蛭龙活血通瘀胶囊对脑出血大鼠神经细胞保护作用的研究

泸州医学院学报　２０１２年　第３５卷　第１期　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌｕｚｈｏｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　Ｖｏ１．３５　Ｎｏ．１　２０１２　４７　

蛭龙活血通瘀胶囊对脑出血大鼠神经细胞　

保护作用的研究术　

杨云芳，白雪，潘洪，杨思进，陈辉　

（泸州医学院附属中医医院心脑病科，四川泸州６４６０００）　论著　

摘　要目的：观察大鼠脑出血后神经细胞凋亡与蛋白酶激活受体一１（ＰＡＲ一１）表达的动态变化及蛭龙活血通瘀胶囊的干　预作用，探讨蛭龙活血通瘀胶囊可能的脑保护作用。方法：将大鼠随机分为假手术组、模型组、蛭龙活血通瘀胶囊低、中、高剂量　组。自体血注入法制备脑出血大鼠模型，ＴＵＮＥＬ法测定凋亡细胞，免疫组化法测定ＰＡＲ～１蛋白。结果：与模型组比较，蛭龙活血　通瘀胶囊低、中、高剂量组的凋亡细胞与ＰＡＲ一１表达均明显下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。与低剂量组比较，中、高剂量组　各时间点的凋亡细胞与ＰＡＲ一１表达均明显下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。结论：蛭龙活血通瘀胶囊能明显抑制ＰＡＲ一１活　

化，减少细胞凋亡，对脑出血大鼠具有明显的脑保护作用，且存在一定量效关系。　

关键词蛭龙活血通瘀胶囊；脑出血；凋亡细胞；蛋白酶激活受体一１　

中图分类号Ｒ２５５．５　文献标识码Ａ　文章编号１０００—２６６９ｆ２０１２）１－００４７—０３　

脑出血是神经系统常见疾病，其发病率、病死　率、致残率高，给社会和家庭带来沉重负担。研究证　

实脑出血最重要的病理改变是血肿本身及其引发的　

继发性损伤ｆ１１。本实验通过动态观察大鼠脑出血后神　

经细胞凋亡和ＰＡＲ一１的动态变化及蛭龙活血通瘀　

胶囊的干预作用，探讨蛭龙活血通瘀胶囊可能的脑　

保护作用。　

１材料与方法　

１．１实验动物与药品　

健康雄性成年清洁级ＳＤ大鼠．体重２５０～　

３００ｇ，由泸州医学院实验动物科提供，动物使用许可　

证号：ＳＹＸＫ（ＪＩ［）２００８—０６５。蛭龙活血通瘀胶囊：主要　

由黄芪、水蛭、地龙、大血藤、桂枝等组成，每粒０．４ｇ　

ｆ相当于生药２．６ｇ），由泸州医学院附属中医院制剂室　

提供，批号：２０１００６０４；专利号：２００８１０１４７７７４．１。　

１－２动物分组与药物干预　

将１００只大鼠随机分为５组，即蛭龙活血通瘀　

胶囊高剂量组、中剂量组、低剂量组、脑出血模型组　和假手术组。每组各２０只。每组按术后不同时间各　

分为６ｈ、１ｄ、３ｄ、７ｄ共４个亚组，每亚组５只。均于术　

前７ｄ开始给药，每天１次。低、中、高剂量组大鼠均　

给予等体积（３ｍ１）；￣Ｈ应浓度的药物灌胃。用药量分别　

为０．４ｇ／ｋｇ／ｄ、０．８ｇ／ｋｇ／ｄ、１．６ｇ／ｋｇ／ｄ；假手术组及模型组　

大鼠给予等体积（３ｍ１）的生理盐水灌胃。　

｛基金项目：四川省卫生厅２０１０（Ｎｏ．２００２３４）　

作者简介：杨云芳（１９８４－）女，住院医师，硕士　通讯作者：杨思进（１９６２一），男，教授　１．３动物模型的制备　

参照Ｘｕｅ、Ｙａｎｇ等［２】　１的方法进行。大鼠术前禁　

食１２ｈ，称重后给予２％戊巴比妥钠。按４５ｍｇ／ｋｇ腹　

腔注射麻醉，俯卧位固定于鼠脑立体定位仪上。常规　

备皮消毒，沿头皮正中做一长约ｌｅｍ的纵切口，双　

氧水剥蚀骨膜，暴露前囟。于前囟前０．５ｍｍ，中线　

右侧旁开３ｒａｍ处，用微型手钻钻一直径约０．５ｒａｍ　

小孔，沿所钻小孔进针６ｒａｍ（相当于大鼠尾壳核　部位［４１）。按５１Ｍ／ｍｉｎ的速度匀速将大鼠自体尾部血　

液５０１ｘｌ注入尾壳核内，注血结束留针１５ｍｉｎ后缓慢　退针，骨蜡封闭针孔，缝合切口，消毒预防感染。假手　

术组以０．９％生理盐水５０１，１代替自体血，余操作同　

模型组。　

１．４造模成功标准　

待大鼠术毕清醒后，参照Ｚｅａ　Ｌｏｎｇａ　５分制法１５／　

进行神经功能缺损评分：０分：无神经功能缺损症　

状；１分：提尾倒挂时左前肢紧贴胸壁不能伸展；２　

分：行走时向左侧转圈；３分：行走或站立时向左侧　

倾倒；４分：意识障碍，不能行走。１～３分者为模型成　

功。各组大鼠每天进行１次神经功能缺损评分。　

１．５观察指标与方法　

１．５．１标本采集　

分别于术后６ｈ、ｌｄ、３ｄ和７ｄ，每组随机取５只　

大鼠，过量麻醉后，固定于简易手术台上，迅速开胸，　

暴露心脏．用接有输液器磨钝的１０号针头与心尖左　

缘成４５。向上进针．插人心腔并送至主动脉起始部　

（动作轻柔，防止戳破主动脉），固定针头，迅速剪开　右心耳，快速滴人０．

９％的生理盐水，至右心耳流出　泸州医学院学报　２０１２年　第３５卷　第１期　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌｕｚｈｏｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　Ｖｏ１．３５　Ｎｏ．１　２０１２　

液由血色转为清澈，改用４％的多聚甲醛２５０ｍｌ（ＰＢＳ　

配制，ｐＨ７．３），先在５ｍｉｎ内滴人１００ｍｌ，余液在　

２５ｒａｉｎ内缓慢滴完嘲，可见大鼠四肢及颈部明显僵　

硬，开颅取脑。以注射针道为中心，冠状切取针道前　２ｒａｍ至针道后２ｒａｍ脑组织，放人福尔马林溶液中浸　

泡固定．以备ＴＵＮＥＬ染色和免疫组化染色。　

１．５．２　ＴＵＮＥＬ染色检测细胞凋亡　

凋亡细胞染色具体操作按试剂盒说明书进行。　

凋亡细胞的细胞核呈棕黄色着染。　

１．５．３免疫组化染色检测ＰＡＲ一１蛋白　

将切片置６０℃恒温烤箱中烘烤３０ｒａｉｎ。石蜡切　

片，梯度脱蜡、脱水，３％Ｈ　Ｏ　室温孵育１０ｍｉｎ，蒸馏水　

洗３次，每次５ｒａｉｎ，微波抗原修复，血清封闭。滴加　

一抗（１：１００），置４℃冰箱过夜。加生物素标记的二抗　

（１：２００），室温下孵４０ｍｉｎ。加辣根酶标记链酶卵白素　

（１：２００１，室温下孵４０ｍｉｎ。以上每步均ＰＢＳ液冲洗３　次，每次５ｍｉｎ。ＤＡＢ显色，显微镜下控制反应时间。　

常规封片。ＰＡＲ一１免疫组化结果阳性为胞膜、胞浆　

呈棕黄色，可清楚的分辨出细胞核形态。　

１．６结果处理　

每只大鼠随机选取ＴＵＮＥＬ染色和免疫组化染　

色切片各３张，置于Ｎｉｋｏｎ　５０ｉ摄像显微镜下．对所　

测视野进行准确定位后，每张切片随机选择血肿周　

围５个不重复视野（１０￣４０），由摄像系统提取组织图　像，采用Ｉｍａｇｅ—Ｐｒｏ—Ｐｌｕｓ图像处理软件进行定量分　析，测定凋亡细胞与ＰＡＲ一１的平均光密度值　

（ＭＯＤ）。　１－７统计学处理　

实验数据用　表示，采用ＳＰＳＳ１３．０软件包进　

行方差分析，多组间比较采用单因素方差分析，Ｐ＜　

０．０５，差异有统计学意义。　

２结　果　

２．１凋亡细胞　

假手术组血肿周围可见少量凋亡细胞，组内各　

时间点比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），考虑为正　

常凋亡细胞。与假手术组比较，可见模型组及蛭龙活　

血通瘀胶囊低、中、高剂量组凋亡细胞的ＭＯＤ均明　

显升高，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１），说明血肿周围　

存在大量神经细胞病理性凋亡。与模型组比较，蛭龙　

活血通瘀胶囊低、中、高剂量组凋亡细胞的ＭＯＤ均　

明显降低，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。与低剂量组　

比较，中、高剂量组凋亡细胞的ＭＯＤ均明显降低，差　

异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。高剂量组与中剂量组比　

较，差异无统计学意义（Ｐ＞Ｏ．０５）。组内各时间点比　

较，模型组及蛭龙活血通瘀胶囊低、中、高剂量组大　

鼠凋亡细胞的ＭＯＤ均于术后６ｈ开始升高，术后１ｄ　

继续升高，术后３ｄ达到高峰，与组内其他时间点比　

较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１），术后７ｄ明显下降，　

（见表１）。　

表１各组凋亡细胞ＭＯＤ的变化情况（　）　

注ｌａ与假手术组比较，Ｐ＜０．０１；ｂ与脑出血模型组比较，Ｐ＜０．０１；ｃ与低剂量组比较，Ｐ＜０．０１；ｄ组内　各时间点与３ｄ比较．Ｐ＜０．０１　

２．２　ＰＡＲ一１蛋白　

假手术组血肿周围可见少量ＰＡＲ一１蛋白表达．　

组内各时间点比较差异无统计学意义（１９＞０．０５）。与　

假手术组比较，可见模型组及蛭龙活血通瘀胶囊低、　

中、高剂量组ＰＡＲ一１蛋白的ＭＯＤ均明显升高，差异　

有统计学意义（Ｐ＜０．Ｏ１）。与模型组比较，蛭龙活血通　

瘀胶囊低、中、高剂量组ＰＡＲ一１蛋白的ＭＯＤ均明显　

降低，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。与低剂量组比　较，中、高剂量组ＰＡＲ一１蛋白的ＭＯＤ均明显降低．　

差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。高剂量组与中剂量组　

比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。组内各时问点比　

较，模型组及蛭龙活血通瘀胶囊低、中、高剂量组　

ＰＡＲ一１蛋白的ＭＯＤ均于术后６ｈ开始升高，术后１ｄ　

继续升高，术后３ｄ达到高峰，与组内其他时间点比　

较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１），术后７ｄ明显下降，　

（见表２）。

　第１期杨云芳等：蛭龙活血通瘀胶囊对脑出血大鼠神经细胞保护作用的研究　４９　

３讨论　表２各组ＰＡＲ一１蛋白ＭＯＤ的变化情况（　虹）　

注：ａ与假手术组比较，Ｐ＜Ｏ．叭；ｂ与脑出血模型组比较，Ｐ＜０．０１；ｃ与低剂量组比较，Ｐ＜０．０１；ｄ组内　各时间点与３ｄ比较，Ｐ＜Ｏ．０１　

脑出血是指非外伤性脑实质内出血，是脑卒中　

最具破坏性的一种类型。脑出血后血肿分解释放多　种活性物质，如凝血酶、血红蛋白、血浆蛋白、白细胞　

和补体等，对血肿周围组织具有严重的损害作用，可　表现为局部脑血流和代谢的异常、脑水肿及血脑屏　

障破坏等　。其中，凝血酶在脑出血后的继发性损伤　中发挥重要作用。凝血酶是凝血级联反应过程中的　

关键酶。也是一种重要的细胞外信号因子，通过激活　凝血酶受体，主要是激活ＰＡＲ一１参与细胞凋亡等一　

系列的病理过程。　蛭龙活血通瘀胶囊是导师杨思进提出“中风病　的发生．气虚是根本，痰浊瘀血为其标”，治疗法则应　

虚实兼顾、标本同治，予“重用补气、辅以化痰通络，　佐以祛风”，并在此法指导下形成的纯中药制剂。其　

组方为：黄芪、水蛭、地龙、大血藤、桂枝等药。现代药　理研究证实，黄芪的主要药理成分是黄芪总黄酮、黄　芪多糖和黄芪总皂甙。黄芪总黄酮在体内有清除氧　

自由基的作用：黄芪多糖可能通过直接发挥抗炎作　用，抑制核因子　Ｂ表达和清除氧自由基的机制从而　

减少神经细胞凋亡．加速神经功能缺损恢复。水蛭的　主要成分水蛭素是迄今发现最强的凝血酶抑制剂，　

与凝血酶活性中心结合成稳定的非共价键化合物，　从而抑制凝血酶对纤维蛋白原的水解，阻断凝血级　联反应　同时，凝血酶与水蛭素结合后无法裂解蛋白　

酶激活受体的胞外Ｎ端，因此无法激活凝血酶受　体，从而抑制受体介导的神经细胞凋亡和刺激小胶　

质细胞活化、增生、分泌细胞因子等作用Ｉｓ一。并可通　过活血化瘀的作用使侧枝循环开放，使血肿通过与　周围血管的接触，促进其吸收并改善其周围低灌注　

损伤【　Ｏｌ。　本实验结果显示，在脑出血后ＰＡＲ一１的表达趋　势与凋亡细胞的表达趋势基本一致，这与郑国庆ｌ１】】、　

关景霞ｌｌ　２ｌ等采用逆转录酶一聚合酶链反应（ＲＴ—ＰＣＲ）　法的研究结果相似。在相应时问点，与模型组比较，　蛭龙活血通瘀胶囊低、中、高剂量组凋亡细胞与　ＰＡＲ一１蛋白的表达均明显减少。差异有统计学意　

义。蛭龙活血通瘀胶囊可能是通过抑制ＰＡＲ一１活　

化，减少细胞凋亡，从而起到脑保护作用，且存在一　定的量效关系。　

参考文献　

１．　赵巧珍，杨文，杨期明，等　卤出血的病理损伤机制研究进　展Ⅱ】．医学创新研究，２００８；８（２４）：３４　２．Ｘｕｅ　Ｍ，Ｄｅｌ　Ｂｉ百ｏ　ＭＲ．Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉ￣ｅｃｆｉｏｎ　ｏｆ　ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　ｗｈｏｌｅ　ｂｌｏｏｄ　ｉｎ　ｒａｔｓ：ｔｉｍｅ　ｃｏｕｍｅ　ｏｆ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｓ—ｃｉ　Ｌｅｔｔ，２０００；２８３（３）：２３０　３　Ｙａｎｇ　ＧＹ，Ｂｅｔｚ　ＡＬ，Ｃｈｅｎｅｖｅ￣ＴＩ，ｅｔ　ａ１．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｈｅｍ－　ｏ￣ｈａｇｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｂｒａｉｎ　ｅｄｅｍａ，ｂｌｏｏｄ　ｆｌｏｗ　ａｎｄ　ｂｌｏｏｄ—ｂｒａｉｎ　ｂａｒｒｉｅｒ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ｒａｔｓＵ］．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ，１９９４；　８１（１）：９３　４．　Ｇｅｏｒｇｅ　Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｗａｔｓｏｎ．Ｔｈｅ　ｒａｔ　ｂｒａｉｎ　ｉｎ　ｓｔｅｒｅｏ—　ｔａｘｉｃ　ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ【Ｍ１．Ｆｉｆｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏ—　ｖｅｍｂｅｒ，２００４；３２１—３２５　５．　Ｚｅａ　ｌｏｎｇａ　ＥＬ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ　ＰＲ，Ｃａｒｌｓｏｎ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．１Ｋｅｖｅｒｓｉｂａｌ　ｍｉｄｄｌｅ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ａｒｔｅｒｙ　ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｃｒａｎｉｅｃｔｏｍｙ　ｉｎ　ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｓｔｒｏｋｅ，１９８９；２０：８４　６．　远山正弥．神经科学尖端技术手册一分子组织化学【Ｍ］．　北京：北京科学出版社，１９９８；２５１￣２５７　７．Ｘｕｅ　Ｍ．Ｄｅｌ　Ｂｉｇｉｏ　ＭＲ．Ｉｎｔｒｏｃｏｒｔｉｃａｌ　ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎ　ｒａｔｓ；ｒｄａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｂｌｏｏｄ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｂｒｉａｎ　ｃｅｌｌ