基因诊断genediagPPT课件

5’ 3’
2n
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.
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
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PCR
PCR
PCR的衍生类型：
1. 反转录PCR 2. 原位PCR
3. 重组PCR 4. 不对称PCR
5. 多重PCR 6. 反向PCR
组织（如血液）中总RNA提取 RNA
反转录成cDNA
RNA cDNA
cDNA
利用HIV特异性引物进行 PCR
电泳检测预期条带的出现
.
600 bp
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• 肿瘤
通过从基因水平检测细胞内可能导致肿瘤发生 的基因突变、扩增、重排、缺失，或mRNA水平 检测肿瘤细胞中特异表达的基因或基因表达量的 改变，对肿瘤进行早期诊断，并对肿瘤进行分类、 预后判断。
一、核酸分子杂交
原理：核酸的变性复性理论。
双链的核酸分子在某些理化因素（如高温等） 作用下，双链解开，待条件恢复时，又按碱基互 补配对规律形成双链结构。在这一过程中，不同 来源的DNA（RNA）分子，只要具有部分互补配 对的碱基序列，即可形成杂合双链。
核酸印迹杂交：Southern blot, Northern blot
.
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• 重大疾病的易感性
检测人类白细胞抗原基因等与疾病的易感性相关 的基因
• 器官移植组织配型
• 法医学 (个体识别、亲子鉴定、法医物证)
DNA 指纹：（1）RFLP （2）串联重复序列
.
42
.
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遗传咨询与基因诊断
1
定义
遗传咨询（Genetic Counseling）是指有专业背景的医师或遗传学工
作者通过对遗传病易感性、遗传模式等进行评估和分析，从而对患者
进行遗传咨询的一门专业。
2
必要性
尽管基因检测可以提供很多有价值的信息，但医生和患者还需要一种
更全面的咨询，以便在基因诊断中做出更好的决策。
传性肿瘤的诊断，也应用于病毒感染、分子人类学、基因工程等方面。
蛋白检测技术及其在基因诊断
中的应用
1
定义
蛋白检测是指检测某一特定蛋白的数量及品质，从而鉴定某一相关分
子生物学操作所获取的实验数据的质量。
2
应用
包括免疫印迹法、质谱、蛋白芯片等技术，可以帮助人们诊断和检测
各类疾病，例如肿瘤、糖尿病、心血管疾病。
技术研究中的空白。
测序技术
测序技术是基因诊断的重要手段，可帮助确定DNA序列及其突变信息。
核酸检测技术及其在基因诊断
中的应用
1
定义
核酸检测是指检测某一特定核酸的存在或变异，以完成相应分子生物
学任务的一种技术。
2
应用
包括PCR，西方印迹法、原位杂交等技术，不仅用于检测基因诊断常
用的结构性或功能性类似疾病的突变、多基因遗传性疾病的筛查、遗
共享基因组学数据库的建立与应用
概念
应用
共享基因组学数据库是指一系列的数据库和资
它可以为广大科学家提供进行基因组学分析所
源中心，包括人类基因组项目、1000人基因组
需的数据，帮助完诊断中的伦理问题
1
个人隐私
基因数据可以反映特定个人的敏感信息，因此需要保护个人隐私。
终于阅读了人类基因组，并

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直接基因诊断—
突变型遗传病的直接基因诊断
e.g. 镰形红细胞贫血的基因诊断
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e.g. 镰形红细胞贫血的基因诊断
1）Southern blot β珠蛋白链基因第6位密码子发生突变
GAG——GTG 谷Aa——缬Aa
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已知限制酶Mst 1识别序列 （CCTNAGG）
CCTGAGG
CCTGTGG 突变后不能识别， 酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。

6
核酸分子杂交的基本原理

根据核酸变性和复性的原理，不同来 源的DNA变性后，若这些异源DNA之间 存在某些相同序列的区域，在退火条 件下则可形成DNA-DNA异源双链；或 将变性的单链DNA与RNA经复性处理可 以形成DNA-RNA杂合双链。这种不同 来源的单链核酸分子在合适的条件下， 通过碱基互补形成双链杂交体的过程 称为核酸分子杂交（molecular hybridization）。
DNA多态性（DNA Polymorphism）： 群体中每个个体DNA区域中等位基因 （或片段）存在两种或两种以上的形式，对 基因功能没有影响，称DNA多态性。 它通过孟德尔方式遗传。常用做遗传分 析中的标记。
16
DNA分析中常用的遗传性多态性标记有3类：
1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多
5

加热使DNA变性是实验室最常用的方法，称为热变性，DNA热变性 发生在一个狭窄的温度范围内。通常将DNA变性达到50%时（即增 色效应达到一半时）的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature），用Tm表示。 退火（annealing）：热变性DNA 在缓慢冷却时，可以复性，这种 复性称为退火。

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（六）生物芯片（biochip）
2021/3/7
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PCR-SSCP分析原理
2021/3/7
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PCR-SSCP分析 －
+
正常人
纯合突变 杂合突变
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（四）限制性片段长度多态性分析
（restriction fragment length polymorphism, RFLP）
由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有 的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消 化时产生不同长度或不同数量的片段。
5. AS-PCR（allele specific PCR）
等位基因特异PCR：根据引物3´端 的互补与否，设计一对与正常或突变模 板配对的特异引物
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（三）单链构象多态性分析（single-strand conformation polymorphism， SSCP）
DNA 的突变造成DNA片段中碱基序列 不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶 中的构象不同（单链构象多态性），利用迁 移率的差别可使各种序列不同的单链分离开 来。
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1. RT-PCR
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2.荧光定量PCR
荧光标记引物
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3.多重PCR
多重PCR示意图 A：普通PCR；B：多重PCR
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4. PCR-ASO
G
ASO1 ASO2
A
G C
N
A C
H
A T
G
M
T
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N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因

? 直接采用PCR进行基因诊断 ? 采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析（ PCR-
RFLPs ）进行基因诊断 ? 采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针（ ASO）
斑点杂交进行基因诊断 ? 通过PCR产物的反相点杂交 (RBD)进行基因诊断 ? 采用PCR产物的单链构象多态性 (SSCP)分析进行基因
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Southern blot
是最经典的基因分析方法，不但能检出特 异的DNA片段，而且能进行定量和测定分子 量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突RNA的检测，能对组织细胞中总RNA 或mRNA进行定性和定量分析。
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斑点杂交（Dot blot）
可用基因组中特定基因及其表达的定性及定 量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量 少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量， 特异性不高，有一定比例的假阳性。
诊断 ? 采用PCR技术对靶核酸进行定量分析
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寡核苷酸杂交分析 SNP和等位基因特 异寡核苷酸杂交 （ASO）
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3、 DNA序列测定
DNA序列测定是进行基因突变检测的最 直接、最准确的方法，可以确定突变 的部位，突变的性质。
16
基本原理-------核酸变性和复性理 论
即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双 链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律 形成双链结构。因此应用已知碱基序列的单链 核苷酸片段作为探针，就可检测样本中是否存 在与其互补的同源核苷酸序列。
5
probe
probe
6
核酸杂交的关键要素
? probe DNA ? target DNA ? signal detection
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原位杂交
（Colony in situ hybridization）

1
0
、
倚
南
窗
以
寄
傲
，
审
容
膝
之
易
安
。
基因诊断和基因治疗
Gene Diagnosis and Gene Therapy
Section Ⅰ
Genetic Diagnosis 基因诊断
基因诊断的依据—基因变异:
内源性基因变异 基因结构突变 基因表达异常
外源基因的入侵
➢核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） ➢聚合酶链式反应(PCR) ➢单链构象多态性（SSCP） ➢限制性内切酶谱分析法 ➢限制性片段长度多态性（RFLP） ➢DNA序列测定（DNA sequencing） ➢生物芯片（biochips）
❖ 标记物：同位素、生物素或荧光染料 ❖ 探针种类(广义）：DNA(合成的寡聚核苷酸片段，
基因组DNA、cDNA)、RNA、Protein
（1） Southern 印迹杂交：
提取受检者DNA→限制性内切酶消化DNA以 产生特定长度的片段→凝胶电泳分离 →变性处 理DNA成单链→DNA转印到膜上并使其牢固结 合→将标记的探针与膜上DNA片段杂交，分析 杂交信号。
法合成后再固定于芯片上的寡核苷酸探针阵列。 DNA微矩阵（DNA Microarray）：将DNA探针通过自动
化点样技术固定于特定的固相支持物如玻璃表面，然后再 与靶序列杂交。
(2)基因芯片技术的原理
DNA芯片技术是将许多特定的寡核苷酸片段或基 因片段有规律地排列、固定于支持物（如膜、硅片 或玻璃片）上，然后通过类似核酸杂交的的方法与 待测的标记样品按碱基配对原则进行杂交，再通过 检测系统对其进行扫描，并用相应软件对信号进行 比较和检测，得到所需的生物信息。其特点是可进 行基因的高通量、大规模、平行化、集约化的信息 处理和功能研究。

40’’～1分
100bp/1分
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（1）DNA模板的变性
将待扩增DNA加热到950C左右，使双链DNA解开成 为单链（即：使模板DNA或延伸后的双链DNA发生热变性 ）， 并游离于反应体系中作为模板；
（2）模板与引物的结合（退火或复性）
将体系温度降至合适温度（550C左右），使加入
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荧 光 原 位 杂 交
9 29
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荧 光 原 位 杂 交
10 30
2、聚合酶链反应（PCR)
一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术。 （无细胞分子克隆技术）。
原理：
以待扩增DNA为模板，在互补模板两端序列的寡核 苷酸引物介导下，通过耐高温DNA聚合酶催化下， 按半保留复制机制沿模板链延伸，快速、特异地扩 增特定的DNA。
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基因诊断的基本策略：
1、检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因
这些基因根据其特定功能已被克隆，并被定位 在染色体上，基因序列亦被测定，致病时的基因改 变亦较清楚。
如：已被克隆的病毒、细菌、霉菌和寄生虫的基因、 与致病有关的癌基因、抗癌基因、
地中海贫血、苯丙酮尿症等遗传病基因。
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pH8.38.88 偏 碱 缓 冲 液 ； 并 含 有 一 定 量 的
Mg2+浓度；
（5）dNTP浓度
PCR 一 般 用 50200μmol/L 的 dNTP ； 并 且 4 种 dNTP浓度应相等；
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（6）参数
① 变性温度与时间
一般选择： 940C， 30秒

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人类基因组计划 带给我们什么
基因组 信息
翻译
?
临床应用
保健应用
基因检测成为重要的医学检查手段
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“人类基因组计划的完成为医学提供了大量信 息，目前已经有700余种疾病的基因诊断技术用于 临床。越来越多的基因诊断技术已用于广大人群， 主要用于： 1. 疾病相关基因变异携带者的发现 2. 常见疾病的遗传风险预测和提示 3. 指导个体化用药 基因检测和其它正在发展遗传筛选和预防技 术将对人类的健康医疗产生巨大的影响。” — 美国国家疾病控制中心基因检测部
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基因检测的分类
●
诊断性基因检测
多数用于有症状单基因疾病诊断 单基因疾病症状出现前的诊断
●
预测性基因检测
多数用于多基因常见疾病的遗传风险预测
●
个体化用药基因检测
用于指导临床药物治疗
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六. 基因组检测有什么用处？
▬ 基因组检测可以用于寻找疾病的易感者。 ▬ 新生儿单基因遗传病的筛选。 ▬ 携带者测试可以用来帮助了解他们是否携带 异常基因,避免将其传递给他们子代的风险。 ▬ 基因检测也被用于个体化治疗: 如指导硝酸 甘油用于治疗冠心病。 ▬ 基因检测还被用于指导个体化的医疗和保健。
遗传性突变(生殖性突变 ) — 从父母亲那里继承的 获得性突变(体细胞突变)— 体细胞突变在个别细胞DNA中出现
2018/10/21
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基因突变可能产生三种后果： 1. 不影响编码蛋白的结构和功能 2. 蛋白质仍有功能，但有缺陷 3. 蛋白质会完全失去作用
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人类基因组的变异