血疟原虫MP厚血片检查法手工法-检验科临检室作业书

疟原虫镜检技术

血片制作与染色

一、血片制作

（一）所需器材

1、载玻片：玻片使用前应清洗。新玻片应先浸入有液态洗涤剂的清水中10~20分钟，然后用干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干，最后用干净、柔软的棉巾将玻片擦亮。用于特殊的目的时，最后可将玻片浸泡在95％酒精中5~10分钟，再将玻片擦干擦亮。已用过的玻片应先浸泡于洗涤剂溶液中1~2天，或浸泡于煮沸的5％肥皂水中1~2小时，再移到新配置的洗涤剂溶液中1~2小时，逐个擦去玻片上旧的血膜痕迹，用清水漂洗干净，再将玻片擦干擦亮。洗净的玻片每10~20张用白纸包好放入塑料袋内，保存于干燥环境中备用。

2、采血针：使用一次性釆血针。

3、玻片盒：为防止污染和苍蝇吸食血膜，新制作的血膜应放在玻片盒中，厚血膜放置时要保持水平，直到充分干燥。

4、75％酒精棉球：用于采血前后的消毒。

5、记号笔或铅笔：用于玻片上书写号码。

（二）采血部位及取血方法

采血部位以耳垂较为合适，也可在手指末端采血，婴儿可从拇趾或足跟取血。先用75％酒精棉球消毒取血部位后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1~2mm深，然后用左手大拇指、食指和右手中指协同挤出血滴。

（三）涂制血膜

取玻片2张，1张作载片，1张作推片（具有光滑边缘）。用右手拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液4~5μl，再用该端中部刮取血液1~1.5μl。将左下角的血滴涂于载片的中央偏右处，由里向外划圈涂成直径为0.8~1cm的圆形厚血膜（厚度以1个油镜视野内可见到5~10个白细胞为宜）。用干棉球抹净玻片角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜，制成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞，细胞之间互相接触而不相互重叠。每张载玻片上分别做1个薄血膜，1个厚血膜。

取干净玻片及推片各一张，用右手大拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液4～5μl（约火柴头大小），再用该端中部刮取血液1～1.5μl。将左下角的血滴涂于载片的中央偏右，由里向外划圈涂成直径为0.8～1cm的圆形厚血膜（厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5～10个白细胞为宜）。用干棉球抹净角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜。

疟原⾍检测⾎涂⽚镜检法

ICS11.020

C62

WS 中华⼈民共和国卫⽣⾏业标准

WS/T 569—2017

疟原⾍检测⾎涂⽚镜检法Microscopic examination of blood films for malaria parasites

2017-08-01发布2018-02-01实施

前⾔

本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。

本标准起草单位：海南省疾病预防控制中⼼、江苏省寄⽣⾍病防治研究所、中国疾病预防控制中⼼寄⽣⾍病预防控制所、云南省寄⽣⾍病防治所、海南省农垦总局医院。

本标准主要起草⼈：王善青、⾼琪、汤林华、杨恒林、郑彬、胡锡敏、王光泽、李⾬春、刘莹、欧阳范献。

疟原⾍检测⾎涂⽚镜检法1 范围

本标准规定了⾎涂⽚镜检法检测疟原⾍的技术规范。

本标准适⽤于各级疾病预防控制机构和医疗机构对疟原⾍的显微镜检测。2 术语和定义

下列术语和定义适⽤于本⽂件。2.1

疟原⾍Plasmodium spp

疟原⾍是⼀类单细胞、寄⽣性的真核动物，是疟疾（malaria）的病原体。寄⽣于⼈体的疟原⾍主要有恶性疟原⾍（Plasmodium falciparum）、间⽇疟原⾍（Plasmodium vivax）、三⽇疟原⾍（Plasmodium malariae）和卵形疟原⾍（Plasmodium ovale）等。2.2

⾎涂⽚ blood films

将⾎液涂制于载玻⽚上制成的涂⽚。供显微镜疟原⾍检查⽤的⾎涂⽚包括厚⾎膜涂⽚和薄⾎膜涂⽚两种。3 仪器和器材

3.1 ⽣物显微镜（100×油浸物镜、5×或10×⽬镜）。

3.2 计数器。

3.3 载玻⽚（⽆划痕⽆油污的洁净载玻⽚）。

3.4 推⽚。

3.5 ⾎⽚染⾊架。

3.6 ⾎⽚⼲燥架。

3.7 玻⽚盒。

3.8 染⾊盘和染⾊缸。

4 试剂和材料

4.1 吉⽒染⾊原液。

4.2 pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）。

4.3 甲醇（分析纯）。

4.4 ⾹柏油或专⽤浸油（折射率≥1.5）。

4.5 ⼆甲苯（分析纯）。

疟疾涂片的方法步骤

1. 推片：取一张玻片，用75%的酒精擦拭干净静置晾干。待晾干后，取适量不加抗凝剂的全血滴于之上。在玻片三分之一处滴厚血片，用推玻片尖均匀慢慢涂开约1cm大小的血膜，在同一玻片中间处滴加少许血用推玻片进行薄片推片，然后放于平地自然风干。一份血做两张涂片，特殊者可多涂几片。

2. 固定：待血薄片自然风干后，用吸管吸取少量甲醇滴于薄血片上自然风干进行固定，厚血片不用滴。

3. 染色：方法一：取两-三大滴吉氏染色液于小容器中，并用量筒量取10ml蒸馏水稀释，待甲醇和厚血片自然风干后，用稀释后的吉氏染色液进行血片染色30分钟。方法二：快速法。取0.5ml吉氏染色液于小容器中，并用量筒量取5ml蒸馏水配稀释，待甲醇和厚血片自然风干后，用稀释的吉氏染色液进行血片染色6-8分钟。（时间根据气温而定）

4. 冲洗：待染色时间到后，放平玻片用小流量的自来水自薄片尾部轻轻冲掉染色液，过程中尽量避免厚血片被冲走影响镜检。冲干净后，将涂片进行风干处理或者放入温箱中烘干，待干燥后，将涂片置于显微镜油镜下进行滴油镜检。

5. 保存：待镜检完毕后，将涂片及显微镜油镜头用二甲苯脱油处理。若涂片阳性，则需在标签纸上写好姓名、性别、年龄、疟疾类型、镜检日期贴在玻片头端，放入阳性涂片存放盒中保存。阴性则可丢入废弃桶中。

疟原虫血涂片制作作业指导书

1.目得

指导实验室人员制作血涂片，完成疟原虫检测工作

2.适用范围

适用于实验室检测人员

3.职责

疟原虫血涂片制作人员负责涂片编号及保存,

4、作业指导

4、1样本采集及要求

4、1、１采用抗凝管采血：或在采血管里加入抗凝剂，将采集血样加入并摇匀，备用

4、１、2指尖血、静脉全血（抗凝血)样本均可适用

４、2血涂片得制作：

４、2、１血膜种类与位置

薄血膜：占玻片得近1/２.将血液涂呈薄膜状，血细胞平辅在玻片上面

厚血膜:占玻片得1／６。血液涂成圆形，血量多

４、２、２厚血膜得制作用

推片得一角，刮取约4 ～ 5ul(火柴头大小)，使血滴与平置得载玻片接触,再由里向外旋转,转４~ 8圈直径0、8 ~ 1cm圆形厚血膜,血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率得要求.厚血膜厚度以油镜视野可见5 ～ １0个白细胞为宜。厚血膜血量：4～５ul微升，外形：圆形，直径0、８～１、0ｃm

4、2、3薄血膜制作

取洁净得载玻片2张,１张以左手拇指,食指夹持载玻片两端,用另一张边缘平滑得载玻片做推片，用推片一端边缘得中点取血约1～1、5uｌ得血量(小米粒大小），使血滴与平置得载玻片接触,并形成２5~30度夹角,待血液向两侧扩展宽约2cｍ时,均匀而迅速地轻轻向左推出(约2、５cm长)薄血膜血量：1～1、5ul位置：玻片1/2外形:薄度均匀、无痕、长度:２、0~2、5cｍ

4、２、４血膜编号:血膜编号： 血膜制成后，以防差错,待薄血膜干后用B2铅笔，在薄血膜得右上角或血膜底部,写上受检者得个人编号。

4、3血涂片固定及染色

４、３、1甲醇固定薄血膜

载玻片略向下倾斜，从一侧挤出甲醇，试管平推下划即可.甲醇不能触碰到厚血膜

4、３、2单张染色法

在量筒内加2ml缓冲液或ph７、0～7、2净水, 滴加吉氏原液4滴(每ｍl２滴),混匀,然后滴在已充分干躁得厚薄血膜上，染色３０mｉn。