石蜡包埋和HE染色的制作过程

石蜡切片和HE染色详细步骤石蜡切片和HE染色方法与步骤1(取材颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织(或其他组织)。

切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。

取下所需要的肝组织，切成一小块2,3mm厚。

注意事项:(1)取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。

(2)切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。

2(固定将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定，固定30,50min。

注意事项:(1)一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。

(2)有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。

(3)固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。

(4)材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。

标签上注明固定液、材料来源、日期等。

标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。

3. 脱水50%酒精?70%酒精?80%酒精?95%酒精?100%酒精?100%酒精。

每级0.5h。

注意事项:(1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。

(2)在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。

(3)在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。

(4)在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。

(5)如需过夜，应停留在70%酒精中。

(6)脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象4. 透明1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) ?纯二甲苯(1.5h) ?纯二甲苯(1.5h)。

HE染色是应用最广泛的组织病理学常规染色技术。

㈠染色程序1．石蜡切片HE染色（常规HE染色）（1）二甲苯Ⅰ 5～10min（2）二甲苯Ⅱ 5～10min（3）无水乙醇Ⅰ 1～3min（4）无水乙醇Ⅱ 1～3min（5）95%乙醇Ⅰ 1～3min（6）95%乙醇Ⅱ 1～3min（7）80%乙醇 1min（8）蒸馏水 1min（9）苏木素液染色 5～10min（10）流水洗去苏木素液 1min（11）1%盐酸-乙醇 1～3s（12）稍水洗 1～2s（13）返蓝（用温水或1%氨水等） 5～10s（14）流水冲洗 1～2min（15）蒸馏水洗 1～2min（16）0.5%伊红液染色 1～3min（17）蒸馏水稍洗 1～2s（18）80%乙醇 1～2s（19）95%乙醇Ⅰ 2～3min（20）95%乙醇Ⅱ 2～3min（21）无水乙醇Ⅰ &, nbsp; 3～5min（22）无水乙醇Ⅱ 3～5min（23）石炭酸-二甲苯 3～5min（24）二甲苯Ⅰ 3～5min（25）二甲苯Ⅱ 3～5min（26）二甲苯Ⅲ 3～5min（27）中性树胶封固注：①（12）和（13）项可省去，但（14）的冲水时间需延长至10～15min（细胞核显示更清晰）。

②（23）项可用无水乙醇代替；北方地区可省略。

2．冰冻切片HE染色（1）冰冻切片固定 10～30s（2）稍水洗 1～2s（3）苏木素液染色（60℃） 30～60s（4）流水洗去苏木素液 5～10s（5）1%盐酸-乙醇 &n, bsp; &nbs, p; &nb, sp; 1～3s（6）稍水洗 1～2min（7）返蓝（用温水或1%氨水等） 5～10s（8）流水冲洗 15～30s（9）0.5%伊红液染色 1～2min（10）蒸馏水稍洗 1～2min（11）80%乙醇 1～2min（12）95%乙醇 1～2min（13）无水乙醇Ⅰ 1～2min（14）无水乙醇Ⅱ 1～2min（15）石炭酸-二甲苯 2～3min（16）二甲苯Ⅰ 2～3min（17）二甲苯Ⅱ 2～3min（18）中性树胶封固注：①（7）和（8）项可省去，但（9）的冲水时间需延长至10～15min（细胞核显示更清晰）。

组织块石蜡包埋的步骤：1.取材：尽量活杀，在处死30min内取材完毕，组织块的大小一般为（1.0-1.5cm）*1.0cm*(0.2-0.3cm)2.固定：常用甲醛液浓度为4%，是40%甲醛溶液和水按1:9比例配制而成。

固定时间以12-24h为宜。

（4℃冰箱可放置1-3个月）3.冲洗：将组织块放在固定的容器中用流水冲洗24h.4.脱水：一次70%酒精2h, 80%酒精2h, 90%酒精1h, 95%酒精40min,无水乙醇Ⅰ40min,无水乙醇Ⅱ30min。

可将组织放于70%酒精中过夜。

5.透明：将脱水后组织直接浸入二甲苯透明剂中（二甲苯Ⅰ, 二甲苯Ⅱ），每次透明为10min。

6.浸蜡：常规制片常用熔点高于56℃以上的石蜡，普通采用56℃-58℃石蜡。

先将组织浸入软蜡Ⅰ1h左右, 再浸入软蜡Ⅱ40min；硬蜡Ⅰ40min, 硬蜡Ⅱ1h。

（一般浸蜡时间为3-4h）软蜡熔点为45℃-50℃，硬蜡熔点为55℃-60℃。

7.包埋：将蜡液注入包埋硬具中，迅速将组织块平放入蜡液中，摆正并铺平，然后移至冷却台，使组织块同蜡液凝固在一起的过程。

（硬蜡凝固定型）石蜡切片法：在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（此过程称为“修块”），但也不能留得太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。

一般切片厚度为4-6μm。

贴片时先在干净的载玻片上涂一层蛋白甘油，然后于60℃恒温箱中烘烤1h，若未烤干可适当延长时间；若组织剥脱可涂一层蛋清加以固定。

做免疫组化时，玻片应涂多聚赖氨酸，亦可买防脱玻片。

HE染色的步骤：二甲苯Ⅰ5-10min→二甲苯Ⅱ5-10min→无水乙醇Ⅰ1-3min→无水乙醇Ⅱ1-3min→90%酒精1min→80%酒精1min→70%酒精1min→水洗→苏木精3-5min→水洗→盐酸酒精1-3s→水洗→饱和碳酸锂（氨水）10-30s→水洗→伊红3-5min→水洗（短）→70%酒精1-2s→80%酒精3-5min→90%酒精3-5min→95%酒精3-5min→无水乙醇5-10min→二甲苯Ⅰ3-5min→二甲苯Ⅱ3-5min→中性树胶封片染色液的配制：1.Harris苏木精的配制苏木精 1g硫酸铝钾 15g无水乙醇 10ml蒸馏水 200ml先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。

蜡块包埋、冰冻切片及HE染色技术【实验目的】了解蜡块包埋切片、冰冻切片及HE染色的应用范围，了解染色的原理，掌握其操作方法。

【实验原理】切片法，是利用锐利的刃具将组织切成极薄的片层，材料须经过一系列特殊的处理，如固定、脱水、包埋、切片、染色等，过程十分繁复。

在制作过程中，还要经过一系列的物理和化学的处理，这些处理方法可根据各种不同材料的性质要求进行合理选择。

切片法虽然工序繁琐，技术复杂，但是，它最能保持细胞间的正常的相互关系，能较好和较长时间地保留细胞的原貌，所以仍然是光学显微镜的主要制片方法。

【实验仪器、材料和试剂】（一）仪器：石蜡切片机、恒温蜡箱、载玻片、盖玻片（二）材料：洋葱根或小鼠肝（三）试剂：福尔马林溶液（甲醛含量为35%至40%(一般是37%)的水溶液，也加入10%—15%的甲醇防止聚合）、苏木精、伊红、无水乙醇、1%盐酸-酒精（70%酒精99ml+浓HCl 1ml）、二甲苯、石蜡、加拿大树胶A：0.5~1% 的伊红酒精溶液：称取伊红Y 0.5~1 g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。

以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。

B：苏木素染液配方：(配制3000 ml，可按比列减少) 苏木精 6 g无水乙醇 100 ml硫酸铝钾 150 g蒸馏水 2000 ml碘酸钠 1.2 g冰醋酸 120 ml甘油 900 ml配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。

【方法与步骤】光学显微镜切片制作技术最简单的切片法是徒手切片，但是由于组织块往往十分柔软，切削很困难，而且无法得到十分菲薄的切片，因此必须先用某些特殊物质渗入组织块的内部起支持作用，并将整个组织块包住，然后再用精密的切片机制作切片，才能获得良好的效果。

这种方法称为包埋法，包埋的物质称为包埋剂。

石蜡包埋H-E 染色法一、固定（12-24小时）免疫组化实验要求固定不超过24h，4℃保存可延长时间。

1、磷酸缓冲中性甲醛（10%）免疫组化。

甲醛原液100ml蒸馏水900mlNaH2PO4·H2O 4gNa2HPO4 6.5g固定24-72小时，流水冲洗（过夜），酒精脱水的起始浓度为30%。

2、4%多聚甲醛多聚甲醛4g蒸馏水100ml加温至60ºC左右，不时搅拌，成为乳白色液体。

再一滴滴地加2N NaOH, 并不时搅动，直到液体清明。

此时pHO高，需用1N HCL 使成中性（pH7.0-7.4）滴加时避免过酸或过碱，反复滴加影响甲醛液浓度。

3、4%多聚甲醛/0.1M磷酸缓冲液多聚甲醛4g0.1M磷酸缓冲液pH 7.2 100ml配法同上。

4、2.5%戊二醛/0.1M磷酸缓冲液25%戊二醛1ml0.1M磷酸缓冲液pH7.2-7.4 9ml二、脱水、透明1、由50%（1h）酒精开始，经70%(1h)、80%(1h)、90%(40min)、95%(40min)、100%(40min)×3，组织块要求2.5-3mm厚，3×3大小。

在3-5mm时，各级3-6小时，或稍大的在5-12小时，至一天。

70%内可长期保存。

在95%和100%酒精中时间不宜过长。

2、纯二甲苯透明20mi n×2.二甲苯透明，先经过无水酒精—二甲苯混合液（20min）在经过二甲苯（30min）混合液：1、无水酒精：二甲苯=2：1；（精细切片经过1、2、3，一般为2）2、无水酒精：二甲苯=1：1；3、无水酒精：二甲苯=1：2；三、浸蜡、包埋2.5mm厚动物组织石蜡20mi n×3缸 .58-60℃石蜡人组织30min×3缸.均在恒温箱内进行, 浸蜡温度是石蜡刚融化的温度，65℃。

包埋温度在70-72℃。

一般厚约5mm的实质器官，总的浸蜡时间为2-3小时二甲苯：溶蜡=1：1 30min (稍长也可)第一杯溶蜡60min第二杯溶蜡60min第三杯溶蜡30min , 然后用此杯溶蜡包埋四、切片与贴片甩干水后放入烤箱60-62℃， HE烤30min,免疫片子烤2h.烘烤至蜡片呈半透明状蜡块修整，切片5-10um.可用蛋白甘油混合液贴片，将已切离的蜡片担个的放在已涂蛋白甘油并已加有数滴蒸馏水的载波片上，然后在酒精灯上摇晃烘烤，此时注意控制水的温度勿过高，待蜡片平整后倾去片上的水。

组织块石蜡包埋的步骤：1.取材：尽量活杀，在处死30min内取材完毕，组织块的大小一般为（1.0-1.5cm）*1.0cm*(0.2-0.3cm)2.固定：常用甲醛液浓度为4%，是40%甲醛溶液和水按1:9比例配制而成。

固定时间以12-24h为宜。

（4℃冰箱可放置1-3个月）3.冲洗：将组织块放在固定的容器中用流水冲洗24h.4.脱水：一次70%酒精2h, 80%酒精2h, 90%酒精1h, 95%酒精40min,无水乙醇Ⅰ40min, 无水乙醇Ⅱ30min。

可将组织放于70%酒精中过夜。

5.透明：将脱水后组织直接浸入二甲苯透明剂中（二甲苯Ⅰ, 二甲苯Ⅱ），每次透明为10min。

6.浸蜡：常规制片常用熔点高于56℃以上的石蜡，普通采用56℃-58℃石蜡。

先将组织浸入软蜡Ⅰ1h左右, 再浸入软蜡Ⅱ40min；硬蜡Ⅰ40min, 硬蜡Ⅱ1h。

（一般浸蜡时间为3-4h）软蜡熔点为45℃-50℃，硬蜡熔点为55℃-60℃。

7.包埋：将蜡液注入包埋硬具中，迅速将组织块平放入蜡液中，摆正并铺平，然后移至冷却台，使组织块同蜡液凝固在一起的过程。

（硬蜡凝固定型）石蜡切片法：在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（此过程称为“修块”），但也不能留得太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。

一般切片厚度为4-6μm。

贴片时先在干净的载玻片上涂一层蛋白甘油，然后于60℃恒温箱中烘烤1h，若未烤干可适当延长时间；若组织剥脱可涂一层蛋清加以固定。

做免疫组化时，玻片应涂多聚赖氨酸，亦可买防脱玻片。

HE染色的步骤：二甲苯Ⅰ5-10min→二甲苯Ⅱ5-10min→无水乙醇Ⅰ1-3min→无水乙醇Ⅱ1-3min→90%酒精1min→80%酒精1min→70%酒精1min→水洗→苏木精3-5min→水洗→盐酸酒精1-3s→水洗→饱和碳酸锂（氨水）10-30s→水洗→伊红3-5min→水洗（短）→70%酒精1-2s→80%酒精3-5min→90%酒精3-5min→95%酒精3-5min→无水乙醇5-10min→二甲苯Ⅰ3-5min→二甲苯Ⅱ3-5min→中性树胶封片染色液的配制：1.Harris苏木精的配制苏木精 1g硫酸铝钾 15g无水乙醇 10ml蒸馏水 200ml先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。

骨组织石蜡切片制作步骤：1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓冲液内固定12—24h。

2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h.3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2 次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。

4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。

5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I 1小时，石蜡II 1小时。

6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。

7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。

免疫组化检测步骤：1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min 二甲苯1（10min）二甲苯2（10min）。

2.水化：100%酒精1（2min） 100%酒精（2min） 95%酒精（2min） 80%酒精（2min） 70%酒精(2min) 。

3.PBS冲洗3次，每次5min.。

4.抗原修复：将组织片置0.01M的柠檬酸缓冲液（PH6.0）中煮沸15min ,自然冷却至室温。

5.PBS冲洗3次，每次5min。

6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活性。

7.PBS冲洗3次，每次5min。

8.滴加1抗（GFP 1：100稀释, 4℃过夜）9.PBS冲洗3次，每次5min。

10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min, PBS冲洗3次，每次5min。

11. 滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min, PBS冲洗3次，每次5min。

12.DAB显色5min。

13.自来水冲洗10min。

14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。

15.自来水冲洗10min。

“HE 染色过程”
试验前准备: 4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片
试剂名称:无水乙醇,氨水,冰乙酸,盐酸,二甲苯,中性树胶，HE 染液
配制试剂:
1%盐酸乙醇分化液配制：
36%—38%盐酸：1ml
75%乙醇：99ml
1、0.2%氨水配制:
25%—28%氨水：0.2ml
自来水：100ml
pH 值在7.5—8之间
试验过程：记录试验的具体步骤，
1，烤片：2小时，温度60℃（目的：使组织切片与载玻片贴合的更加紧密）
2.切片脱蜡至水：
①二甲苯Ⅰ：10min
②二甲苯Ⅱ：10min
③无水乙醇Ⅰ：5min
④无水乙醇Ⅱ：5min
⑤95%乙醇：2min
⑥90%乙醇：2min
⑦80%乙醇：2min
⑧70%乙醇：2min
⑨自来水洗：2min
3.染色：
①苏木精染色：10min
②自来水洗：1min
③1%盐酸乙醇分化：数秒
④自来水洗：1min
⑤0.2%氨水返蓝：30s±
⑥自来水洗：1min
⑦伊红染色：5min
⑧自来水洗：速洗
4. 37℃烘干0.5h以上，中性树胶封固。

组织的石蜡包埋与切片一、石蜡包埋（1）取材。

将需要石蜡包埋的组织取下，并放入1×PBS 中清洗。

（2）组织固定。

将组织放入4%多聚甲醛（或4%甲醛）中固定24 小时至48 小时。

（3）逐级酒精脱水。

75%酒精→ 85%酒精→ 95%酒精I→ 95%酒精II→ 100%酒精I→ 100%酒精II，将组织块在各级酒精中浸泡1 小时，脱去组织中的水分。

（4）二甲苯透明。

二甲苯I → 二甲苯II 各15 分钟，或适当延长二甲苯浸泡时间，直至组织透明为止。

（5）浸蜡。

将淋巴结组织及其标签按顺序依次放入液体石蜡中（60℃孵育箱），依次浸润石蜡I → 石蜡II → 石蜡III，分别浸润20 至30 分钟（可依据组织的大小调整浸蜡时间）。

（6）包埋。

将已经充分浸润液体石蜡的组织进行包埋，包有组织的石蜡块自然冷却并凝固后存放于4℃冰箱。

二、组织切片（7）使用leica 切片机进行组织切片，每张切片的厚度约为4 至5 μm。

（8）将含有组织的石蜡切片放于39~40℃水浴锅，使组织切片充分展开。

（9）使组织切片贴于载玻片上，避免气泡产生。

（10）烤片。

把已贴有组织的载玻片放在60ºC 烤箱中过夜，可观察到玻片上的石蜡溶化成泪滴状，准备进行HE 或免疫组织化学染色。

苏木精&伊红染色（Hematoxylin and eosin stain, H&E stain）（1）切片脱蜡至水。

二甲苯I →二甲苯II →二甲苯III 各10 分钟；100%酒精I →100%酒精II → 95%酒精I → 95%酒精II→ 85%酒精→ 75%酒精→蒸馏水各5分钟。

（2）苏木精染细胞核。

苏木精溶液染2~3 分钟后，置于清水中漂洗。

（3）盐酸酒精分色。

显微镜下观察，如果染色过深，用1%的盐酸酒精（75% 酒精配制）脱色数秒，可将胞浆非特异性染色脱去。

（4）返蓝。

将玻片置于蒸馏水中5 分钟，使苏木精着色逐渐变蓝。