疟原虫血涂片制作作业指导书

疟原虫镜检技术操作规范疟原虫镜检是诊断疟疾、确定虫种及发现传染源的重要手段和方法，具有严格的操作程序和技术要求，为了统一方法、规范程序、提高血检质量，特制定本操作规范。

一、血片制作（一）所需器材载玻片玻片3张（1张作载玻片，1张作推片，1张作采血后滴于玻片备血用）采血针采用一次性采血针。

玻片盒存放50或100片玻片的木质或塑料盒。

皮肤消毒液、棉签或酒精棉球75%的酒精、安尔碘、碘伏等皮肤表面消毒剂。

记号笔用于玻片上书写血检病人基本信息。

（二）操作步骤1、载玻片基本信息登记取1张载玻片，首先用目测法将载玻片从右（磨砂处为右）到左等分成6格，接着用记号笔在第1、2格即（磨砂处）写下血检病人基本信息：编号、姓名、制片日期结果（镜检结束后补写）。

载玻片上信息应与血检登记表中的项目对应。

如图12、采血采血部位为手指末端或耳垂，婴儿可从拇趾或足跟取血。

用消毒剂消毒取血部位皮肤后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1～2mm 深，约挤出1-2滴血，滴于玻片上（以备涂制厚薄血膜用）。

3、涂制血膜用推片的左下角刮取玻片上的血液4～5μl，涂于载玻片的第三格（靠近磨砂侧），由里向外一个方向旋转2～4圈，涂成直径为0.8～1.2cm的圆形厚血膜；再用该角沾取血液1～1.5μl血置于载玻片的中心点即（第四格前缘中点）；接着用干棉球或卫生纸擦净推片角上的血渍；最后用推片的下缘置载玻片的中心点（1～1.5μl血液处），当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速推成舌状薄血膜，即（薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部）。

如（图1）、（图2）疟原虫镜检涂制血膜方法示意图2薄血膜厚度应以红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳，（直观透过玻片能清晰看到报纸上的字）；厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5～10个白细胞为宜。

二、固定（一）所需器材1、甲醇2、器具玻璃棒、吸管（二）操作步骤薄血膜固定薄血膜晾干后，用玻璃棒沾取或用吸管吸取少量甲醇平铺于薄血膜上，起固定薄血膜作用，（注意不能固定厚血膜）。

疟原虫血片的制作工需要材料1 .采血器材：75%酒精棉球、一次性采血针、玻片、推片、铅笔、干净的绸布或化纤布。

2 .染色材料：①姬氏原液②.蒸储水或纯净水：①稀释姬氏原液②染色时冲洗染液③固定剂：①用甲醇或无水乙醇（乙醇含量达99.9%）,固定薄血膜②用无水乙醇擦洗油镜头。

④脱油剂：无水乙醍或二甲苯：镜检后的血片脱镜油。

油镜头脱油可用无水乙醍：无水乙醇的7:3混合液擦拭。

⑤擦镜纸。

二、采血前准备：1.玻片准备⑴我们现在用的玻片都是除去油渍的脱脂玻片，使用前可用绸布擦去玻片上纤维和浮灰，即可使用。

⑵新的尚未脱油脂的玻片：用洗衣粉水洗净后，一一浸泡于95%的酒精中约一周时间，然后一一取由，用软而洁净并没有棉花纤维的细布擦干，擦亮，收藏好。

⑶已用过的旧玻片：先消毒后用洗涤剂清洗，去除污渍，再一一浸泡于95%的酒精中约一周时间，然后一一取由，用软而洁净并没有棉花纤维的细布擦干，擦亮，收藏好2.玻片编号：在玻片的磨砂端用铅笔进行编号。

玻片编号、检验报告单号和登记号应一致，并具有唯一性。

3.采血时间：⑴间日疟、三日疟原虫患者可在发作的任何时间进行采血，但由于患者刚发冷发热以后，大部分是在环状体期，故这一时期区别疟原虫种类是不容易的。

所以在发作后的6〜8小时内采血为最佳，这时环状体以滋养发育成晚期滋养体，较易识别。

⑵。

恶性疟原虫；从理论上讲，因为恶性疟原虫的裂体生殖是在内脏的毛细血管内进行的，所以在发作之前，患者的末梢血液中不易查到，但实际情况不尽如此，一般在受感染者的末梢血液中，随时能见到少量的恶性疟原虫的环状滋养体；虽然如此,较理想的采血时间，是在发作后的20小时左右，因为这个时候，环状体虽已发育至最高峰，但尚未回到内脏毛细血管中去进行裂体生殖。

环状体的数量和构造。

有助于疟原虫种类的鉴别，恶性疟原虫的配子体很容易识别，但在初发时，一般需要在发作7〜10日后才能在末梢血液在由现，应当注意。

4.采血的部位和方法；部位：以耳垂采血为主。

检查疟原虫的血涂片制作与染色基本原理：疟原虫寄生在红细胞内，经染色后可对疟原虫形态做出鉴定。

材料准备：75%酒精、采血针、推片、载玻片、吉氏染液、甲醇、滴管、刻度管.(1)清洁载玻片的方法：将载玻片用清水清洗干净后晾干，再在稀释清洁液中浸泡1~2天，取出后用水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗，烘干，经95%酒精浸泡后，擦干。

清洗过的玻片用干净无油的纸包好备用。

(2)吉氏染液配制：○1原液配制，吉氏染剂粉1g，甲醇50ml，中性甘油50ml。

将吉氏染粉置乳钵中，加少量甘油充分研磨（30min以上），继续边加甘油边研磨，至加完为止。

然后转入烧瓶内，置55~60恒温水浴中，充分震摇使溶解（约2h）,冷却后加入甲醇，储于棕色瓶中，塞紧瓶塞，充分摇匀，1~3周后过滤，即为原液，配制时要研磨充分，不可混入水，配好后要密封，放置越久染色性能越好；○2工作液临时配制：将吉氏原液用pH 6.8~7.2的PBS作1:15~1:20稀释混匀即可。

操作方法：采用疟原虫感染小鼠做血涂片并染色.(但以下采血以人为例)（1）采血:1时间据各种疟原虫在人外周血中出现的规律，间日虐和三日疟患者可在发作后任何时间取血，但以发作后10h 以内最佳，恶性疟原应在发作开始后不久做血检，患者刚开始发作时原虫密度较低可能检测不到，所以应在第二次发作时再做一次以免漏诊：2部位成人可在耳垂或指尖，婴儿宜在脚跟或者大拇指：3方法先用75%酒精给皮肤消毒，右手持一次性无菌采血针迅速刺入皮肤2mm，轻轻挤压周围皮肤，弃去第一滴血，再取1滴作薄血膜，2滴作厚血膜。

薄血膜取血量少，涂面大，原虫分散，但形态清晰，易作虫种鉴别：厚血膜血量多，RBC集中，在原虫数量较少时便于发现，但因制作时细胞相互挤压堆积，原虫形态难认。

（2）涂片：1薄血膜制作取1滴置于洁净载玻片上，用1张磨口边缘作推片。

推片时用力要均匀，一次推成，保证血膜应呈舌形，RBC分布均匀。

2厚血膜制作用推片一角取血2滴，治愈薄血膜片右方用推片角由里向外顺一个方向旋转，使血滴形成直径约1cm的圆形血膜。

疟原虫镜检血片制作与染色操作流程
1．填写登记表在“疟疾发热病人血检登记本”上为患者编号并登记其相关信息。

2．清洁玻片
3．玻片编号用目测法将玻片分成六等分，左侧第一和等二等份用于编号。

同一患者玻片上号码应与登记本上一致。

4．采血
5．涂制厚厚片
（1）血量: 4～5微升
（2）位置：玻片第三等份中央的位置
（3）血膜大小：0.8～1.0厘米
6．涂制薄血膜
（1）血量: 1～1.5微升
（2）位置：玻片第四至第六等份的位置。

涂制薄血膜的血应滴在玻片中央稍偏右的位置
（3）血膜大小：2.0厘米(宽)×2.5厘米(长)
7．吉氏染色液配制
（1）2%的吉氏染色液配制方法98毫升蒸馏水加入2毫升吉氏原液，混匀后即为2%的吉氏染色液。

也可用1支试管，按1毫升蒸馏水加入1滴吉氏原液的比例稀释染液，混匀后用于染色。

（2）注意事项2%的吉氏染色液必须现配现用。

8．吉氏染色方法
（1）待厚血膜干燥
（2）甲醇固定薄血膜
（3）待甲醇挥发干净
（4）滴2%的吉氏染液覆盖厚薄血膜，染色30分钟。

（5）取出染好的血片，连同染液在清水中轻轻漂洗一遍，洗去表面吸附的杂质。

（6）放置干燥处晾干。

血膜面朝上，注意不要放反了。

疟原虫血涂片制作作业指导书1.目的指导实验室人员制作血涂片，完成疟原虫检测工作2.适用范围适用于实验室检测人员3.职责疟原虫血涂片制作人员负责涂片编号及保存，4.作业指导4.1样本采集及要求4.1.1采用抗凝管采血：或在采血管里加入抗凝剂，将采集血样加入并摇匀，备用4.1.2指尖血、静脉全血（抗凝血）样本均可适用4.2血涂片的制作：4.2.1血膜种类和位置薄血膜：占玻片的近1/2。

将血液涂呈薄膜状，血细胞平辅在玻片上面厚血膜：占玻片的1/6。

血液涂成圆形，血量多4.2.2厚血膜的制作用推片的一角，刮取约4 ~ 5ul(火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外旋转，转4~ 8圈直径0.8 ~ 1cm圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。

厚血膜厚度以油镜视野可见5 ~ 10个白细胞为宜。

厚血膜血量：4~5ul微升，外形：圆形，直径0.8~1.0cm4.2.3薄血膜制作取洁净的载玻片2张，1张以左手拇指，食指夹持载玻片两端，用另一张边缘平滑的载玻片做推片，用推片一端边缘的中点取血约1~1.5ul的血量（小米粒大小），使血滴与平置的载玻片接触，并形成25~30度夹角，待血液向两侧扩展宽约2cm时，均匀而迅速地轻轻向左推出（约2.5cm长）薄血膜血量：1~1.5ul位置：玻片1/2外形：薄度均匀、无痕、长度：2.0~2.5cm4.2.4血膜编号：血膜编号：血膜制成后，以防差错，待薄血膜干后用B2铅笔，在薄血膜的右上角或血膜底部，写上受检者的个人编号。

4.3血涂片固定及染色4.3.1甲醇固定薄血膜载玻片略向下倾斜，从一侧挤出甲醇，试管平推下划即可。

甲醇不能触碰到厚血膜4.3.2单张染色法在量筒内加2ml缓冲液或ph7.0~7.2净水，滴加吉氏原液4滴(每ml2滴），混匀，然后滴在已充分干躁的厚薄血膜上，染色30min。

1张玻片需2ml水，2滴／ml染液，染色25-30min4.3.3染色效果血膜蓝中带紫色，如果血膜颜色偏红色, 说明染色偏酸性；血膜偏蓝色, 则为偏碱性。

一、实验目的1. 掌握疟原虫涂片制作的方法。

2. 熟悉疟原虫形态学特征，学会识别疟原虫种类。

3. 了解疟疾的实验室诊断方法。

二、实验原理疟疾是由疟原虫引起的一种严重传染病，主要通过按蚊叮咬传播。

疟原虫在人体内寄生，经过多个发育阶段，最终在红细胞内繁殖。

血涂片检查是诊断疟疾的重要方法之一，通过显微镜观察血涂片中的疟原虫形态，可以确定疟原虫的种类，为临床诊断和治疗提供依据。

三、实验材料1. 试剂：抗凝剂EDTA-Na2/K2、吉姆萨染液、蒸馏水。

2. 仪器：显微镜、载玻片、盖玻片、移液器、酒精灯、吸管等。

3. 样本：疑似疟疾患者的血液样本。

四、实验步骤1. 采集血液样本：使用EDTA-Na2/K2抗凝管采集患者外周静脉血2-5mL。

2. 制作血涂片：a. 将血液样本滴在载玻片中央，形成直径约1cm的圆形。

b. 用另一张载玻片边缘轻刮血液，制成薄而均匀的血膜。

c. 待血膜干燥后，用盖玻片覆盖。

3. 染色：a. 将载玻片放入吉姆萨染液中，浸泡5-10分钟。

b. 用蒸馏水冲洗载玻片，去除多余染液。

c. 待载玻片干燥后，用显微镜观察。

4. 观察与鉴定：a. 使用低倍镜观察血涂片，寻找疟原虫。

b. 使用高倍镜观察疟原虫的形态学特征，如细胞核、滋养体、裂殖体等。

c. 根据疟原虫的形态学特征，确定疟原虫的种类。

五、实验结果1. 在血涂片中观察到疟原虫，经鉴定为恶性疟原虫。

2. 疟原虫的形态学特征如下：a. 细胞核呈红色，圆形或椭圆形。

b. 滋养体呈圆形或椭圆形，大小约为10-15μm。

c. 裂殖体呈椭圆形，大小约为20-30μm。

六、实验讨论1. 本实验成功制作了疟原虫血涂片，并成功鉴定出恶性疟原虫，验证了实验原理和步骤的正确性。

2. 在实验过程中，需要注意以下几点：a. 采血时，应选择患者发作期进行，此时疟原虫数量较多，易于观察。

b. 制作血涂片时，应确保血膜薄而均匀，避免过厚或过薄。

c. 染色时，应控制好染色时间，避免染色过深或过浅。

疟疾血膜制作及染色技术一、血片的制作1.材料准备载玻片：新玻片浸入有液态洗涤剂的清水中10-20分钟，干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干备用。

1. 2. 采血针：一次性 . 玻片盒：防止污染和昆虫吸食血膜 1. 4. 75%酒精棉球：采血前后消毒 . 记号笔：玻片上书写号码2.血片的制作（厚、薄血膜）用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂成薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘状，称厚血膜。

最好一张玻片上同时制作厚、薄两种血膜。

薄血膜涂片薄血膜取洁净的载玻片1张，左手持载玻片平置,右手持推片，推片一端边缘的中点刮取血液~微升（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片中线接触，待血液向两侧扩展约2cm宽时，以25°～35°夹角均匀而迅速地向左推成舌状薄血膜（约长）。

厚度以薄血膜上的红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳。

厚血膜涂片用推片的一角刮取4~5微升血量（相当于火柴头大小），使血滴涂于载玻片的中央偏右处，由里向外一个方向旋转2圈，涂成直径~的圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求（厚度以1个油镜视野内可见5~10个白细胞为宜）。

血膜位置通常将厚、薄血膜涂在一张载玻片上。

方法是将载片分为6等分，第1、2格备贴标签及编用；厚血膜涂在第3格中央；薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。

血片的制作编号血膜制成后，立即在玻片面上写上受检者的号码（姓名）、单位(地址)、制片日期、以防差错；待血膜干后依次按顺序插入标本盒内。

血膜制作注意事项1. 清洗玻片，且勿碰撞、磨损2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内3. 血膜应自然干燥，要充分干燥。

二、血片染色：（吉氏染液的染色方法）1. 血膜染色前的处理固定薄血膜血片干燥后，用吸有甲醇的吸管在薄血膜表面轻轻涂抹，自然干燥。

注意固定时甲醇不要接触厚血膜，否则会影响厚血膜的溶血。

溶解厚血膜血片干燥后，用滴管滴水于厚血膜上，待血膜呈灰白色时，将水倒去，晾干。