疟原虫血片制作及染色51页PPT

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血片的染色 （一）染液的种类及染色原理
染液种类：目前所用的血片染色液，虽然名称 很多，但都是从罗门诺夫斯基氏创造的染液 变化过来的。总的可分为水溶液和酒精溶液 两大类，前者包括罗氏、西氏（Simon)、 J.S.B氏染液等，后者包括利氏 (Leishman)、瑞氏和吉氏染液（被国家推 荐使用）等。这些染液中的主要染剂都包含 美兰、伊红和由美兰氧化所成的天青，所以 称为多色性染剂。
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影响染色效果的因素

（4）染液的稀释浓度 染液的浓度高其着 色就快而深，从而疟原虫寄生红细胞的薛 氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度 过低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不 明显或消失。
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影响染色效果的因素

（5）染色时间 染色时间长染色效果好， 反之较差。室温高则着色快，染色时间可 略缩短，气温低可适当延长。因此染色时 间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和 气温而适当增减。
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薄血膜血量及涂片法

薄血膜 取洁净的载玻片2张， 1 张平置在桌上，以左手拇 指，食指夹持载玻片两端 （手指切勿接触玻片表面）， 用另一张边缘平滑（最好为 磨口边缘）的载玻片做推片， 用推片一端边缘的中点从取 血部分刮取约1~1.5微升的 血量（相当于 1/4火柴头大 小），使血滴与平置的载玻 片接触，并形成 25~35 度 夹角，待血液向两侧扩展约 2 厘米宽度时，均匀而迅速 地轻轻向左推出（约 2.5 厘 米长）且边缘带有“舌状” 的薄血膜。
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涂制厚、薄血膜的位置

通常是将厚、薄血膜涂在一张载玻片上。方法 是将载玻片分为 3 等分（留出标签或磨砂面位 置后的 3 等分）。厚血膜涂在载玻片靠近标签 或磨砂面方向的右1/3中央处，圆形、厚薄均 匀、边缘整齐。薄血膜涂在载玻片 1/2 至左 1/3的中部位置，舌状、厚薄均匀。

• 染色用水：为了使血膜着色较好，应用pH7.0～7.2水效果
最佳。中性的蒸馏水也可。
缓冲液配制
pH
1/15mol/L 磷酸氢二钠溶液
1/15mol/L 磷酸1
7.0
6.3
3.7
7.2
7.3
2.7
7.4
8.1
1.9
蒸馏水 （ml）
90
90
90
90
染色方法
• 少量血片染色：取吉氏染液1份，加入缓冲液或蒸馏水15 至20份，混合均匀后，滴在厚、薄血膜上，染色20~30分 钟，然后用缓冲液或蒸馏水将血片上的染液冲走，晾干待 检。
血膜的染色
• 染色液的制备：推荐使用吉氏染液。吉氏染剂不仅适用于 厚血膜和批量血膜的染色，而且效果稳定，染色时间和染 液浓度对染色结果影响较小，染色后的血膜保存时间较长， 同时吉氏染剂能长期保存而不变质。
• 吉氏染液配制：吉氏粉 5g，甲醇250ml，甘油250ml。将 吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，边加边磨， 至甘油加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加 入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶内，再次加甲醇，洗 后再倒入瓶中，至甲醇洗净研钵为止。塞紧瓶塞，充分摇 匀，室温内放置，每天用力摇动溶液5分钟，3天后即可使 用。
注意事项
• 染色效果的好坏与稀释用水的氢离子浓度 （pH）、染液的浓度、染色时温度的高低、 染色的时间长短、染液配制的时间长短等 都有密切的关系，因此，每批血片染色前 要进行试染，以取得更好的染色效果。
染色前血膜的保存
• 血膜制成后，立即将受检者号码写在玻片上，血膜朝下水平插入 标本盒内，让血膜自然干燥后才能染色。
• 血膜放置时间，夏天不宜超过48小时，冬天不宜超过72小时，否 则厚血膜会自然固定而不能溶血，影响镜检。

血膜制作（取血时间）
取血时机 现症病人一般可随时取血，疟疾普 查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期 疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。
血膜制作（取血时间）
间日疟
前驱期相当于肝内期疟原虫发育，因原虫密度太低， 镜检多为阴性。
发冷（寒战）期相当于红内期成熟裂殖体涨破 红细 胞期，镜检多为裂殖体和环状体。
血膜制作（涂片操作）
厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约4-
5微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与 平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转 ，转2~4圈，再回到圆心收起，涂成直径 0.8~1cm大小圆形厚血膜。水平放置，务必使 血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检 出率的要求。
血膜制作（涂片操作）
标本片
疟疾调查时，每张玻片
可涂制2~3人血膜。
发热病人血片
厚、薄血膜的位置
每张载玻片上可做1个薄血膜和1个厚血膜，如图
2.5cm
各种不同的疟疾血片涂制法：
标准血片
门诊发热病人血片 居民普查血片
血膜制作（涂片操作）
血膜编号 血膜制成后，立即用特种蜡笔或 水笔于玻片面上写上受检者的号码，以防 差错，待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中 写上血片种类的代号和受检者的个人编号， 依次顺序插入标本盒内。
将推玻片向1的方向稍抽回，当血液充满推 玻片适当宽度（约2cm）后，以一定均匀的 速度向2的方向滑动（约2.5cm）。
血涂片质量评价：Βιβλιοθήκη 血膜均匀、厚薄度合适、无空泡、无划痕 薄血膜头体尾位置和形状好、无停顿起伏、
两侧留出空间
注意：血滴大，速度快、角度大 血膜厚
血滴小，速度慢、角度小 血膜薄
薄血膜
取洁净的载玻片2张，1张以左手拇指，食指夹持 载玻片两端（手指切勿接触玻片表面），用另1张 边缘平滑（最好为磨口边缘）的载玻片做推片， 用推片一端边缘的中点从取血部分取约1微升的血 量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载 玻片接触，并形成25~30度夹角，待血液向两侧 扩展约2cm长度时，均匀而迅速地轻轻向左推出 （约2.5cm长）。

血片的染色
第二步：染色用水和冲洗用水配制
常用中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水； 用pH7.0～pH7.2的缓冲液。
血片的染色
第三步：染色

薄血膜经甲醇固定干燥后， 将血片平放

用PH7.0-7.2的磷酸缓冲液 (PBS)或蒸馏水将吉氏原液 稀释；
染色20-30分钟，晾干镜检。

血片的染色
久，颜色偏酸；
染色时间 ：染色时间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和气温而适当增减。 冲洗方法：染色后不要直接将染液倒掉，沿玻片及染缸边缘加水使染液表面 益出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒粘污血膜。
染色质量影响因素
染色稀释用水: PH7.0-7.2清洁水。
用水过酸，可致感 染的RBC上的点彩 染不出来； 用水过碱，则使薄 血膜上的RBC染成 灰蓝色，致使R的 胞浆难以辨论。
厚血膜溶血染色 放臵多时未染色的血 片（2天以上，薄片已 用甲醇固定），在染 色之前，须在厚血膜 上用清水进行溶血， 待血膜全部溶解后倒 掉，用吉氏染液染色, 清水漂洗干净,晾干。
血片的染色
如果血片偏红,说明
标 准
偏 碱
血片制作影响因素
载玻片必须清洁无油污，理想的薄血膜是一层血细胞均匀 分布不重叠、无裂缝、无皱折和空泡，血膜末端呈舌状； 厚血膜厚度以一个油镜视野内可见5-10个白细胞为宜； 血片制作场所要保持清洁，以免尘埃沾污血膜，防止苍蝇 等舔食血膜； 制成的血片在未干前不能倾斜放臵，待其自然干燥，不要 加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果．
血片制作
第二步：患者信息的核实
首先要核对患者的姓名、年龄和住址。
非常重要
血片制作
第三步：血样的采集 部位：指尖、耳垂

染色时间 温度高，着色快，染色时间短； 温度低，着色慢，染色时间适当延长。
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影响染色效果的因素
稀释和冲洗用水PH值 稀释和冲洗用水PH 偏低，染色偏红；PH偏高，染色偏蓝。
水溶液：罗氏（Romanowsky）染液、西 氏（Simon)、J.S.B氏染液、费氏(Field) 等；
醇溶液：吉氏（Giemsa）染液、瑞氏 （Wright）染液、利氏（Leishman）等。
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试剂
染色原理 伊红是酸性水溶性钠盐，美兰
是碱性水溶性盐酸盐，当它们各自溶化
水中时，就离解为带阳电和阴电的离子。
●一般患者发作数小时至十小时内，可见 环状体,12～36小时发育至滋养体，36 ～ 48小时可见裂殖体，发作二次可见配子体。
●恶性疟原虫裂体生殖在内脏毛细血管内 进行，发作前末稍血液中不易查到。较理 想的取血时间是在发作后20小时左右，初 发患者退热后常查不到原虫。
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采血部位和方法
通常耳垂取血，先 用75%酒精棉球消 毒取血部位，待酒 精干后，用左手拇 指和食指紧捏耳垂 上方，右手持消毒 针迅速刺入皮肤， 不宜过深或过浅。 然后用右手中指轻 轻挤压出血。
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厚血膜用右手大拇指和食 指夹持推片两侧中部， 用推片左下角从取血部 位刮取约4～5μl血，使 血滴与载玻片接触再由 里向外一个方向旋转2~4 圈，涂成直径0.8~1㎝圆 形厚血膜。
薄血膜用推片中部取血 1~1.5μl，将推片与载玻 片25~35度角接触，当血 液在两侧扩展至约2 ㎝宽
时，迅速向前推成长2.5
伊红主要离解为酸性的阳离子，在遇到
碱性的蛋白质（如血红蛋白、嗜伊红白
血球颗粒等）可结合成不易溶于水的沉
淀物染成红色。美兰主要离解为碱性的

血片的制作（材料准备）
1.载玻片：新玻片浸入有液态洗涤剂的 清水中10-20分钟，干净棉巾逐个擦 拭，再用清水冲洗干净，晾干备用。
2. 采血针：一次性 3. 玻片盒：防止污染和昆虫吸食血膜 4. 75%酒精棉球：采血前后消毒 5. 记号笔：玻片上书写号码
血片的制作（厚、薄血膜）
用于检查疟原虫的血涂片有两种： 一种是将血液涂成薄膜状，称薄血膜； 一种是血液涂成圆盘状，称厚血膜。 最好一张玻片上同时制作厚、薄两种血膜。
D. 冲洗染液时，水流轻缓，勿冲走厚血膜。
疟疾检测的注意事项
• 1.同一个病人的血涂片样本要大于等于5张。 • 2.标本一定要做好标记，上报结果时，一定
要把观察到疟疾病原虫的血涂片标本一起 交上来。
• 3.标本染色时，不要一次把所有标本全部染
完，分批次染，找到最好的血涂片进行观 察。
血膜染色前的处理
• 固定薄血膜 血片干燥后，用吸有甲醇的
吸管在薄血膜表面轻轻涂抹，自然干燥。 注意固定时甲醇不要接触厚血膜，否则会 影响厚血膜的溶血。
• 溶解厚血膜 血片干燥后，用滴管滴水于
厚血膜上，待血膜呈灰白色时，将水倒去， 晾干。（吉姆萨染色：直接）
血膜制作注意事项
1. 清洗玻片，且勿碰撞、磨损 2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内 3. 血膜应自然干燥 ，要充分干燥。
吉氏染液的染色方法
血片染色： 取蒸馏水或缓冲液1ml加入吉氏原液1滴，
混合均匀后涂在厚、薄血膜上，染色30分 钟左右，然后用清水轻轻将载玻片上的染 液冲洗干净，晾干镜检。
血片制作注意事项
A. 使用前载玻片一定要清洁，否则会影 响血片制作和镜检结果。 B. 厚血膜干燥时勿加热，加热会使原虫 变形，影响镜检结果。 C. 固定薄血膜时勿将甲醇触碰到厚血膜。