疟原虫血涂片制作作业指导书

疟原虫镜检技术操作规范疟原虫镜检是诊断疟疾、确定虫种及发现传染源的重要手段和方法，具有严格的操作程序和技术要求，为了统一方法、规范程序、提高血检质量，特制定本操作规范。

一、血片制作（一）所需器材载玻片玻片3张（1张作载玻片，1张作推片，1张作采血后滴于玻片备血用）采血针采用一次性采血针。

玻片盒存放50或100片玻片的木质或塑料盒。

皮肤消毒液、棉签或酒精棉球75%的酒精、安尔碘、碘伏等皮肤表面消毒剂。

记号笔用于玻片上书写血检病人基本信息。

（二）操作步骤1、载玻片基本信息登记取1张载玻片，首先用目测法将载玻片从右（磨砂处为右）到左等分成6格，接着用记号笔在第1、2格即（磨砂处）写下血检病人基本信息：编号、姓名、制片日期结果（镜检结束后补写）。

载玻片上信息应与血检登记表中的项目对应。

如图12、采血采血部位为手指末端或耳垂，婴儿可从拇趾或足跟取血。

用消毒剂消毒取血部位皮肤后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1～2mm 深，约挤出1-2滴血，滴于玻片上（以备涂制厚薄血膜用）。

3、涂制血膜用推片的左下角刮取玻片上的血液4～5μl，涂于载玻片的第三格（靠近磨砂侧），由里向外一个方向旋转2～4圈，涂成直径为0.8～1.2cm的圆形厚血膜；再用该角沾取血液1～1.5μl血置于载玻片的中心点即（第四格前缘中点）；接着用干棉球或卫生纸擦净推片角上的血渍；最后用推片的下缘置载玻片的中心点（1～1.5μl血液处），当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速推成舌状薄血膜，即（薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部）。

如（图1）、（图2）疟原虫镜检涂制血膜方法示意图2薄血膜厚度应以红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳，（直观透过玻片能清晰看到报纸上的字）；厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5～10个白细胞为宜。

二、固定（一）所需器材1、甲醇2、器具玻璃棒、吸管（二）操作步骤薄血膜固定薄血膜晾干后，用玻璃棒沾取或用吸管吸取少量甲醇平铺于薄血膜上，起固定薄血膜作用，（注意不能固定厚血膜）。

疟原虫血片的制作工需要材料1 .采血器材：75%酒精棉球、一次性采血针、玻片、推片、铅笔、干净的绸布或化纤布。

2 .染色材料：①姬氏原液②.蒸储水或纯净水：①稀释姬氏原液②染色时冲洗染液③固定剂：①用甲醇或无水乙醇（乙醇含量达99.9%）,固定薄血膜②用无水乙醇擦洗油镜头。

④脱油剂：无水乙醍或二甲苯：镜检后的血片脱镜油。

油镜头脱油可用无水乙醍：无水乙醇的7:3混合液擦拭。

⑤擦镜纸。

二、采血前准备：1.玻片准备⑴我们现在用的玻片都是除去油渍的脱脂玻片，使用前可用绸布擦去玻片上纤维和浮灰，即可使用。

⑵新的尚未脱油脂的玻片：用洗衣粉水洗净后，一一浸泡于95%的酒精中约一周时间，然后一一取由，用软而洁净并没有棉花纤维的细布擦干，擦亮，收藏好。

⑶已用过的旧玻片：先消毒后用洗涤剂清洗，去除污渍，再一一浸泡于95%的酒精中约一周时间，然后一一取由，用软而洁净并没有棉花纤维的细布擦干，擦亮，收藏好2.玻片编号：在玻片的磨砂端用铅笔进行编号。

玻片编号、检验报告单号和登记号应一致，并具有唯一性。

3.采血时间：⑴间日疟、三日疟原虫患者可在发作的任何时间进行采血，但由于患者刚发冷发热以后，大部分是在环状体期，故这一时期区别疟原虫种类是不容易的。

所以在发作后的6〜8小时内采血为最佳，这时环状体以滋养发育成晚期滋养体，较易识别。

⑵。

恶性疟原虫；从理论上讲，因为恶性疟原虫的裂体生殖是在内脏的毛细血管内进行的，所以在发作之前，患者的末梢血液中不易查到，但实际情况不尽如此，一般在受感染者的末梢血液中，随时能见到少量的恶性疟原虫的环状滋养体；虽然如此,较理想的采血时间，是在发作后的20小时左右，因为这个时候，环状体虽已发育至最高峰，但尚未回到内脏毛细血管中去进行裂体生殖。

环状体的数量和构造。

有助于疟原虫种类的鉴别，恶性疟原虫的配子体很容易识别，但在初发时，一般需要在发作7〜10日后才能在末梢血液在由现，应当注意。

4.采血的部位和方法；部位：以耳垂采血为主。

检查疟原虫的血涂片制作与染色基本原理：疟原虫寄生在红细胞内，经染色后可对疟原虫形态做出鉴定。

材料准备：75%酒精、采血针、推片、载玻片、吉氏染液、甲醇、滴管、刻度管.(1)清洁载玻片的方法：将载玻片用清水清洗干净后晾干，再在稀释清洁液中浸泡1~2天，取出后用水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗，烘干，经95%酒精浸泡后，擦干。

清洗过的玻片用干净无油的纸包好备用。

(2)吉氏染液配制：○1原液配制，吉氏染剂粉1g，甲醇50ml，中性甘油50ml。

将吉氏染粉置乳钵中，加少量甘油充分研磨（30min以上），继续边加甘油边研磨，至加完为止。

然后转入烧瓶内，置55~60恒温水浴中，充分震摇使溶解（约2h）,冷却后加入甲醇，储于棕色瓶中，塞紧瓶塞，充分摇匀，1~3周后过滤，即为原液，配制时要研磨充分，不可混入水，配好后要密封，放置越久染色性能越好；○2工作液临时配制：将吉氏原液用pH 6.8~7.2的PBS作1:15~1:20稀释混匀即可。

操作方法：采用疟原虫感染小鼠做血涂片并染色.(但以下采血以人为例)（1）采血:1时间据各种疟原虫在人外周血中出现的规律，间日虐和三日疟患者可在发作后任何时间取血，但以发作后10h 以内最佳，恶性疟原应在发作开始后不久做血检，患者刚开始发作时原虫密度较低可能检测不到，所以应在第二次发作时再做一次以免漏诊：2部位成人可在耳垂或指尖，婴儿宜在脚跟或者大拇指：3方法先用75%酒精给皮肤消毒，右手持一次性无菌采血针迅速刺入皮肤2mm，轻轻挤压周围皮肤，弃去第一滴血，再取1滴作薄血膜，2滴作厚血膜。

薄血膜取血量少，涂面大，原虫分散，但形态清晰，易作虫种鉴别：厚血膜血量多，RBC集中，在原虫数量较少时便于发现，但因制作时细胞相互挤压堆积，原虫形态难认。

（2）涂片：1薄血膜制作取1滴置于洁净载玻片上，用1张磨口边缘作推片。

推片时用力要均匀，一次推成，保证血膜应呈舌形，RBC分布均匀。

2厚血膜制作用推片一角取血2滴，治愈薄血膜片右方用推片角由里向外顺一个方向旋转，使血滴形成直径约1cm的圆形血膜。