基因诊断06275 PPT课件

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二、基因诊断的应用
1、遗传疾病 2、感染性疾病 （1）病毒性感染 （2）细菌性感染 （3）寄生虫 （4）其他
3、恶性肿瘤 4、法医学中的应用 （1）DNA指纹分析（DNA fingerprinting） （2）短串联重复多态性分析 （short tandem repeat，STR）
1、遗传病中的应用
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PCR-VNTR检测
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PCR-VNTR
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三)单核苷酸多态性（SNP）
（Single Nucleiotide Polymorphism）
SNP：发生在基因组中的单个核苷酸的替代 根据SNP在基因中的位置，分为：
基因编码区SNP
基因周边SNP 基因间SNP
在人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP
p480
第9章
基因诊断
Gene diagnosis
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传统的诊断：
1 2 传统中医理论： 化验/检验： 细胞、组织、大分子、小分子、酶、代谢物：微生物、 免疫、生化、病理
3 影像学：
X射线、B超、CT、核磁共振、内窥镜 4 特殊检查： 染色体、肌电/脑电/心电、骨密度、原子吸收光谱等 巨大缺陷？
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PCR/单链构象多态性分析（SSCP）
PCR产物变性后， 经聚丙烯酰胺凝胶电泳，
正常基因和变异基因的迁移位置不同，
可分析确定致病基因的存在。
基因诊断技术
--------------------------primer --------------------------↓ 32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 ↓ 变性 ↓ 单链DNA ↓ 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ↓ 1 2 3 自显影 ↓ 结果分析

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直接基因诊断—
突变型遗传病的直接基因诊断
e.g. 镰形红细胞贫血的基因诊断
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e.g. 镰形红细胞贫血的基因诊断
1）Southern blot β珠蛋白链基因第6位密码子发生突变
GAG——GTG 谷Aa——缬Aa
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已知限制酶Mst 1识别序列 （CCTNAGG）
CCTGAGG
CCTGTGG 突变后不能识别， 酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。

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核酸分子杂交的基本原理

根据核酸变性和复性的原理，不同来 源的DNA变性后，若这些异源DNA之间 存在某些相同序列的区域，在退火条 件下则可形成DNA-DNA异源双链；或 将变性的单链DNA与RNA经复性处理可 以形成DNA-RNA杂合双链。这种不同 来源的单链核酸分子在合适的条件下， 通过碱基互补形成双链杂交体的过程 称为核酸分子杂交（molecular hybridization）。
DNA多态性（DNA Polymorphism）： 群体中每个个体DNA区域中等位基因 （或片段）存在两种或两种以上的形式，对 基因功能没有影响，称DNA多态性。 它通过孟德尔方式遗传。常用做遗传分 析中的标记。
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DNA分析中常用的遗传性多态性标记有3类：
1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多
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加热使DNA变性是实验室最常用的方法，称为热变性，DNA热变性 发生在一个狭窄的温度范围内。通常将DNA变性达到50%时（即增 色效应达到一半时）的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature），用Tm表示。 退火（annealing）：热变性DNA 在缓慢冷却时，可以复性，这种 复性称为退火。

细菌性感染：
▪ 可应用基因诊断检测多种致病性的细菌， 如结核分枝杆菌、痢疾性大肠杆菌、霍乱 弧菌、淋球菌、绿脓杆菌……等。
PCR在结核杆菌诊断中的应用
▪ 结核杆菌可以导致全身性疾病，特别是在 发展中国家，其发病率较高，危害性极大. 近几年结核杆菌的变异性较大，对抗痨药 物的耐药性增加，从而使结核病的发病大 幅度增高.虽然传统的涂片抗酸染色、细菌 培养以及胸片检查对大部分结核能作出正 确的诊断，但对某些病人亦可造成误诊或 漏诊;动物接种虽特异性较高，但因时间较 长，不能满足临床快速诊断的需要.
三、基因诊断的临床意义
1.可以更加准确的对遗传性疾病作出诊 断，对了解发病过程和机制，为疾病的 分类和分型，以及最终治疗这些疾病提 供理论依据。
2.进行产前基因诊断，提高人口素质 3.进行病原体的流行病学检查。 4.更好的完成组织配型，提高器官移植
的成功率。
第二节 基因诊断的原理
一、人类基因的结构： 二、基因的表达与突变
PKU的临床表现
▪ 患儿在 刚出生时，由于无苯丙氨酸的摄入 因此无临表现.随着患儿的进食而连续出现 智力进 行性下降，皮肤色素浅，肌张力高， 惊厥发生，汗和尿中有特殊的臭味，最终 生活不 能自理，智力严重障碍。
PKU的遗传学
▪ PKU是一种常染色体隐性遗传病，患儿的 父母为致病基因的携带者而患儿为纯合 子. 引起PKU的基因的PAH，该基因位于 12q22-24.2全长约90kb，包括13个外显子 和12 个内含子.内切酶解分析显示PAH的完 整cDNA其有8个限制性内切酶切点，形成 10个 RFLP.
基因诊断
Gene diagnosis
第一节 概述
基因变异致病可分为两种主要类型
1 内源基因的变异：由于先天遗传背景 的差异和后天内、外环境的影响，人类 的基因结构及其表达的各个环节都可能 发生异常，从而导致疾病。

研究基因与疾病关系主要目的在于：
①确定致病基因或疾病易感基因； ②阐明这些基因的功能和在疾病发生发展中的作用 机制； ③指导临床诊断、治疗和预后的实践。
传统的疾病诊断方法
基因诊断 Gene Diagnosis
基因诊断又称分子诊断，就是应用分子生物学和分子遗传学的原理、技术， 通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。
自杀基因的作用机制
二、基因治疗的流程
ex vivo
靶细胞
载体 目的基因
in vivo
基因转移可由病毒和非病毒介导
• 病毒介导（生物学方法）：
反转录病毒 腺病毒 腺相关病毒
非病毒介导（非生物学方法）：
脂质体 受体 直接注射 其他：磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡
聚糖法、细胞显微注射、基因枪
一、基因治疗的策略
• 基因置换矫正基因缺陷
基因添加矫正基因缺陷
添加缺陷基因或治疗基因
基因干预抑制某个基因的表达
反义核酸、核酶、干扰RNA技术
自杀基因治疗恶性肿瘤 基因免疫治疗肿瘤
反义核酸技术
天然核酶多为单一的RNA分子，具有自我剪切作用。 但核酶也可以由两个RNA分子组成。
核酶的作用机制
蛋 白质合成，或诱发对感染细胞的免疫反应 ;
缺乏高效特异的基因导入系统
感谢下 载
RFLP
导致某一限制酶识别位点 丧失或获得的点突变，
分析限制性酶切图，ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ可 诊断出此类突变。
34bp 76bp
x
110bp
PCR-RFLP
等位基因特异性寡核苷酸（ allele specific oligonucleotide， ASO）探针斑点印迹杂交分析法