疟原虫血片制作染色

疟原虫镜检技术操作规范疟原虫镜检是诊断疟疾、确定虫种及发现传染源的重要手段和方法，具有严格的操作程序和技术要求，为了统一方法、规范程序、提高血检质量，特制定本操作规范。

一、血片制作（一）所需器材载玻片玻片3张（1张作载玻片，1张作推片，1张作采血后滴于玻片备血用）采血针采用一次性采血针。

玻片盒存放50或100片玻片的木质或塑料盒。

皮肤消毒液、棉签或酒精棉球75%的酒精、安尔碘、碘伏等皮肤表面消毒剂。

记号笔用于玻片上书写血检病人基本信息。

（二）操作步骤1、载玻片基本信息登记取1张载玻片，首先用目测法将载玻片从右（磨砂处为右）到左等分成6格，接着用记号笔在第1、2格即（磨砂处）写下血检病人基本信息：编号、姓名、制片日期结果（镜检结束后补写）。

载玻片上信息应与血检登记表中的项目对应。

如图12、采血采血部位为手指末端或耳垂，婴儿可从拇趾或足跟取血。

用消毒剂消毒取血部位皮肤后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1～2mm 深，约挤出1-2滴血，滴于玻片上（以备涂制厚薄血膜用）。

3、涂制血膜用推片的左下角刮取玻片上的血液4～5μl，涂于载玻片的第三格（靠近磨砂侧），由里向外一个方向旋转2～4圈，涂成直径为0.8～1.2cm的圆形厚血膜；再用该角沾取血液1～1.5μl血置于载玻片的中心点即（第四格前缘中点）；接着用干棉球或卫生纸擦净推片角上的血渍；最后用推片的下缘置载玻片的中心点（1～1.5μl血液处），当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速推成舌状薄血膜，即（薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部）。

如（图1）、（图2）疟原虫镜检涂制血膜方法示意图2薄血膜厚度应以红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳，（直观透过玻片能清晰看到报纸上的字）；厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5～10个白细胞为宜。

二、固定（一）所需器材1、甲醇2、器具玻璃棒、吸管（二）操作步骤薄血膜固定薄血膜晾干后，用玻璃棒沾取或用吸管吸取少量甲醇平铺于薄血膜上，起固定薄血膜作用，（注意不能固定厚血膜）。

血疟原虫检查标准操作程序1 检验目的应用瑞氏-吉姆萨染色法对制备好的血片进行染色后在显微镜下观察，判断是否感染疟原虫。

2 检测原理瑞氏染料由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成。

将适量伊红、美蓝溶解在甲醇中，即为瑞氏染料。

瑞氏染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用。

各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。

核与酸性染料伊红结合,染成粉红色；胞质与碱性染料美蓝或天青结合，染蓝色;胞质中含有血红蛋日白消化分解后的产物-疟色素,疟色素不着色，为棕黄色或棕褐色。

3 性能特征无4 标本要求（包括病人准备、容器、样本类型等)4.1 病人准备:间日疟及三日患者应在发作后数小时至10余小时采血，此时，早期滋养体已发育成易于鉴别形态的晚期滋养体；恶性疟患者，应在发作后20小时左右采血。

4.2 标本类型:静脉全血4.3 标本容器: EDTA-K2抗凝管4.4 标本存放:4.4.1未检测标本的存放:放在工作台标本架。

4.4.2已拉测标本的存放:检毕标本排列于样本架,置检毕标本台，由卫生员统一转入2-8℃标本冷藏库保存7天，血片用乙酸乙酯脱油保存于存片盒。

4.5 标本运输:室温条件下运输。

4.6 标本拒收标准:参照《用户手册》4.7 检测时限: 1小时。

5 仪器和试剂5.1 试剂名称:瑞姬氏染色液5.1.1瑞姬氏染色液:瑞氏染料0.5g、姬氏染料0.5g，加入500ml甲醇中，混匀溶解后备用。

5.1.2pH6.5磷酸盐缓沖液:磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钠0.2g,加入100ml蒸馏水中溶解。

5.2 试剂来源:珠海贝索。

5.3 仪器:普通光学显微镜。

6 环境和安全:6.1 检测环境:应符合《显微镜标准操作程序》相关要求。

6.2 设备的安全操作:详见《显微镜标准操作程序》。

6.3 生物安全:6.3.1血液标本的运送必须保证运送过程中的生物安全，防止溢出。

血液标本溢出后，应该立即对污染的环境和设备进行消毒处理。

2011年发热患者血检疟原虫血片制作及染色过程回顾性分析摘要为了提高疟原虫检出率，选取本院发热患者末梢血制成厚薄血片进行染色镜检，通过对血片的制作加以标准化，染液严格按标准配置，并对染色各步骤严格控制，做出的血片染色良好，背景清晰，極大方便了疟原虫检查，提高了疟原虫检查的工作效率。

关键词疟原虫；血片；染色疟疾是由疟原虫寄生于人体、经蚊传播的寄生虫病，临床表现以周期性发冷、发热、出汗和脾大、贫血为特征。

为按期实现本县消除疟疾任务目标，落实好各项防治措施，根据《山东省全球基金疟疾项目两年工作计划》和《山东省消除疟疾实施方案》的要求，结合本县实际防控，制定了具体的技术方案，对全县各医疗卫生单位的检验人员进行了全员培训，现将血片制作及染色过程中的注意事项总结如下。

1 血片制作之前，一定要将玻片清洗干净，玻片的清洁与否影响血片的质量。

新载玻片常有游离碱质，应用清洗液或10%盐酸或铬酸洗液浸泡24 h，然后再彻底清洗，晾干，最后用干净柔软的棉巾将玻片擦净晾干[1]。

已用过的载玻片应先浸泡于洗涤剂溶液中1～2 d，或浸泡于煮沸的5%肥皂水1 h左右，再移到新配置的洗涤剂溶液中1～2 h，再用热水将肥皂和血膜洗去，用清水反复冲洗，然后擦干或烤干备用[2]。

2 将血片分为6等份，第1、2格贴标签及编号备用，厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部[3]。

用推片的左下角，从取血部位刮取4～5 μl血量，使血滴与平置的载玻片接触，用推片的一角将血由内向外旋转2～4圈，涂成厚薄均匀，直径为0.8～1.0 cm左右的圆形厚血膜，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。

制薄血膜时，用推片一端边缘的中点，从取血部位取1～1.5 μl血量，使血滴与平置的载玻片接触，待血液沿推片边缘展开约2 cm长度时（玻片宽度为2.5 cm，即两边稍留一点），使推片与载玻片呈30～45°，均匀而迅速的轻轻从右向左推成舌状薄膜，制成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞，细胞之间互相接触而不相互重叠，每张载玻片上分别做1个薄血膜和1个厚血膜。

疟原虫(MP)厚血片检查法（手工法）的标准操作规程1. 实验原理应用瑞氏染色法对制备好的厚血片进行染色后在显微镜下查找疟原虫。

2. 标本采集2.1标本采集前病人准备：间日疟及三日疟患者应在发作后数小时至10余小时采血；恶性疟患者，应在发作后20h 左右采血。

2.2标本种类：全血或末梢血2.3标本要求：厚血片的溶血要及时。

3. 标本储存：厚血片的放置期限在夏季不超过48h，冬季不超过 62h。

4. 标本运输：室温运输。

5. 标本拒收标准：细菌污染。

6. 操作步骤6.1 在洁净玻片上，滴患者血液2滴。

6.2 用推片角将血液由内向外转涂成直径约1cm、厚薄均匀的血膜，在室温中自然干燥。

6.3 在干燥的血膜上滴加蒸馏水数滴，完全覆盖血膜，溶血数分钟。

脱去血红蛋白的血膜呈浅灰色，倾去溶血液。

6.4 不必待干，进行瑞氏染色。

6.5 干后镜检。

7. 结果判断与分析：在油镜下观察20个视野或以上才能报告“未检出疟原虫”；发现虫体后还应在薄血片上进行分类鉴别。

8. 临床意义：本实验有利于提高疟原虫的阳性检出率。

9. 操作性能：快速简便、阳性检出率高、利于人群普查初筛10. 方法局限性10.1 易受溶血不完全的影响。

10.2 经验缺乏者易受其他杂物的影响。

10.3 存在主观判断的失误10.4 不易鉴别出疟原虫的种类。

11. 参考文献中国人民共和国卫生部医政司编.全国临床检验操作规程（第二版）.1997,85-86 12. 注意事项12.1 染色后，水洗时不要先倒去染液，应让清水流进染液，使沉渣冲走。

12.2 注意区别易与疟原虫混淆的其他杂物。

检查疟原虫的血涂片制作与染色基本原理：疟原虫寄生在红细胞内，经染色后可对疟原虫形态做出鉴定。

材料准备：75%酒精、采血针、推片、载玻片、吉氏染液、甲醇、滴管、刻度管.(1)清洁载玻片的方法：将载玻片用清水清洗干净后晾干，再在稀释清洁液中浸泡1~2天，取出后用水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗，烘干，经95%酒精浸泡后，擦干。

清洗过的玻片用干净无油的纸包好备用。

(2)吉氏染液配制：○1原液配制，吉氏染剂粉1g，甲醇50ml，中性甘油50ml。

将吉氏染粉置乳钵中，加少量甘油充分研磨（30min以上），继续边加甘油边研磨，至加完为止。

然后转入烧瓶内，置55~60恒温水浴中，充分震摇使溶解（约2h）,冷却后加入甲醇，储于棕色瓶中，塞紧瓶塞，充分摇匀，1~3周后过滤，即为原液，配制时要研磨充分，不可混入水，配好后要密封，放置越久染色性能越好；○2工作液临时配制：将吉氏原液用pH 6.8~7.2的PBS作1:15~1:20稀释混匀即可。

操作方法：采用疟原虫感染小鼠做血涂片并染色.(但以下采血以人为例)（1）采血:1时间据各种疟原虫在人外周血中出现的规律，间日虐和三日疟患者可在发作后任何时间取血，但以发作后10h 以内最佳，恶性疟原应在发作开始后不久做血检，患者刚开始发作时原虫密度较低可能检测不到，所以应在第二次发作时再做一次以免漏诊：2部位成人可在耳垂或指尖，婴儿宜在脚跟或者大拇指：3方法先用75%酒精给皮肤消毒，右手持一次性无菌采血针迅速刺入皮肤2mm，轻轻挤压周围皮肤，弃去第一滴血，再取1滴作薄血膜，2滴作厚血膜。

薄血膜取血量少，涂面大，原虫分散，但形态清晰，易作虫种鉴别：厚血膜血量多，RBC集中，在原虫数量较少时便于发现，但因制作时细胞相互挤压堆积，原虫形态难认。

（2）涂片：1薄血膜制作取1滴置于洁净载玻片上，用1张磨口边缘作推片。

推片时用力要均匀，一次推成，保证血膜应呈舌形，RBC分布均匀。

2厚血膜制作用推片一角取血2滴，治愈薄血膜片右方用推片角由里向外顺一个方向旋转，使血滴形成直径约1cm的圆形血膜。

疟原虫镜检血片制作与染色操作流程
1．填写登记表在“疟疾发热病人血检登记本”上为患者编号并登记其相关信息。

2．清洁玻片
3．玻片编号
用目测法将玻片分成六等分，左侧第一和等二等份用于编号。

同一患者玻片上号码应与登记本上一致。

4．采血
5．涂制厚片
（1）血量: 4～5微升
（2）位臵：玻片第三等份中央的位臵
（3）血膜大小：0.8～1.0厘米
6．涂制薄血膜
（1）血量: 1～1.5微升
（2）位臵：玻片第四至第六等份的位臵。

涂制薄血膜的血应滴在玻片中央稍偏右的位臵
（3）血膜大小：2.0厘米(宽)×2.5厘米(长)
7．吉氏染色液配制
（1）2%的吉氏染色液配制方法98毫升蒸馏水加入2毫升吉氏原液，混匀后即为2%的吉氏染色液。

也可用1支试管，按1毫升蒸馏水加入1滴吉氏原液的比例稀释染液，混匀后用于染色。

（2）注意事项2%的吉氏染色液必须现配现用。

8．吉氏染色方法
（1）待厚血膜干燥
（2）甲醇固定薄血膜
（3）待甲醇挥发干净
（4）滴2%的吉氏染液覆盖厚薄血膜，染色30分钟。

（5）取出染好的血片，连同染液在清水中轻轻漂洗一遍，洗去表面吸附的杂质。

（6）放臵干燥处晾干。

血膜面朝上，注意不要放反了。

疟疾血膜制作及染色技术一、血片的制作1.材料准备载玻片：新玻片浸入有液态洗涤剂的清水中10-20分钟，干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干备用。

1. 2. 采血针：一次性 . 玻片盒：防止污染和昆虫吸食血膜 1. 4. 75%酒精棉球：采血前后消毒 . 记号笔：玻片上书写号码2.血片的制作（厚、薄血膜）用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂成薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘状，称厚血膜。

最好一张玻片上同时制作厚、薄两种血膜。

薄血膜涂片薄血膜取洁净的载玻片1张，左手持载玻片平置,右手持推片，推片一端边缘的中点刮取血液~微升（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片中线接触，待血液向两侧扩展约2cm宽时，以25°～35°夹角均匀而迅速地向左推成舌状薄血膜（约长）。

厚度以薄血膜上的红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳。

厚血膜涂片用推片的一角刮取4~5微升血量（相当于火柴头大小），使血滴涂于载玻片的中央偏右处，由里向外一个方向旋转2圈，涂成直径~的圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求（厚度以1个油镜视野内可见5~10个白细胞为宜）。

血膜位置通常将厚、薄血膜涂在一张载玻片上。

方法是将载片分为6等分，第1、2格备贴标签及编用；厚血膜涂在第3格中央；薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。

血片的制作编号血膜制成后，立即在玻片面上写上受检者的号码（姓名）、单位(地址)、制片日期、以防差错；待血膜干后依次按顺序插入标本盒内。

血膜制作注意事项1. 清洗玻片，且勿碰撞、磨损2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内3. 血膜应自然干燥，要充分干燥。

二、血片染色：（吉氏染液的染色方法）1. 血膜染色前的处理固定薄血膜血片干燥后，用吸有甲醇的吸管在薄血膜表面轻轻涂抹，自然干燥。

注意固定时甲醇不要接触厚血膜，否则会影响厚血膜的溶血。

溶解厚血膜血片干燥后，用滴管滴水于厚血膜上，待血膜呈灰白色时，将水倒去，晾干。