损伤，就需要其他细胞类型对其进行替代式修复。

二、心肌细胞分化和再生机制的研究进展早在20世纪50年代，人们开始研究心肌细胞分化和再生的机制。

在许多实验中，科学家们尝试了啮齿动物模型——如大鼠，以研究其心肌细胞再生和分化的机制。

研究表明，心肌细胞在一定程度上具有再生的能力，但是这一能力非常有限。

在最新的研究中，科学家们将目光转向了干细胞及其衍生引导分化的可塑性。

在实验中，研究人员将干细胞转化为心肌细胞，并使用一些生长因子和细胞因子进行诱导分化。

研究发现，这种干细胞诱导法可以产生与原始心肌细胞相似的心肌功能。

此外，一些细胞-光遗传学方法和基因编辑技术也被用来研究心肌细胞分化和再生的机制，这些技术的广泛应用为我们深入探究心肌细胞分化和再生机制带来了很有希望的前景。

乳鼠心肌细胞培养经验谈1. 心肌细胞搏动差，取材后2、3天细胞活力明显下降：胰酶＋胶原酶II混合消化的方法,并且每次消化前都轻柔的吹打让组织充分和消化液混合，消化后也充分吹打后静置1－2分钟再吸上清，最后离心完成后，用培养基重悬沉淀是要充分吹打，以避免再下一步过滤时大量的丢失细胞。

还要保证种板的密度，一般24孔板我们用2。

5×105，每孔1ml，这样24h后就可以很漂亮的看到细胞搏动了，一般72h后搏动就是统一的频率了。

经验一：总结来说:1。

0.08%胶原酶II＋0。

125%胰酶等比混合后消化2.消化前后一定要轻柔吹打3.重悬时要充分吹打,动作轻柔（100次）4。

种板密度要合适5.当然血清,板都要进口，别图便宜6.别忘了检查CO2温箱的情况2.消化时总是出现冻冻状东西啊,吸时会把组织快吸走：胶冻样的东西应该是组织间未消化掉的胶原吧,或消化后的碎细胞ＤＮＡ．用ＤＮＡ酶消化后就没了。

经验二:1:首先是选择乳鼠时最好是出生3天内的,活力是较好的,皮肤看起来是暗红色的,再大一点的话,皮肤变厚，变白，不过也能养活，而且1个25CM2的培养瓶3只足够了，当然这里说的是SD的。

2：胰酶加胶原酶消化，消化过程中出现絮状物，可能是消化有些快了，处理：如果样品足够多就可以将之丢去；样品少的话，可以先将所有的样品吸入另一新的离心管，重新在这个管字消化，将细胞悬液用5％血清培养液中止消化，而且一定得尽快中止，离心后再中止一次即可。

离心1000转4分钟.3：四季清的胎牛血清,180元一瓶，很便宜，进口的没用过,我们隔壁有人用2000元一瓶.这个和老板有没有钱有关系,要是有钱，我建议用进口的。

我们用的是15%的浓度。

（注意:终止液和培养液浓度是不同的，终止液没必要用那么高浓度，有点浪费）,我们用高糖的DMEM，感觉不错。

在这里我感觉最重要的培养液的PH 值，尽量在7。

2—7。

4之间,刚开始我们还有仪器测，后来就观察颜色了,觉得不行就用HCL或NAOH调，大部是高，没有低的。