《基因诊断》PPT课件

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线粒体12SrRNA基因
• 在线粒体基因突变导致耳聋的患者中，绝大部
分是由于A1555G突变引起。
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• 检测方法：PCR+测序
引物名称
引物序列
12SrRNA-F 12SrRNA-R
CCTCAACAGTTAAATCAAC CTCTGGTTCGTCCAAGTG
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假阴性结果
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MLPA
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非综合征型耳聋
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耳聋简介
• 听力丧失是最常见的感觉障碍。 • 发病率：1/500 新生儿 • 非综合征型耳聋(nonsyndromic hearing
loss, NSHL)：指不伴有耳外组织异常或 病变的耳聋。
10余项技术组成。 基础，共由10余项技术组成。 共由20余项技术组成。
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脊髓性肌肉萎缩症
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2
脊髓性肌肉萎缩症
• SMA • 由于脊髓前角细胞运动神经元变性
导致近端肌肉萎缩和无力
• 发病率1/10000 • 遗传方式：常染色体隐性遗传
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临床特征
• 婴儿期学龄前及青春期发病 • 表现为四肢的近端肌肉对称性
（connexin 26，CX26）
• CX26在细胞与细胞间形成间隙连接，在感觉毛细
胞受到声音的刺激后钾离子回流到内淋巴液的过 程中起着重要的作用。
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基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交
方法（southern 、northern）是一致的，都是应用已知 核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随 后的信号检测进行定性与定量分析，基因芯片在一微小 的基片（硅片、玻片、塑料片等）表面集成了大量的分 子识别探针，能够在同一时间内平行分析大量的基因，
PCR的基本反应步骤
溶液反应温度 升至中温72℃ ，在 Taq酶作 用 下 ， 以 dNTP 为原料 ，引物为复制 起点，模板 DNA的一条单 链在解链和退 火之后延伸为 一 条 双 链
变性 95 ℃ 变性，双链解链
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
降低溶液温 度，使合成 引物在低温 （35－70℃, 一般低于模 板Tm值的 5℃左右）， 与模板DNA 互补退火形 成部分双链
二、基因诊断的特点
特异性高： 以分子杂交技术为基本原理
针对性强： 以探测疾病基因为目标，属于“病因诊断” 。
灵敏度高： 基因探针带有十分敏感的检测标记，可从人 类长达3×106kb的基因组中检测出某一基因的 单碱基改变。而且待测标本微量。 适应性强： 基因探针可为任何来源，任何种类，探针序 列可为已知亦可未知，检测目标可为内源基 因亦可外源基因，诊断范围广。 安全高效、适应范围广、早期诊断、取样方便等
获得DNA片段条状图谱,便是所谓的DNA指纹。
谢谢
基因诊断
学院：环资学院 作者：毛新伟 学号：2013116011006
传统对疾病的诊断主要是以疾病的 表型改变为依据，如患者的症状、 血尿各项指标的变化，或物理检查 的异常结果，然而表型的改变在许 多情况下不是特异的，而且是在疾 病发生的一定时间后才出现，因此 常不能及时作出明确的诊断

Blood samples - the most widely used source of DNA from adults.
Mouthwashes or buccal scrapes - being noninvasive, they are especially favored for population screening programs. Mouthwashes yield sufficient DNA for a few dozen tests, and by using whole genome amplification more extensive testing of a single sample may be possible.
数目变异的串联重复 (Variable number tandem repeats)
脆性x综合症就是由于三核苷酸（CCG）n重复序列的拷贝数增加所致
15:46
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染色体易位 （Translocation）
15:46
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剪切位点的突变
15:46 Abnornal bin primary RNA Transcript 22
基因突变对表型的影响大致上通过以下两种主要途径而实现：
（一）影响其产物组成或结构 （二）影响其表达的量
(一)基因突变改变表达产物组成和结构
碱基置换突变
同义突变 （cosense mutation）:基因突变只在非关键 的部位发生，如在密码子第3位由于简并性而发生 的并不会改变氨基酸，也不影响其产物的生物学活 性和性质
终止密码突变（termination codon mutation）：突变 在原来终止密码处产生非终止密码，变成编码氨基 酸密码，叫做则其表达产物多肽链会延长，也会失 去或大大减弱正常多肽链的功能。

RFLP分析法 限制酶酶切图谱直接分析法 RFLP间接分析法
（1）限制酶酶切图谱直接分析法
① 限制酶酶切—Southern印迹杂交。 ② PCR—限制酶酶切
应用RFLP诊断镰刀状红细胞性贫血
正常人珠蛋白基因
正常人珠蛋白mRNA 6 CTC GAG Glu 6 CAC
正常人珠蛋白肽链
HbS的珠蛋白基因
HbS的珠蛋白mRNA
HbS的珠蛋白肽链
GUG Val
MstⅡ酶切位点 CCTNAGG A T替换
MstⅡ酶 CCTNTGG
HbA ---------CCT GAG GAG-------
MstⅡ 1.1kb
HbS
MstⅡMstⅡ 0.2kb
---------CCT GTG GAG-------
• 2、聚合酶链反应的发明 • 直到1985年，美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室 Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR), 使人们梦寐以求的体外 无限扩增核酸片段的愿望成为现实。其原理类似于DNA 的体内 复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种 合适条件。开始是使用大肠杆菌 DNA聚合酶Klenow片段 来扩增人基因组中的特异片段。由于该酶不耐热，因此， 每次 加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。在操作多 份标本时，这一过程耗时，费力， 且易出错。耐热DNA 聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化，继而PE-Cetus 公司推 出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成 为现实。Mullis等因此项技术于1993年 获得诺贝尔奖金。
第一节
基因诊断 的技术方法
一、基因诊断中常用的分子生物 学技术 （一）核酸分子杂交 （二）聚合酶链反应（PCR） （三）单链构象多态性检测 （四）限制酶酶谱分析 （五）DNA序列测定 （六）DNA芯片技术

第二节 基因诊断的应用
1、遗传疾病 2、感染性疾病 （1）病毒性感染 （2）细菌性感染 （3）寄生虫 （4）其他
3、恶性肿瘤 4、法医学中的应用 （1）DNA指纹分析（DNA fingerprinting） （2）短串联重复多态性分析 （short tandem repeat，STR）
一、遗传性疾病
PCR/单链构象多态性分析（SSCP）
PCR产物变性后， 经聚丙烯酰胺凝胶电泳，
正常基因和变异基因的迁移位置不同，
可分析确定致病基因的存在。
四、限制酶酶谱分析
基因突变导致酶切位点的丢失或相对位 置发生改变
以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA，通过比 较二者的酶切片段，的长度，数量上的差异就可 判断待测DNA的突变情况。
㈤ DNA序列测定
是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法。不仅 可确定突变的部位，而且可确定突变的性质。 分子克隆到T载体上，或直接对扩增产物进行测序。
（六） DNA芯片技术
基因芯片(gene chip)
•DNA芯片(DNA chip) •cDNA芯片(cDNA chip) 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片 段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位
限制酶酶解及电泳分离
回收含已知基因的DNA片段
标记的探针 杂交 洗膜 放射自显影
转移到硝酸纤维膜或尼龙膜
预杂交
图 用Southern 印迹杂交方法进行基因诊断的基本步骤
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
②
①
③
分子杂交实验
目录
放 射 自 显 影 照 片
目录
核酸分子杂交
制 备 样 品 制 备 探 针
形成双链，由DNA聚合酶催

三、基因诊断的常用技术
（五）单链构象多态性分析
1.单链构象多态性（SSCP）分析 是一种分析突变基因的方法。 2.临床意义 SCP多与PCR技术联用（PCR-SSCP）检测基因突变，提高了基因突变检 测的灵敏性，现已广泛用于遗传病及肿瘤基因的分析。
三、基因诊断的常用技术
（六） 限制性片段长度多态性分析
临床的一些疾病的致病基因尚不清楚，很难用基因突变的检测诊断，对 基因连锁分析
这些遗传疾病采用基因连锁分析
如mRNA拷贝定量检测及mRNA长度分析等。mRNA检测在基因表达 基因表达分析
水平上为基因功能是否正常提供了直接依据
病原体诊断 外来入侵病原微生物遗传物质的检测
二、基因诊断在诊断学中的地位
传统的疾病诊断方法：主要是以疾病的表观改变为依据，不能及时作出明确的诊断。 基因诊断：病因的诊断，既特异又灵敏。 （1）可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态； （2）可以对表观异常不明显或不特异的携带者及某种疾病的易感者做出诊断和预测； （3）对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。
基因诊断
一、基因诊断的含义
基因诊断是在基因水平上对疾病或人体的状态进行诊断。它是以遗传物质 （如DNA或RNA）为检查对象，利用分子生物学技术，通过检查遗传物质结构或 表达量变化与否来诊断疾病的方法。
一、基因诊断的含义
基因诊断的主要内容
内容
评价
基因突变检测
如点突变、基因片段的缺失或插入、基因重排等不同类型基因突变的检 测
三、基因诊断的常用技术
（一）核酸分子杂交技术
1.核酸分子杂交：两条互补单链核酸（DNA或RNA）在一定条件下按碱基互补原则退火 形成双链的过程。 2.分子杂交方法的共同点 （1）应用了核酸序列的复性原理。 （2）采用了标记探针：同位素或非同位素标记的短片段特异DNA或RNA。

遗传性疾病、基因突变
详细描述
遗传性疾病基因检测是通过检测人类基因突变，对遗传性疾病进行诊断和预测的一种方法。该方法能够检测出多 种遗传性疾病，如先天性代谢缺陷、遗传性神经性疾病等，为患者及家庭提供早期干预和治疗方案，降低疾病对 个人和家庭的影响。
肿瘤基因检测
总结词
肿瘤、基因突变、个性化治疗
详细描述
报告撰写
撰写详细的检测报告，包括样本信 息、实验方法、结果分析和临床建 议。
04
基因检测的挑战与前景
基因检测的挑战
技术限制
当前基因检测技术仍存在一些局限性 ，如检测灵敏度、特异性及检测范围 等方面的问题。
伦理和隐私
基因检测涉及个人隐私和伦理问题， 如何保护个人基因信息不被滥用和侵 犯是一个重要挑战。
便携式基因检测设备
便携式基因检测设备将更加普及，方便个人随时随地接受基因检测。
人工智能和机器学习在基因检测中的应用
人工智能和机器学习技术将应用于基因检测数据的分析和解读，提高 准确性和可靠性。
多组学整合分析
未来基因检测将与其他组学技术（如蛋白质组学、代谢组学等）进行 整合分析，提供更全面的生物信息。
对于不同的疾病和样本类型， 需要选择合适的基因检测技术 ，以达到最佳的检测效果。03ຫໍສະໝຸດ 基因检测流程样本采集
01
02
03
血液样本
采集静脉血液，用于检测 血液中的基因变异和遗传 性疾病。
组织样本
采集病变组织或肿瘤组织 ，用于检测组织中的基因 变异和肿瘤相关基因。
口腔拭子
采集口腔黏膜细胞，用于 检测遗传性疾病和某些单 基因遗传病。
精准医疗
根据个体的基因信息，制定个 性化的治疗方案，提高治疗效 果。

《基因诊断与性传播疾病》：第七节 实验室检查
第七节 实验室检查：
Manos等设计的HPVL1通用引物 MY11：GCMCAGGGWCATAAYAATGG MY09：CGTCCMARRGGAWACTGATC 表1 HPV型MY11的第1个硷基位置MY09的第1个 硷基位置PCR产物长度（bp） 667227170448116707715544816658470354 5118655870124543365396987448 M=A+C， R=A+G，W=A+T，Y= C+T 表2列述了Manos等设计的寡核苷酸探针。
《基因诊断与性传播疾病》：第六节 临床表现
第六节 临床表现：
男性患者好发于包皮系带、冠状沟、包皮、 尿道、阴茎、肛门周围和阴囊。病初为淡 红或污红色粟状大小赘生物，性质柔软， 顶端稍尖，逐渐长大或增多。可发展成乳 头状或囊状，基底稍宽或有带，表面有颗 粒。在肛门部常增大，状如菜花，表面湿 润或有出血，在颗粒间常积存有脓液，散 发恶臭气味，搔抓后可继发感染。
《基因诊断与性传播疾病》：第七节 实验室检查
第七节 实验室检查：
3。PCR扩增方法和程序：以100μlPCR反 应液,用无菌0.5ml硅化塑料离心管为反应 管进行扩增反应。 （1）实验前配制预混反应试剂并分装。 预混反应试剂包括除标本DNA外的其它各 种PCR反应试剂。每支反应管中含有的PCR 反应试剂见表3。 表3每支反应管中的PCR反应试剂 反应试剂体积（μl）终浓度10×PCR缓冲 液101×PCR缓冲液dNTP贮备液 2200μmol/L每种dNTPMY11贮备液
《基因诊断与性传播疾病》：第七节 实验室检查
第七节 实验室检查：
在作细胞学检查的同时，将标本放入5ml 含有0.05%硫柳汞的PBS中，用PBS离心 （3000g，10min）洗涤2次，沉积细胞重 悬于1mlPBS中，取0.5ml细胞悬液抽提DNA。 2。标本核酸的提取：按1体积细胞悬液加 10倍体积的细胞裂解液（10mmol/l TrisHCl，pH 7.4，10mmol/L EDTA， 150mmol/L NaCl，0.4%SDS，1.0mg/ml蛋 白酶K）37℃下处理过夜;且等体积酚/氯 仿(1:1)，氯仿/异戊醇（24:1）各抽提2 次；加1/10体积3mol/l NaAc（pH5.2）及

4.原位杂交 可查明染色体中特定基因的位臵，用于染色体疾病的诊 断；原为杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位臵情况，因此可 检出含核酸序列的具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可检 出基因和基因产物的亚细胞定位。
(二）聚合酶链式反应（PCR） PCR技术在基因诊断中已得到广泛应用。在应用 中，PCR常与其它技术如分子杂交，限制酶酶谱分析， 单链构象多态性检测，限制性片段长度多态性分析， DNA序列测定等联合应用。 （三）单链构象多态性 单链构象多态性（single strand conformation
（四）敏感性
探针可用“放标”或“非放 诊断灵敏度高，标本只需 微量，DNApg水平即可。 因为表型改变往往出现较晚， 难以早期诊断 在表型改变之前，基因 结构或表达已发生改变， 故往往可以早期诊断。
（五）早期诊断
（六）基因诊断范围广 因为：①探针可为任何来源和种类，序列可为已知或未知， 目标可为特定基因或 特定基因组合，外源性或内源性基因，所 以适应性强，诊断范围广。 ②被检查基因是否处于活化状态并不重要，故可对分化阶 段表达特异性基因及其异常进行检测和诊断，这对肿瘤（如 CML）疗效及预后尤为重要。 ③在感染性疾病的诊断，能检查正在生长或潜伏病原体， 能明确既往感染或现行感染，对不易诊断（如产毒性E.coli）和 不能安全培养（如立克次体）进行基因诊断，扩大了实验室诊 断范围。
polymorphism,sscp）检测是一种基于单链DNA构象差 别来检测点突变的方法，常与PCR联合应用，称为 PCR—SSCP技术。
（四）限制酶酶谱分析 基因突变可能导致基因上某一限制酶位点的丢失
或其相对位臵发生改变，以此酶消化待测DNA和野生 型对照DNA，通过比较二者的酶切片段的长度、数量 上的差异就可判断待测DNA的突变情况。 （五）DNA序列测定

测出基因的突变。
7、甲基化特异性PCR技术
DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持
正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发 生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。
如在一般正常的细胞中，基因调控区CPG岛处于非
甲基化状态，而当细胞发生癌变后，这些区域往往呈 现甲基化状态。因此DNA甲基化研究是一热点。
或基因突变
2、采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析
（PCR－RFLP）
基因突变导致的基因碱基组成和顺序发生改变，会
在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有限制
性内切酶位点消失。因此，突变基因经相应的限制性内 切酶水解后，其电泳条带的数量和大小就会发生改变，
根据这些改变可以判断突变是否存在。即限制性片段长
2．基因诊断的特点：
（1）直接检测基因，属病因诊断，针对 性强； （2）特异性强、灵敏度高：由于基因诊 断采用核酸分子杂交、聚合酶链反应等 技术； （3）适用范围广：其应用的范围已从原 先局限的遗传性疾病扩大到感染性疾病、 肿瘤、心血管疾病等领域。
基因诊断的评价
• 特异性 • 灵敏度 • 重复性
DNA芯片技术原理
• 大规模集成的固相杂交 • 基本原理是核酸分子杂交，即依据 DNA双链碱基互补配对、变性和复性 的原理
以大量已知序列的寡核苷酸、
cDNA或基因片段作探针，检测 样品中哪些核酸序列与其互补， 然后通过定性、定量分析得出待 测样品的基因序列及表达的信息
第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略
人类疾病多种多样，致病原因不同，因此在基 因诊断上也有不同途径和策略。 1、对致病基因已经找到、发生机制清楚的疾病， 可以通过直接检测致病基因进行基因诊断。