石蜡包埋技术
制作石蜡切片, 切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中, 而水与石蜡又是不相混合的, 因此在浸蜡, 包埋前必须将组织内所含的水分脱去。而大多数的组织固定剂是水溶液, 随后的水冲洗也使其含有大量水分, 因此必须先行脱水, 一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。由于酒精和石蜡不能混合, 须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精, 因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状, 因此此步骤又称透明。最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤, 即固定, 脱水, 透明, 浸蜡和包埋, 前一章中已述过固定。
第一节脱水
脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分, 为下一步透明及浸蜡创造条件。另外, 脱水还能够使组织再次发生一定的硬化, 脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。
一．常见的脱水剂
1．酒精: 是制片最常见的试剂, 可与水在任何比例下相混合, 酒精的脱水能力比较强, 又能硬化组织。可是酒精的船头速度很快, 对于组织会有明显的收缩作用。因此在以酒精作为脱水剂时, 应该先从浓度较低的酒精开始, 然后递增其浓度, 这样能够避免组织过度收缩。
第一瓶酒精浓度随固定剂, 脱水组织的大小和种类而异, 经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水, 从50％酒精开始。如眼球, 组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始, 再经80％, 95％以至无水酒精。可是有时为了某种特殊要求, 例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本, 为
了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定, 而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。
用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。用醇性固定剂( 如Carnoy) 则可置于高浓度无水酒精内, 但应多次换液以除酸。
一般情况下, 组织经过70％, 80％, 90％, 95％, 以至无水酒精的脱水程序, 即可达到脱水的要求。可是为了能使大量的组织块同时进行脱水, 则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用, 最好是以两次95％酒精, 两次100％酒精重复进行脱水, 以保证组织的水分脱净。脱水时间应视组织种类, 组织块大小, 厚薄和固定剂的不同而异。如脱钙的骨组织, 实质性脏器等的脱水过程宜短, 而疏松结缔组织, 脂肪组织等, 脱水过程则宜适当延长。水分必须脱干净, 脂肪必须溶去。含有铬酸的固定剂固定的组织, 脱水时间不宜过长, 而镀银组织更应注意, 脱水时间应比为镀银的同类组织要短。
脱水的基本原则: 从低浓度酒精开始逐渐升到高浓度酒精, 以保持组织中的水分完全脱净。一般1cmX1cmX0.2cm大小的组织,脱水全过程仅需要数小时即可达到完全脱水。在各级浓度酒精内处理的最短时间分别减少到2—4小时也能获得满意的结果。如果组织脱水不尽,随后的透明,浸蜡都会受到影响,致使切片很难以完成。较差质量的切片,很容易造成在染色时脱片,这样的组织蜡块, 因其含有一定的水分,一经与空气接触即干燥而凹陷。脱水不尽的组织是不能切出很好的切片的。
外检标本的制作,当前都采用快速脱水的方法。科研标本,教学标本的脱水时间比较长,其目的在于更充分脱水,并适当加强了组织的硬度。
酒精脱水剂使用不宜太久,应适时更换新液。当酒精混浊,变黄或酒精滴于水中出现乳白色混浊时,说明酒精中溶解了过量的脂类,这种情况一出现,将会影响
脱水,则应及时更换。
各种浓度酒精的配制:
切片室内应常备有70%,80%,85%等各种浓度的酒精。配制时应以95%酒精作为基液加水稀释,不要用无水酒精去配制,因无水酒精的价格较高,极不经济。
配制方法如下:
a. 先将高浓度酒精注入量杯, 其量同将要稀释酒精浓度数字相等。
b. 加入蒸馏水, 致总量达到原酒精浓度的数字量。例如:
用95%酒精配制成70%酒精时:
(1)取95%酒精70毫升;
(2)加蒸馏水使达到95毫升;
稀释后的酒精既为70%的酒精。
用80%酒精配制成60%酒精时:
(1)取80%酒精60毫升;
(2)加蒸馏水使达到80毫升;
稀释后的酒精既为浓度为60%的酒精.其余类推,其它的试剂的稀释也均能够参照此方法进行配制。
2.丙酮(Acetone): 可用作固定液,也是一种比较好的脱水剂。脱水能力强、速度快,可配制不同浓度进行脱水。但一般情况下,多用在无水酒精的补充脱水。
丙酮脱水时间比酒精强,但容易使组织过度硬化,因此应适当掌握脱水时间。
3.正丁醇(γ-Buty alcohol): 正丁醇脱水能力较酒精弱,可与水、酒精相混合,而且也能溶解石蜡,因此正丁醇不但能够替代酒精使组织脱水,还能够代替二甲苯使组织透明。平常在稀释时都与酒精按照一定比例配制使用,或将组织脱水至90%酒精后移入正丁醇,
正丁醇再脱水后可直接投入石蜡。用正丁醇脱水,组织比较少引起收缩和硬化等不良结果。
4.二氧乙环(Dioxan): 二氧乙环是一种有毒物质,易挥发(使用场所必须通风),能同水、酒精、二甲苯相混合并能溶解石蜡,是一种既能够脱水,也具有透明效果的液体。脱水一般能够70%开始,再经过90%至纯二氧乙环,然后浸入石蜡。二氧乙环脱水对组织无收缩和硬化等不良现象,对较硬的组织或易收缩的组织可使用二氧乙环。
二.组织的摇震
为加快脱水进程可将标本放入各级酒精内借助机器或手工震摇, 还能够加温促进脱水。即将标本装在塞紧的玻璃瓶置于包埋箱或温箱内, 因液体受热产生的正压可增加溶液的对流。但热酒精会使组织过硬, 并有爆裂危险, 除急诊外, 最好不用此方法。
第二节透明
组织脱水后, 还要经过一个浸蜡的媒剂透明过程。目的是使石蜡渗透到组织中去, 达到包埋的支持作用。常见的脱水剂如酒精等, 不能溶解石蜡与之相混合, 因此必须使用一种既能够同酒精又能同石蜡相混合的媒剂, 当组织脱水后, 浸蜡之前将组织投入这种媒剂中。由于两剂能相混合, 另一方面也由于这种媒剂比酒精比重大, 组织中的酒精就被该媒剂取代, 待酒精完全被该媒剂完全取代后,
组织即成透明状态, 因此我们长称这种媒剂为透明剂, 在制片中的这一过程就称为透明过程。
实质上透明仅是一种过程而非目的, 其因此出现透明现象使因其折光系数改变的缘故。从组织的状态上看, 由于组织经过媒剂的作用之后, 其折射系数近于组织蛋白的折射系数, 从而显示出透明状态。组织一旦呈现透明状态, 也说明脱水剂已被媒剂所取代。透明后就能够将组织浸入溶解的石蜡进行浸蜡。
透明剂
透明剂很多, 一般常见的有二甲苯, 苯, 甲苯, 氯仿, 香柏油等。
1．二甲苯: 是最为常见的一种透明剂, 它能与酒精, 丙酮相混合, 又是石蜡的溶剂。在透明过程中, 组织继续发生硬化, 由于二甲苯对组织的收缩性强, 作用迅速, 因此, 组织在二甲苯中时间不宜过长, 否则组织容易变脆变硬, 一般是达到组织的透明为度, 小块组织在半至一小时内透明。为了不使组织过度硬化, 苯则。是更好的一种透明剂, 它较甲苯和二甲苯的作用稍缓, 对组织收缩较少, 不易变脆。但苯较二甲苯毒性大, 挥发快, 故应注意安全使用。
2．氯仿: 也是一种很好的媒剂, 它的作用缓和。组织在此液内过夜也不至于过硬变脆, 这一点较苯, 二甲苯和甲苯优良。但氯仿比重较大, 折光率较小, 不能改变组织的折光率, 组织在氯仿中不易呈现二甲苯那样的透明现象, 因此组织要比实际需要浸渍更长一些时间保证完全渗透和置换出酒精。
3．香柏油: 是研究处理细柔组织的最佳透明剂, 因它的硬化作用极小, 组织在此液体内较长时间甚至几个月也可无妨。过硬的组织脱水后, ( 如皮肤和致密纤维组织) 用香柏油透明, 经此处理后的组织容易切片。不过香柏油的浓度大, 渗透力弱, 同石蜡混合不及其它透明剂效果好, 故常规石蜡切片一般不用。
透明时间的长短因组织的大小而异。例如脑组织和有血块的组织, 就应该缩
短在二甲苯内留置时间, 而一些肌肉组织和胃肠组织则应该稍延长在二甲苯内留置时间, 最好先投入酒精和透明剂等量混合液半小时, 再入透明剂, 并更换一次透明剂, 待组织完全透明后进行浸蜡, 一般需要半小时至2－－3小时。
脂肪组织由于其结构不同透明最快, 可是这并不能说明组织中脱水剂已完全被透明剂取代, 因脂肪组织本身折光率与透明剂( 二甲苯) 相近, 因此应在透明剂中多浸一段时间使脂肪组织尽可能为透明剂所溶解, 才有利于石蜡的侵入。
透明过久是否会导致组织过度硬化变脆, 这取决于脱水的彻底与否, 如果组织脱水完全彻底, 则不会导致过度硬化和变脆, 个别含胶样物质过多的组织例外。
第三节浸蜡
组织经媒剂的透明作用之后, 移入熔化的石蜡内浸渍, 石蜡逐渐浸入组织间隙, 取代透明剂, 这一程序就叫浸蜡。根据所用石蜡的熔点, 浸蜡需要能够保持于54－60.C温箱内进行。石蜡的质量和熔度与切片质量密切相关, 因此对石蜡的选择应以注意。
用作浸蜡的石蜡不应含有尘粒, 杂质及其它异物, 不含水分, 质地均匀成半透明状, 触之感觉滑而不腻, 结晶及颗粒少。石蜡中如有水分会结晶而变为白斑可用加热搅拌的方法除去。所有的蜡在使用前按常规必须用标准滤纸在漏斗内过滤到搪瓷杯里储存于浸蜡箱中。最好将石蜡于小锅中加热煮至近沸, 冷却再煮重复数次后空气能够排除, 挥发性油脂类在煮的过程中挥发。处理后的石蜡置于恒温箱中保持液体状态备用。所用的石蜡有一定的熔点和硬度, 熔点高, 硬度大。一般要求在52－56℃之间, 这既能够支持硬组织也可使切片成条。使用时应根据组织类型以及制片时的温度和气候而异。夏季采用高熔点的石蜡, 冬季则采用低熔点的石蜡。
石蜡的熔点越低, 其质地相应的较为疏松。硬蜡( 熔点60℃) 用于硬纤维组织。软蜡用于胎儿和乳腺组织, 这些尽为研究工作的需要。为了增加石蜡的韧性, 可在石蜡中加入一些混合剂, 常见蜂蜡, 硬脂酸, 松香等。
1.蜂蜡: 又叫黄蜡, 是蜜蜂用来造巢的淡黄色蜡, 熔点在54℃左右, 质地柔软, 滑润有韧性。为了使低熔点的石蜡硬一些, 可加入10－20％的蜂蜡。它能增加蜡的熔点而不必使组织浸在高温内, 便于切片。也要根据组织的种类而异, 一般常规用量不超过5％为度。
2.硬脂酸: 为有光泽的白色片状结晶体, 不溶于水, 而溶于乙醇, 醚和氯仿。熔点64－71％, 在浸蜡中加入少量的硬脂酸可增加石蜡的渗透性。有人用硬脂酸和石蜡混合液置于温箱中代替二甲苯透明。
3.松香: 为棕黄色半透明的固体。质硬而脆, 遇热熔解, 呈胶体状, 同石蜡混合时, 可增加石蜡的硬度, 由于松香质脆, 混合后可增加硬度但韧性不足。
组织浸蜡时间也应视组织种类大小和结构不同而异。在整个浸蜡过程中, 标本大小对完成浸蜡所需的时间有很大影响。较厚的组织需要较长时间才能使蜡浸入中心, 而且厚的组织常带入的透明剂比较多, 故需要多次浸蜡才能将透明剂除去。即使少量透明剂也会沾污石蜡而产生结晶, 致使切片时切片易碎裂。也要考虑组织的种类, 骨, 皮肤和中枢神经系统等致密组织要比软组织如肝肾等需要加倍时间。含血多的组织, 肌肉和纤维束在蜡内易过硬而发脆, 故浸蜡时间应缩短。疏松组织, 脂肪, 消化道组织等浸蜡时间能够适当延长一些。为了尽可能排除透明剂, 浸蜡能够分两级或三级进行。以熔点较低的软石蜡作为第一步, 然后再换为熔点较高的石蜡作为第二步, 第三步。浸蜡时间1－4小时, 或更长, 并使之过夜则较易切割, 如此浸渍的组织切片在干燥箱内干燥也不易卷曲和龟裂。
第四节包埋
包埋, 就是将已经经过固定, 脱水, 透明, 浸蜡的组织块从最后的蜡浴取出置入充满熔融石蜡的包埋框内, 包埋成块, 使组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却, 这个程序称为包埋。包埋剂凝固后, 进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。
一．石蜡包埋法
石蜡包埋法是制作光学显微镜切片的常规方法, 它有许多优点, 操作简易便于掌握, 可进行连续切片, 包埋后的组织能够长期保存。
包埋的方法有自动包埋机包埋和手工包埋两种。手工包埋的步骤如下:
1.组织浸入石蜡后, 包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上, 其下点燃酒精灯, 以保持石蜡的溶解状态。
2.准备好包埋框, 将包埋用的镊子在酒精灯上加温( 防止镊子粘蜡) 后, 左手持蜡杯, 右手把加温的镊子放在蜡口( 直立状) 倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。
3.迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内, 切面朝下放正置入框底并轻轻压平, 以保证不再有气泡。
4.待石蜡表面凝固前将标签贴于其上, 需注意勿使标签与标本混淆, 当蜡块冷至蜡面有一层透明蜡膜时, 浸入冷水中迅速使其冷却, 否则蜡内常形成结晶。
5.蜡块完全硬固后除去铜框, 以保证蜡彻底凝固, 立即修切, 准备制成切片或储藏备用。
二．石蜡包埋的注意事项
石蜡包埋组织的DNA提取及其应用 近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突变和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表达和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。 医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或m RNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，本节不再赘述。Goelz(1985)和Dubeau 等（1986）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻组织和细胞的历史，而且可以广泛地应用于大宗病例的回顾性研究，对肿瘤发生的分子机制的探讨，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。本节重点讨论石蜡包埋组织DNA提取的方法学及其潜在的应用前景。 一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法 从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而来。Goelz 等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术（表18-5），是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，直接进入含SDS和高浓度蛋白酶K（1mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分子生物学实验。Du beau等（1986）在上述方法上作了改进。首先通过组织切片用二甲苯脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小片段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子，从而提高了DNA质量，适于做Southern印迹杂交分析。Moerkerk等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所取得DN A之点杂交结果一致，非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。 表18-5 Gpelz氏DNA提取方法的主要步骤
1．冰冻切片是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。 冰冻时，组织中水份易形成冰晶，往往影响抗原定位。一般认为冰晶少而大时，影响较小，冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述现象更易发生。冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的数量愈多则愈小，对组织结构影响愈严重。因此，应尽量降低冰晶的数量。Fish认为冰冻开始时，冰晶成核率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为-33。C,从-30。C降至-43。C之间，成核率急剧增加达1018，然后再减慢。基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。 （1）速冻，使组织温度骤降，缩短从-33。C43。C的时间，减少冰晶的形成。其方法有二： ①干冰-丙酮（酒精）法：将150-200ml丙酮（酒精）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不再昌泡时，温度可达-70℃C，用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（纯酒精）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。将组织（大小为1cm××）投入异戊烷内速冻30-60s后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80℃低温冰箱内贮存。 ②液氮法：将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。 （2）将组织置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。 影响冰冻切片的因素较多，因此，技术难度较大，选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。目前冰冻切片机有两类： ①恒慢冰冻切片机（Cryastat）：为较理想的冰冻切片机，型号很多，但其基本结构是将切片机置于-30℃C低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至2-4μm，完全能满足免疫组织化学标记要求。切片时，低温室内温度以-15℃～18℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。 ②开放式冰冻切片机：包括半导体致冷切片机和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷冻切片机。切片时暴露空气中，温度不易控制，切片技术难度大，在高温季节，切片更加困难，且切片厚8～15μm，不易连续切片，但其优点是价廉，国内有生产。 冰冻切片后如不染色，必须吹干，贮存低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存冰箱保存。 2．石蜡切片其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准确。用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同：①脱水、透明等过程应在4℃。C下进行，以尽量减少组织抗原的损失。②组织块大小应限于2cm××，使组织充分脱水、透明、浸蜡。③浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下，以溶点低的软蜡最好（即低温石蜡包埋）。 组织块脱水、透明、浸蜡时间参考表1-3： 表1-3 组织块处理时间表 1 70%乙醇4℃3～4h 2 80%乙醇4℃3～4h 3 90%乙醇4℃2～3h 4 95%乙醇Ⅰ4℃2～3h 5 95%乙醇Ⅱ4℃1～2h
石蜡切片的基本操作流程 一、取材选取目的组织块，修剪到合适的大小； 二、固定 将组织块放入福尔马林固定液（10%甲醛溶液），固定时间由组织块大小而定，一般不少于24h；体积1cm3的组织块，一般为3-7天； 三、冲水自来水洗几下，泡1小时； 四、系列酒精脱水 50%酒精，1h； 70%酒精，1h； 80%酒精，1h； 90%酒精，1h； 100%酒精（I），1h； 100%酒精（II），1h； 五、透明 酒精：二甲苯=1：1溶液，过夜； 二甲苯，1h； 六、包埋 二甲苯：石蜡=1：1，65-70 ℃，2h； 新鲜石蜡（I），65-70 ℃，1h； 新鲜石蜡（II），65-70 ℃，4h； 新鲜石蜡包埋； 七、切片切片厚度为5-7um； 八、展片温水（40-42 ℃）展片； 九、捞片将展好的片子贴于载玻片上； 十、烘片42 ℃将片子上的水烘干； 十一、烤片60 ℃烤片12-24h； 十二、脱腊 二甲苯（I）：2min； 酒精：二甲苯=1：1溶液：2min； 十三、水化 100%酒精（I）：1min； 100%酒精（II）：1min； 95%酒精：1.5min； 80%酒精：1.5min； 70%酒精：1.5min； 50%酒精：1.5min； 自来水洗：2min 十四、H&E染色 Hematoxylin染色3-5min(2.5min时取出观察染色效果)，自来水洗3次，盐酸分化（2/3杯玻璃缸+3滴1N盐酸），10s；自来水洗蓝化，镜下观察染色效果；（伊红）Eosin染色30-50s，直接脱水（90%酒精-----100%酒精I，100%酒精II各1分------酒精：二甲苯=1：1溶液：1-1.5min）；十五、脱水 90%酒精-100%酒精-100%酒精，各1min； 十六、透明 二甲苯：酒精：1-1.5min；二甲苯：2min；
石蜡切片的制作 目的要求:了解生物制片的基本原理和方法;了解石蜡切片制作的基本过程;学会制作石蜡切片。 一、生物制片的基本原理 (一生物制片的目的与发展概况 生物制片是研究生物有机体微观结构的基础方法,其目的是提供在显微镜下以适度的样品,有效地对其进行形态和功能观察研究。 (二生物制片的方法 当我们研究生物体的组织或细胞时,除了某些生物体可用相差显微镜或偏光显微镜等方法达到观察目的外,其余大部分生物体,因为组织较厚,光线不易透过内部等关系而达不到观察的要求,为了达到此目的,就必须将生物体的组织切成薄切片或不切片,经过一系列处理,使光线易于透过,即可进行观察。因此,根据标本的制作方法分为切片法和非切片法两种。这些方法,各有优缺点,应该适当的配合使用,才能获得比较理想的结果。 1.切片法 (1切片法的种类 切片法就是利用锐利的刀具,将器官组织或幼小个体分割成许多极薄的薄片,而制成切片标本的一种方法。切片法在切成薄片以前必须设法使组织内渗透某种支持物质。使组织保持一定的硬度,然后利用切片机进行切片。根据所用支持物质的不同切片法又可分为石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法、炭蜡切片法等类型。现分述如下: ⅰ.石蜡切片法
石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法,因此用得最多,它有很多优点:比较省时间,容易操作,可切成极薄的切片(4um 以下,能制作连续切片,组织块可包埋在石蜡中永久保存。缺点是只能用于较小的组织块,较大的组织块不易切好,容易破碎,组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。制片时间太长。 ⅱ.火棉胶切片法 火棉胶切片法是以火棉胶为支持剂进行切片的方法。此法的优点是包埋过程中不用二甲苯及石蜡,不经高温,可避免组织收缩及变脆,适于精细材料(如脑的切片,也引火棉胶有韧性切片不知有折卷或破裂,适宜于大块组织及多空洞的组织(脑、眼球,硬度较高的组织(骨、肌腱。缺点:手续麻烦、费时间,切片不能切薄,起码在10um以上,不能作连续切片,因此,在生物制片技术上已经不经常采用。 ⅲ.冰冻切片法 冰冻切片法是利用液体二氧化碳或其它药剂(如氯乙烷在变成气体时吸收大量的热使组织迅速结成冰块而后再进行切片的方法。目前国内外用半导体致冷调节器来代替二氧化碳的冰冻,冷冻速度更快更为方便。 冰冻切片法的优点是较前两种方法简便,组织不经脱水、透明、包埋等手续即可切片,因而可节省很多时间,十分钟左右即能制成切片。常用于临床病理手术诊断,银材料不经溶媒处理就可直接进行切片,材料不受试剂的激烈刺激及温度影响,所以组织没有显著的收缩,细胞形态不致有大的改变,也引冰冻切片不需有机溶剂处理,所以能保存脂肪、类脂等成分,所以冰冻切片法常用于组织化学,尤其是神经组织,临床病理学等方面的研究。 新鲜的组织或已经固定的组织,经短时间处理后即可进行切片。用任何固定及处理的材料均适合冰冻切片,但一般的经验用福尔马林固定的材料最适合冰冻切片,而用酒精、甘油保存的材料必须充分水洗后才易于冰冻,否则不易切成完整的切片
一、制备显微标本的切片法 一石蜡包埋切片制作法 这是最常用的切片法。以石蜡作为组织的填充支持介质，将整块组织加以包埋， 最后凝固成均匀一致的固态结构。用切片机制取极薄的切片。为了让石蜡能浸入组织内部，需将组织经过脱水等处理。过程大致如下： ⑴固定：生物标本脱离机体或培养环境，细胞会发生自溶，腐败分解。因此，需 用固定剂处理，使蛋白质凝固停止濒死或死后变化。凡供永久保存的标本都需经固定处理。 常用的固定剂是甲醛、乙醇等，能使蛋白质凝固。还有由几种试剂配成的固定液，例如Carnoy固定液，由无水酒精、氯仿、冰醋酸配成，固定力更快更强，不含水分，可避免水溶性物质如糖原等在固定过程中损失。 ⑵脱水：是将组织细胞所含水分除去。通常用乙醇（AlcohoI ,酒精），浓度递升到100%。此过程还使组织块进一步硬化。 ⑶透明：是用既能溶于纯酒精又能融解石蜡的有机溶剂，将组织中的酒精取代，以便石蜡浸入。通常用二甲苯（xylene ）为透明剂。 ⑷浸蜡：在温箱内进行。已透明的组织块放入加热融解的石蜡中，让石蜡浸透组织，作为支持介质。 ⑸包埋：将已浸蜡的组织块放入热融的包埋石蜡中，迅速冷凝，组织决便被蜡包埋。 ⑹切片：用切片机。常用的切片机有轮转式、平推式的。用轮转式的易于切出连续切片。切片厚度随制片目的而调整。教学标本厚度多是5~6卩m。 ⑺贴片烤干：石蜡切片在温水上展平后，移在玻片上，烤干，即可供染色处理。
染色后用树胶、盖坡片封固，可永久保存。 二冷冻切片法 冷冻切片法是借组织在低温下，冻结变硬而达到符合切片要求。冷冻切片法需有冷冻切片机，或在普通切片上配制冷设施。恒冷切片机是高级冷冻切片设备。它有一个恒冷箱，标本致冷台和切片机都装在箱内。恒冷箱的作用类似冰箱，可在一定范围内调整温度，其结构有利于保持箱内恒定低温，减少箱门打开时环境温度的干扰。切片机的轮转把手装在箱外，便于操纵切片。 冷冻切片法的优点是：在处理得当时，它可以最大限度地保持组织的新鲜状态。 并且，由于不需经脱水、透明、浸蜡等过程中有机溶剂的处理，及湿箱浸蜡热的影响，甚至可不经固定。所以能很好地保存组织细胞的各种成分和酶的活性，因此在酶的组织化学研究中常用此切片法。 二、显示标本结构成分的染色法 一苏木素伊红染色法（HE染色法） 为最常用的染色法。该法应用于各种组织的染色，是组织学技术的基本方法，对任何液体固定的组织和各种包埋的切片均可使用，只是对不同包埋的切片法处理略有不同。下面简介石蜡包埋切片的HE染色法。 1、脱蜡：石蜡切片的组织内部充满石蜡，不能使水溶性染液着色，因此在染色 前必须首先用二甲苯将石蜡脱掉，共两次。 2、下行入水：将已脱蜡的标本浸入无水酒精及各级酒精，使组织逐步接近水。 3、蒸馏水略洗。
石蜡切片 1.仪器 石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。 2. 试剂 FAA固定液(70%酒精90ml、冰醋酸5ml、福尔马林5ml)、10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。 3.取材 幼嫩的油菜植株叶片和茎 4.方法与步骤(参照) 1．固定： FAA固定液固定48小时以上。 2．脱水： 50%酒精→70%酒精→83%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精。每级2h。100%酒精中1.5h。其中70%酒精处可长期保存。 3．透明： 1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) →纯二甲苯(1.5h) →纯二甲苯(1.5h) 4．浸蜡： 将处理的材料置于1/2石蜡(固体粉末状)+1/2二甲苯中，40℃烘箱敞口过夜。 5．包埋： 先提升恒温箱的温度至60℃，换纯蜡3次，每次1-2h，用硬的电光纸、牛皮纸叠纸盒，置于45-60℃的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签（正面向外置于底部），补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。 6．切片 对包埋的材料进行修块、粘块、整修后，保证材料四周都有石蜡包围。但不可太多。切面的上、下边平行。用加热的解剖刀蘸取少许石蜡碎屑，并迅速将石蜡块四周的碎屑烫平，使石蜡块牢固地粘在台木上。检查切片机，安装切片刀、调整好刀的角度，调整石蜡块与刀口之间的角度与位置后开始切片。
7．粘片 将粘贴剂置簿玻片上，再取切片浮置粘片剂上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度30～40℃中过夜。 8．脱蜡 脱蜡用二甲苯，把烤好的载玻片放于盛二甲苯的染缸中：纯二甲苯(10-20min)→纯二甲苯(5-10min) 9．染色 将纯二甲苯脱蜡完全的材料，1/2 二甲苯十1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→1%番红染色(4h以上) →50％酒精→70％酒精→85％酒精→95％酒精→0.5%固绿(1min)→95％酒精→100%酒精→100％酒精(未注明时间各级均为3min) 10．胶封 滴加加拿大树胶封藏。 11.镜检，拍照
石蜡切片制作 一、苏木精-伊红对染法 一、器材及试剂： 1.器材： 切片刀，切片机，恒温箱，蜡杯，酒精灯，解剖刀，解剖剪，解剖盘，培养皿，镊子，单面刀片，毛笔，包埋盒，染色缸，盖玻片，载玻片，玻片盘，树胶，树胶瓶，显微镜，温度计，脸盆，水浴锅。 切片机，切片刀，温台，恒温箱，解剖刀，镊子，剪刀，解剖针，单面刀片，小台木，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，烧杯，水盆，熔蜡炉，蜡杯。 2．试剂： 中性福尔马林固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、苏木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸酒精溶液，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。 卡诺（Carnoy）固定液，埃利希苏木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸乙醇液，各级酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。 3.材料： 鼠肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织、大豆或小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆的根、茎、叶等。 二、实验原理： 石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。苏木素与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。 三、试剂配法： 1．中性甲醛固定液： 甲醛（37%-40%，市售，本所购买即为此浓度）100mL 磷酸氢二钠 6.5
磷酸二氢钾（钠）4g 双蒸水900mL 2．苏木精、伊红染色液为碧云天产品 3．1%盐酸乙醇液 盐酸1份 70%酒精100份 4．甘油蛋白贴片剂： 蛋白50ml 甘油50ml 水杨酸钠（防腐剂）1g 配制时将鸡蛋一个打破入碗或杯中，去蛋黄留下蛋白，用玻棒调打成雪花状泡沫，然后用粗纸或双层纱布过滤到量筒中，经数小时或一夜，即可滤出透明蛋白液。此时在其中再加等量的甘油，稍稍振摇使两者混合。最后加入防腐剂（水杨酸钠）作防腐用。可保存几个月。 四、实验步骤： 1．取材 颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或其他组织）。 切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10mm×2mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块2－3mm厚。 注意事项： （1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 （2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。2．固定 将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定，固定30－50min。 注意事项： （1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。 （2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。
石蜡切片制作基本技术 实验器材：转动切片机、镊子、解剖刀、解剖针、玻璃缸或小塑料盆、小烧杯（50ml）、酒精灯、打火机、染色缸、吸管、温台、温箱、毛笔、纱布、双面刀片。 试剂：95%的乙醇、无水乙醇、二甲苯、甲醛、石碳酸、甘油、新鲜鸡蛋清、加拿大树胶、番红、铬绿、熔点48~50℃和56~58℃的石蜡。 其它：无水CaCl2 、铁帆、苏木精、重铬酸钾、浓硫酸 石蜡切片制作基本技术：石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、 浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 1.取材应根据要求选取材料来源及部位。采下的标本要注意保湿，冲洗干净后截取大小合适的样品迅速投入固定液中。（注意材料切割形状以便于包埋，尤其植物叶片横纵切面） 2.固定卡诺氏固定液（无水乙醇：冰醋酸=3：1）固定24h，70%酒精保存。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。 3.洗涤与脱水从50％开始→70％→85％→95％→无水乙醇（30min）（此步骤需两遍），每次时间为1～2h；如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70％酒精中保存。脱水乙醇的用量为材料体积的3~5倍。 无水乙醇中要加入不含结晶水的CaCl2 ；用95%的乙醇配制各级脱水乙醇（原浓度95%,要配浓度y%,则取yml95%乙醇加上95-y=？ml蒸馏水即可）。 4.透明经1/2无水乙醇+1/2二甲苯（氯仿）至纯二甲苯（氯仿）两级透明，每级停留2h。在1/2无水乙醇+1/2二甲苯时加入少量番红干粉。 5.浸蜡在浸入有植物材料的透明剂中投入切成小块的低熔点石蜡，加入石蜡的量溶入透明剂的用石蜡溶液=透明剂体积为原则。用浮石蜡（石蜡放入容器中，水浴熔融，取出石蜡，冷却时不断用玻璃棒搅拌，空气进入，冷却后即为浮石蜡）。加蜡后放有材料的有盖容器放入35℃的温箱中6h或更长时间。之后调高温度至56℃，打开盖子让透明剂蒸发，2h后将石蜡溶液倾去。将植物材料移入高熔点的熔融纯石蜡小烧杯中，2~4h再换一次熔融纯石蜡，2~4h即可进行包埋。 6.包埋、切片和粘片 （1）折包埋纸盒； （2）材料包埋：熔融的石蜡到入纸盒中，用在酒精灯上烧热的镊子或解剖针将材料排好（快速，避免石蜡结晶），然后将包埋纸盒放入冷水中冷却凝固。（3）修蜡：每块拉一个材料，双面刀片切开。 （4）粘蜡快：2*2*2.5~3cm的长方形木块，长轴一端刻出网格；木块具网格一端浸入已溶化的废石蜡中，蜡块修成下宽上窄的台体，用烧热的解剖针一面贴
石蜡切片制作 大致步骤：取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 1、取材 植物材料选择时必须尽可能不损伤植物体或所需要的部分。 取材必须新鲜，尽可能割取所需要的组织块，并随即投入固定液。 取材时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。 切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5*5mm2。 2、固定 用适当的化学药液—固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。 固定液的选用：FAA固定液 FAA固定液配制：福尔马林（38%甲醛）5 ml 冰醋酸 5 ml 70%酒精 90 ml 5 ml甘油（丙三醇） 固定时间根据材料块的大小及松密程度而定。 3、洗涤与脱水 固定后的组织材料需要除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗：使用含有苦味酸的固定液固定的则需要用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。 酒精为常用的脱水剂，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1-数小时，如不能及时进行脱水，材料可以放在70%酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化。 4、透明 选用二甲苯为酒精和石蜡的浸媒液，替换出组织内的酒精。通常组织先经过纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1-2小时，再转入纯透明剂中浸渍。时间根据材料块大小而定。 5、浸蜡与包埋 用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1-2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利于石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含有杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。 6、切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为 4-7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。 7、贴片与烤片
一一、首先是开场白： 各位老师，上午好！我叫……，是……级……班的学生，我的论文题目是……。论文是在……导师的悉心指点下完成的，在这里我向我的导师表示深深的谢意，向各位老师不辞辛苦参加我的论文答辩表示衷心的感谢，并对四年来我有机会聆听教诲的各位老师表示由衷的敬意。下面我将本论文设计的目的和主要内容向各位老师作一汇报，恳请各位老师批评指导。 二、内容 首先，我想谈谈这个毕业论文设计的目的及意义。…… 其次，我想谈谈这篇论文的结构和主要内容。 本文分成……个部分. 第一部分是……。这部分主要论述…… 第二部分是……。这部分分析…… 第三部分是…… 三、结束语 最后，我想谈谈这篇论文和系统存在的不足。 这篇论文的写作以及修改的过程，也是我越来越认识到自己知识与经验缺乏的过程。虽然，我尽可能地收集材料，竭尽所能运用自己所学的知识进行论文写作，但论文还是存在许多不足之处，有待改进。请各位评委老师多批评指正，让我在今后的学习中学到更多。 谢谢！ 四、老师提问 答辩的准备工作学生可以从下列问题（第4~10题）中，根据自己实际，选取二三个问题，作好汇报准备，（第1~3题必选）。时间一般不超过10分钟。内容最好烂熟于心中，不看稿纸，语言简明流畅。 1．为什么选择这个课题（或题目），研究、写作它有什么学术价值或现实意义。 2．说明这个课题的历史和现状，即前人做过哪些研究，取得哪些成果，有哪些问题没有解决，自己有什么新的看法，提出并解决了哪些问题。 3．文章的基本观点和立论的基本依据。 4．学术界和社会上对某些问题的具体争论，自己的倾向性观点。 5．重要引文的具体出处。 6．本应涉及或解决但因力不从心而未接触的问题；因认为与本文中心关系不大而未写入的新见解。 7．本文提出的见解的可行性。 8．定稿交出后，自己重读审查新发现的缺陷。 9．写作毕业论文（作业）的体会。 10．本文的优缺点。总之，要作好口头表述的准备。不是宣读论文，也不是宣读写作提纲和朗读内容提要。学生答辩注意事项 1．带上自己的论文、资料和笔记本。 2．注意开场白、结束语的礼仪。 3．坦然镇定，声音要大而准确，使在场的所有人都能听到。 4．听取答辩小组成员的提问，精神要高度集中，同时，将提问的问题——记在本上。 5．对提出的问题，要在短时间内迅速做出反应，以自信而流畅的语言，肯定的语气，不慌不忙地—一回答每个问题。 6．对提出的疑问，要审慎地回答，对有把握的疑问要回答或辩解、申明理由；对拿不准的问题，可不进行辩解，而实事求是地回答，态度要谦虚。 7．回答问题要注意的几点： （1）正确、准确。正面回答问题，不转换论题，更不要答非所问。
2. 取材 取材时，最好用徒手切片等方法，检查一下材料的内部结构是否适合需要，不理想时，再重新取材。 要点： （1）在符合观察要求的情况下，材料越小越好，体积尺寸一般不超过0.5cm。 （2）进行科研用的，材料样本数量要符合统计学的需要，并留有充分的余地。 （3）有特殊需要的材料，如茎尖纵切要看腋芽等结构的，要将材料作好标记——两侧削扁，切片时才有方向性。 （4）材料取下后要设法保持材料的新鲜。材料取好后要立即固定。 3. 固定（FAA者可免） FAA固定液的配置：（50-70%乙醇90ml+冰醋酸5ml+37-40%甲醛（即福尔马林）5ml），常温下至少24hr或更长（视材料厚薄、大小而定）。固定后一般的材料都可以在此液中于冰箱长期保存。 要点：①固定液的体积为材料体积的20-50倍；②固定液开始浸泡时，要对材料抽气， 5. 脱水 材料完成“冲洗”后，将材料上多余的水尽量除去，然后进入第一级脱水剂中。脱水剂的浓度分为6-7级，从低到高逐级进行，每级脱水约2小时。材料小和嫩的脱水时间可以缩短，材料大和硬（木质化程度高的）脱水的时间可以长一些，需要多总结经验。脱水过程长，尤其是在高浓度脱水剂中的时间长，材料会变脆，不利于切片，见下表。 注意：用FAA固定的材料，因不经“冲洗”，可以直接从2级脱水剂开始脱水。 注意：脱水剂用量不少于材料体积的5倍。叔丁醇脱水所要求的温度，以叔丁醇不凝固 材料进入无水的脱水剂中后，若脱水剂变浑浊，说明材料中的水分未脱干净，必须回到 7. 浸蜡（透蜡） 材料从叔丁醇脱水后进入装有适量融化的叔丁醇（恒温箱最好从36-40度缓慢升到56-60℃，透蜡的效果才好）的蜡管中，在蜡管中逐渐多次加入碎蜡（熔点48-50℃），直至
HE染色封固时出现的问题及解决方法 支喜兰1 谭德银2 (1西安解放军323医院病理科 710054 2陕西省高级人民法院司法技术室病理组)【中图分类号】 R361.2 【文献标识码】 B 【文章编号】1007-8096(2000)04-0303-01 要获得一张满意的HE切片,除与取材、切片、染色关系密切外,封固也是很重要的一个步骤。我们在观察切片中,发现有许多与封固有直接关系的质量问题,影响病理诊断。作者根据多年的制片经验,就封固中出现的问题进行总结: 1 类似色素样颗粒(俗称空气色素) 即在封固干燥后,切片中出现类似色素样颗粒,散在或呈片状,圆形或不规则形,易被误认为黑色素或甲醛色素沉着。但这种类似色素样的物质分布无规律,可在任何组织切片中出现。其产生的原因是切片染色后,封固时切片中的二甲苯已完全挥发,中性树胶封固剂不能完全封固而形成的组织片干燥的空气气泡或腔隙。 1.1 导致气泡或腔隙产生的诱因 1.1.1 操作者为了减少二甲苯的吸收,习惯于将切片从二甲苯中取出,待二甲苯挥发后再封固。或切片很多,封固开始并未出现此情况,待二甲苯基本挥发或完全挥发,组织干燥后封固可出现。 1.1.2 树胶封固剂过稀,封固当时并不出现,当封固干燥或待二甲苯挥发后可出现上述情况。 1.1.3 树胶封固剂粘稠时,滴加的封固剂不能完全覆盖切片所致。 1.2 解决方法 1.2.1 封固时,当切片中二甲苯挥发后,应重新放入到二甲苯中透明。 1.2.2 调整树胶封固剂的浓度,不能过于粘稠或过稀。以细玻璃棒蘸树胶,拿起成滴状,滴速2～3滴/sec适中。 2 形成气泡 气泡是封固切片中最常见的问题,直接影响病理观察。 2.1 形成气泡的原因2.1.1 切片厚薄不均,主要是组织纤维成分多,切片困难,或切片刀不锋利,切片形成搓板样结构,切片不平整所致。 2.1.2 捞片水温低,切片未完全展开,或在捞片过程中,水底产生气泡漂浮于组织片上而形成。 2.1.3 树胶封固剂过稀或过于粘稠均可引起。 2.1.4 封固方法不当,在封固时,有些操作者习惯于用手拿着盖玻片,平放于滴了树胶的组织切片上所致。 2.2 解决方法 2.2.1 封固时用镊子夹起盖玻片,先一侧放置于滴有树胶的组织切片上,然后缓慢放下将空气完全排除。 2.2.2 调整树胶封固剂的浓度及水的温度。 2.2.3 根据组织的取材适当缩短或延长组织脱水时间。 3 切片中出现云雾现象 有时在切片中出现模糊一片的云雾,组织结构不清,严重影响观察。其产生原因是染色封固时,切片内有水分所致。 3.1 形成的原因 3.1.1 组织取材太厚,脱水不净,导致切片厚薄不均,影响封固质量。 3.1.2 组织固定液及脱水剂时间过长,未及时更换,影响组织脱水。 3.1.3 切片染色时,封固前脱水不净,致使切片不能透明,封固后出现云雾现象。 3.2 解决方法 组织取材厚度适中,及时更换脱水机的各种试剂和各种染色试剂。尤其是染色过程中,切片进入二甲苯透明前一定要脱水彻底,即可避免产生切片的质量问题。 以上方法适用于所有需要封固的组织。 (收稿1999-10-28 修回1999-12-13) 常规石蜡切片中浸蜡包埋方法的改进 弯雪燕 景春果 张晓辉 (山西省闻喜县东镇541医院 043801) 【中图分类号】 R361.2 【文献标识码】 B 【文章编号】1007-8096(2000)04-0303-02 病理技术的常规工作是制片。其程序一般是对取材组织进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、封固。每一操作环节的好坏,都会影响制片质量。其中,浸蜡、包埋则是制片过程中手工操作较复杂而又重要的一个环节。目前大部分医院在病理制片过程中,尚未能完全取代手工操作。为确保制片质量,提高效率,避免差错,我们对多年沿用的浸蜡、包埋方法和步骤进行了改进,取得了满意的效果,现介绍如下。 1 材料与方法 1.1 材料 单孔或多孔恒温水浴箱1台,自制浸蜡包埋框、小镊子和其他常用包埋用具。 ? 3 3 ? 诊断病理学杂志2000年12月第7卷第4期
石蜡切片基本步骤 （一）取材和固定 根据实验目的选择材料。将整个虫体或虫体的内部器官（如肠道、马氏管、唾液腺等）取出后，立即投入固定液。 取材大小：0.5cm×0.5 cm×0.2或者1.0 cm×1.0 cm×0.2，厚度不宜超过3mm。 固定液：2.5%的戊二醛固定液，Bouin氏液，10%甲醛等。 固定时间：4oC固定24小时。 注意事项： 取材：1．勿使组织块受挤压切取组织块所用刀、剪要锋利，切割时不可来回切割。夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压，以免损伤组织。取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。 2.选好组织块的切面应熟悉器官组织的组成，并根据观察目的来确定纵切或横切。 3．保持材料的清洁组织块上如有血液、污物、粘液、食物等，先用生理盐水冲洗干净，再入固定液。 4．切除（清除）不需要的部分特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。 固定：1．材料新鲜取出组织后须立即固定。否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发生自溶现象。 2．抽气生物组织常有气体的存在，使材料不能沉入固定液中，抽气使得固定液有效渗入。真空泵抽气或者用空针管抽气。昆虫整体固定，固定前用解剖针刺数个小孔，以利用固定液渗透。 3．固定剂用量一般为组织体积的10~20倍。勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗入。 4．避免阳光尽可能避免接触阳光以免失去固定作用。 5．加速固定轻轻摇动盛器使组织移动有利于固定液渗入，对长期固定的标本可经常更换固定液。
（二）洗涤 2.5%戊二醛固定液固定的组织：0.2M, pH7.2磷酸缓冲液漂洗三次，每次10min Bouin氏固定液固定的组织：直接入70%酒精更换数次即可脱水，注意苦味酸。 甲醛固定的组织：直接投入50%或70%酒精脱水，不经水洗。但如果在甲醛中时间过长，则仍应当用流水冲洗。 陈旧性标本和混合性固定液应及时洗涤，有利于脱水、切片和染色。否则会影响以后的染色效果。 （三）脱水与透明 漂洗后即入酒精脱水，经50%，70%，80%，90%，95%，100%酒精脱水，其中95%，100%酒精需重复两次。每级10min。 脱水后，入1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯，每次约10min，至组织透明为止。 注意： 1. 一般经水洗的材料脱水可从35%开始，柔弱的材料从15%开始，若用酒精洗涤，则可直接移入50%或70%酒精中继续脱水。 2. 每级脱水时间，依照材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。动物组织每级10~30min。 3. 脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水且效果不好；如需过夜，则停留在70%酒精中。 （四）透蜡 透明后，先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍3小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍6小时左右，直至用石蜡完全置换了组织块中的二甲苯，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右（60°C）的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。便于今后的包理与切片。
组织块石蜡包埋的步骤： 1.取材：尽量活杀，在处死30min内取材完毕，组织块的大小一般为（1.0-1.5cm） *1.0cm*(0.2-0.3cm) 2.固定：常用甲醛液浓度为4%，是40%甲醛溶液和水按1:9比例配制而成。固定时间 以12-24h为宜。（4℃冰箱可放置1-3个月） 3.冲洗：将组织块放在固定的容器中用流水冲洗24h. 4.脱水：一次70%酒精2h, 80%酒精2h, 90%酒精1h, 95%酒精40min,无水乙醇Ⅰ40min, 无水乙醇Ⅱ30min。可将组织放于70%酒精中过夜。 5.透明：将脱水后组织直接浸入二甲苯透明剂中（二甲苯Ⅰ, 二甲苯Ⅱ），每次透明 为10min。 6.浸蜡：常规制片常用熔点高于56℃以上的石蜡，普通采用56℃-58℃石蜡。先将组 织浸入软蜡Ⅰ1h左右, 再浸入软蜡Ⅱ40min；硬蜡Ⅰ40min, 硬蜡Ⅱ1h。（一般浸蜡 时间为3-4h）软蜡熔点为45℃-50℃，硬蜡熔点为55℃-60℃。 7.包埋：将蜡液注入包埋硬具中，迅速将组织块平放入蜡液中，摆正并铺平，然后移 至冷却台，使组织块同蜡液凝固在一起的过程。（硬蜡凝固定型） 石蜡切片法： 在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（此过程称为“修块”），但也不能留得太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。一般切片厚度为4-6μm。 贴片时先在干净的载玻片上涂一层蛋白甘油，然后于60℃恒温箱中烘烤1h，若未烤干可适当延长时间；若组织剥脱可涂一层蛋清加以固定。 做免疫组化时，玻片应涂多聚赖氨酸，亦可买防脱玻片。 HE染色的步骤： 二甲苯Ⅰ5-10min→二甲苯Ⅱ5-10min→无水乙醇Ⅰ1-3min→无水乙醇Ⅱ1-3min→90%酒精1min→80%酒精1min→70%酒精1min→水洗→苏木精3-5min→水洗→盐酸酒精1-3s→水洗→饱和碳酸锂（氨水）10-30s→水洗→伊红3-5min→水洗（短）→70%酒精1-2s→80%酒精3-5min→90%酒精3-5min→95%酒精3-5min→无水乙醇5-10min→二甲苯Ⅰ3-5min→二甲苯Ⅱ3-5min→中性树胶封片 染色液的配制： 1.Harris苏木精的配制 苏木精 1g 硫酸铝钾 15g 无水乙醇 10ml 蒸馏水 200ml 先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。 2.伊红的配制 伊红 1g
常规石蜡包埋组织切片（常规切片）的制备 ㈠组织块依序进行：①水洗，②脱水，③透明，④浸蜡，⑤包埋和⑥切片。 ㈡组织切片制备及其HE染色过程中使用的乙醇、丙酮、二甲苯、石蜡等为易燃、有毒物，必须专人管理，2m以内不得有明火，局部环境应有良好的通风和消防设施。 ㈢常规切片的手工操作（步骤次序和各步骤的持续时间） 1．水洗：用流水冲洗已经固定的组织块30min。 2．脱水（常温下） （1）乙醇－甲醛（AF）液固定 60~120min （2）80%乙醇 60~120min （3）95%乙醇Ⅰ 60~120min （4）95%乙醇Ⅱ 60~120min （5）无水乙醇Ⅰ 60~120min （6）无水乙醇Ⅱ 60~120min （7）无水乙醇Ⅲ 60min ［注意事项］①未经充分固定的组织不得进入脱水程序。②用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的5～10倍以上。③自低浓度乙醇向高浓度乙醇逐级移进脱水。④脱水试剂应及时过滤、更换（500ml乙醇可用于500个组织块脱水；加入硫酸铜的无水乙醇变蓝时，提示需要更换）。⑤较大组织块的脱水时间长于较小者，应将两者分开进行脱水。⑥组织置于无水乙醇内的时间不宜过长（以免硬化）。⑦丙酮脱水性能强，会使组织块过缩、硬脆，不宜用以替代无水乙醇。 3．透明 （1）二甲苯Ⅰ 20min （2）二甲苯Ⅱ 20min （3）二甲苯Ⅲ 20min ［注意事项］①二甲苯的容积应为组织块总体积的5～10倍以上。②组织块在二甲苯中透明的时间不宜过长（以防组织硬、脆），并依不同种类组织及其大小而异；组织呈现棕黄或暗红色透明即可。③二甲苯应及时过滤、更换。④组织
经二甲苯适度处理后不显透明时，常提示该组织的固定或脱水不充分，应查找原因并妥善处理。 4．浸蜡 （1）石蜡Ⅰ（45~50℃） 60min （2）石蜡Ⅱ（56~58℃） 60min （3）石蜡Ⅲ（56~58℃） 60min ［注意事项］①熔化石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡箱内或水浴中（70 ℃）进行，不得用明火加温。②熔蜡的容积应为组织块总体积的5～10倍以上。③组织块经二甲苯适度透明后方可转入浸蜡过程，应尽可能减少将透明后组织块表面的二甲苯带入熔蜡中。④浸蜡时间适宜，过短时浸蜡不充分（组织过软），过长时组织硬脆。⑤熔蜡应及时过滤、更换。 5．包埋 （1）先将熔化的石蜡倾入包埋模具中，再用加热的弯曲钝头镊子轻轻夹取已经过浸蜡的组织块，使组织块的最大面或被特别指定处的组织面向下埋入熔蜡中；应将组织块平正地置放于包埋模具底面的中央处；包埋于同一蜡块内的多块细小组织应彼此靠近并位于同一平面上；腔壁、皮肤和黏膜组织必须垂直包埋（立埋）。 （2）将与组织块相关的病理号小条置入包埋模具内熔蜡的一侧。 （3）待包埋模具内的熔蜡表面凝固后，即将模具移入冷水中加速凝固。 （4）从包埋模具中取出凝固的包埋蜡块（简称蜡快），用刀片去除组织块周围的过多石蜡（组织块周围保留1~2mm石蜡为宜）。将包埋蜡块修整成为规则的正方形或长方形。 （5）将病理号小条牢固地烙贴在蜡块一侧（编号应清晰可见）。 （6）把修整好的蜡块烙贴在支持器上，以备切片。 （7）使用包埋机的方法按有关厂商的说明书操作。 （8）注意事项 ①应将组织块严格分件包埋。包埋时一定要首先认真核对组织块的病理号（包括亚号）、块数和取材医师对包埋面的要求，准确地包入相应的病理号小条。发生包埋差错时，必须立即与取材医师和病理科当班负责人取得联系，及时处置。
步骤一：取材与固定： 取动物新鲜组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，Bouin氏固定液)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。 步骤一：脱水透明： 一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。 步骤三：浸蜡包埋： 将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。 步骤四：切片与贴片： 将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。 步骤四：脱蜡 常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。 酒精用了2次先有低到高，再有高到低，这是为什么？ 步骤五：染色 HE染色过程是： ①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。 ②酸水及氨水中分色，各数秒钟。 ③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。
1.取材固定: 离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散。固定就是加入一些可以让蛋白质变性的物质(比如说甲醛)，使得蛋白质的结构被固定住，不再发生变化，同时也不会再发生一些活性反应，这样才好做后续的染色步骤。常见固定液是4%的多聚甲醛和饱和苦味酸。根据不同目的、组织特征代表性取材。取的材料应该小而薄。便于固定剂迅速渗入内部，一般厚度不超过2mm，大小不超过5X 5mm"。每个组织最好多切几块。新鲜组织固定(组织块不宜太大太厚，这样固定液很难进入里面，可能会导致在较短的时间内脱水不完全，引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败。组织块也不能太小，否则不能保证切片数量，且透明时间和浸蜡时间不能很好的把握。)固定时间因固定剂种类而异，大多6-12 小时，一般不超过12小时。视组织固定的难易程度而定。后续如果做免疫组化，不应超过12小时;后续如果做HE染色，不应超过24小时。固定完之后用水洗(目的:洗去渗入组织的固定液，终止固定以免影响对组织的内结构的观察，分析。换液两次，一次半小时。) 之后可直接脱水包埋或放入75%的乙醇4度可长期保存。 2.脱水 从75%的乙醇中取出，分别放到80%，90%，100%( I )的乙醇中30min，再放入100%乙醇中。固定完直接水洗包埋的，应从70%乙醇开始，易碎组织从50%乙醇开始。组织脱水时间不应过长，尤其是高浓度乙醇，要特别注意控制时间。 3.透明 透明的目的是置换组织内的脱水剂，为下一步浸蜡起到桥梁作用，二甲苯可以去除脂肪。乙醇+-二甲苯(1:1) 2h；二甲苯(I )，二甲苯(II)各10min(根据组织的大小和透明的难易程度不同，透明的时间可以根据具体情况调整。颜色浅的组织表面油亮，可以透过光时效果较好，颜色较深的组织至少边缘可以透光。) 4.浸蜡 浸蜡目的是置换组织中的透明剂，为包埋作准备。二甲苯+石蜡(1:1)2h；石蜡(I)1h;石蜡(II)2h.(浸蜡的时间也可以长一些) 5.包埋 在冰盒上进行，将融好的纯蜡(最好提前4小时以上开始融蜡，新蜡更难融)，倒入蜡盒(可以浸没组织就行，大约蜡盒的三分之一)由于蜡盒底部与冰盒接触，底部的蜡会先凝固，这样就可以把组织用镊子夹住立在底部。然后继续将蜡盒倒满。待蜡块完全凝固，包埋就完成了。