石蜡包埋

石蜡包埋技术制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。

而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。

由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。

最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。

常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。

第一节脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。

此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。

一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。

但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。

因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。

第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。

如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。

但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。

经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。

用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。

用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。

一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。

但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。

石蜡切片及HE染色过程一石蜡切片1. 取材: 刀片要求锋利而薄,组织厚度约2—3mm, 大小1.5×1.5×0.2～0.3cm为宜. 取材时间越快越好.2. 固定: 组织取下后应立即放入10%福尔马林(相当于4%甲醛)固定.注意: (1). 固定液量应为组织块体积的40倍.(2) 固定时间固定时间与使用的固定液种类和组织块大小, 温度等有关. 一般为3—24h.(3)固定温度大多可在室温固定, 在低温(4℃)时间应延长.(4)固定容器应大些.3. 漂洗: 流水冲洗2—10h.4. 脱水: 从低浓度酒精到高浓度酒精.70%(数分钟)→80%(60-120’)→90%(60-120’)→95%(60-120’)→95%(60-120’)→100%(60-120’)→100%(6 0-120’).5. 透明: 组织块脱水后必须经过一种既能与酒精混合又能溶解石蜡的溶剂, 而使石蜡进入组织块. 常用二甲苯, 一般浸泡30m即可.6. 浸蜡: 组织经透明后在熔化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡. 一般需经2—3次浸渍才能完成, 总时间为3—4h. 用于浸蜡的石蜡熔点为52—56℃.7. 包埋: 先将熔化的石蜡倒入包埋框再用加热的镊子将组织块放入. 包埋面必须平整. 包埋后石蜡稍凝后可移入冷水或冰箱中加速凝固.8. 切片: 修块→切片→展片→捞片→烤片.二HE染色1. 染色前切片处理(1) 脱福尔马林色素.(2) 脱汞盐结晶.(3) 脱黑色素.2. 染色步骤二甲苯脱蜡(10’)→ 无水乙醇洗去二甲苯(1’×2次)→95%酒精(1’)→90%酒精(1’)→85%酒精(1’)→自来水洗(2’)→苏木精染色(1—5’)→自来水洗(1’)→1%盐酸酒精分化20s→自来水洗(1’)→稀氨水(1%)反蓝30s→自来水或蒸馏水洗(1’)→伊红染色(20s—5min)→自来水洗(30s)→85%酒精脱水(20s)→90%酒精脱水(30s)→95%酒精(1’)→95%酒精(1’)→100%酒精(2’)→100%酒精(2’)→二甲苯(2’)→中性树胶封片.3. 染色结果: 细胞核呈兰色, 胞浆呈红色.三盐酸酒精的配制浓盐酸0.5—1ml + 75%酒精99ml.此液用一段时间后需延长或更换液体, 新液体分化时间要短.脑组织的石蜡包埋过程中有很多干预因素，一个环节处理的不好就会影响整个实验，我把我们的制作方法说一下，供参考。

一、实验目的1. 掌握石蜡包埋技术的基本原理和操作步骤。

2. 熟悉石蜡包埋在组织切片制作过程中的重要作用。

3. 了解石蜡包埋技术在病理诊断、科研等领域的应用。

二、实验原理石蜡包埋技术是一种常用的组织切片制备方法，其基本原理是将组织固定、脱水、透明、浸蜡后，将其包埋在石蜡中，形成硬化的组织块，便于后续的切片和染色等操作。

石蜡具有较好的透明度和可塑性，且与组织切片易于分离，有利于显微镜观察。

三、实验材料1. 新鲜组织样本：如肿瘤组织、正常组织等。

2. 固定液：4%多聚甲醛溶液。

3. 脱水剂：75%酒精、85%酒精、90%酒精、95%酒精、无水乙醇I、无水乙醇II、醇苯、二甲苯I、二甲苯II、蜡I、蜡II、蜡III。

4. 包埋剂：石蜡。

5. 切片机：石蜡切片机。

6. 其他：手术刀、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、烘箱、显微镜等。

四、实验步骤1. 组织固定：将新鲜组织样本放入4%多聚甲醛溶液中固定24小时以上。

2. 取材：将固定好的组织从固定液中取出，用手术刀将目的部位组织修平整，并切取适当大小的组织块。

3. 脱水：将组织块依次放入75%酒精、85%酒精、90%酒精、95%酒精、无水乙醇I、无水乙醇II中，每个酒精浓度处理1小时。

4. 透明：将组织块放入醇苯中处理5-10分钟，再放入二甲苯I中处理5-10分钟，最后放入二甲苯II中处理5-10分钟。

5. 浸蜡：将组织块放入石蜡I中处理1小时，再放入石蜡II中处理1小时，最后放入石蜡III中处理1小时。

6. 包埋：将浸好蜡的组织块放入包埋模具中，待蜡凝固后取出，修整蜡块。

7. 切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上，切片厚度约为4微米。

8. 摊片：将切片漂浮于摊片机40℃温水上，将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。

9. 脱蜡：将烤干的切片依次放入二甲苯30分钟、无水乙醇10分钟、95%酒精5分钟、90%酒精5分钟、80%酒精中处理。

10. 染色：将脱蜡后的切片进行HE染色或其他染色。

组织块石蜡包埋的步骤：1.取材：尽量活杀，在处死30min内取材完毕，组织块的大小一般为（1.0-1.5cm）*1.0cm*(0.2-0.3cm)2.固定：常用甲醛液浓度为4%，是40%甲醛溶液和水按1:9比例配制而成。

固定时间以12-24h为宜。

（4℃冰箱可放置1-3个月）3.冲洗：将组织块放在固定的容器中用流水冲洗24h.4.脱水：一次70%酒精2h, 80%酒精2h, 90%酒精1h, 95%酒精40min,无水乙醇Ⅰ40min,无水乙醇Ⅱ30min。

可将组织放于70%酒精中过夜。

5.透明：将脱水后组织直接浸入二甲苯透明剂中（二甲苯Ⅰ, 二甲苯Ⅱ），每次透明为10min。

6.浸蜡：常规制片常用熔点高于56℃以上的石蜡，普通采用56℃-58℃石蜡。

先将组织浸入软蜡Ⅰ1h左右, 再浸入软蜡Ⅱ40min；硬蜡Ⅰ40min, 硬蜡Ⅱ1h。

（一般浸蜡时间为3-4h）软蜡熔点为45℃-50℃，硬蜡熔点为55℃-60℃。

7.包埋：将蜡液注入包埋硬具中，迅速将组织块平放入蜡液中，摆正并铺平，然后移至冷却台，使组织块同蜡液凝固在一起的过程。

（硬蜡凝固定型）石蜡切片法：在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（此过程称为“修块”），但也不能留得太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。

一般切片厚度为4-6μm。

贴片时先在干净的载玻片上涂一层蛋白甘油，然后于60℃恒温箱中烘烤1h，若未烤干可适当延长时间；若组织剥脱可涂一层蛋清加以固定。

做免疫组化时，玻片应涂多聚赖氨酸，亦可买防脱玻片。

HE染色的步骤：二甲苯Ⅰ5-10min→二甲苯Ⅱ5-10min→无水乙醇Ⅰ1-3min→无水乙醇Ⅱ1-3min→90%酒精1min→80%酒精1min→70%酒精1min→水洗→苏木精3-5min→水洗→盐酸酒精1-3s→水洗→饱和碳酸锂（氨水）10-30s→水洗→伊红3-5min→水洗（短）→70%酒精1-2s→80%酒精3-5min→90%酒精3-5min→95%酒精3-5min→无水乙醇5-10min→二甲苯Ⅰ3-5min→二甲苯Ⅱ3-5min→中性树胶封片染色液的配制：1.Harris苏木精的配制苏木精 1g硫酸铝钾 15g无水乙醇 10ml蒸馏水 200ml先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。

石蜡包埋机的组成
石蜡包埋机主要由包埋台、冷冻台和保存台三部分构成。

包埋台包括包埋盒和包埋模具，具有定时开机功能，停电后来电仍能自动定时开机。

包埋台、冷冻台和保存台分体式自由排列，全对称设计适合左右不同的用手习惯。

独特的小冷台设计，帮助组织快速定位于包埋模上，防止在包埋时组织因石蜡冲击而改变位置。

另外，它还包括二级石蜡沉淀过滤，以防异物阻塞或污染标本。

包埋作业台前留有未加热的工作台面，可防止蜡液玷污袖口。

大容量的组织盒储存槽，配备折叠推拉盖子，方便取放组织。

此外，还带有放大镜便于包埋极小标本，配有六个镊子加热孔，手动、脚动出蜡控制，球形流量调节阀可精确调节石蜡流量，进口电磁阀，差动式阀门静音不渗蜡，以及大容量熔蜡缸，废蜡槽可装卸。

冷冻台包括照明开关、制冷系统、铰链罩、制冷表面、可调支脚（前支脚和后支脚）。

采用压缩机制冷，可使蜡块快速冷却。

台面有特殊材质镀层处理，容易清洁。

可自由设定温度（室温到零下15℃），建议选择适当的温度，以免蜡块冻裂。

台面可以同时放置70个包埋盒。

保存台则主要用于存放已完成包埋的蜡块，保持其稳定性和完整
性，以便后续的实验或检测使用。

以上是石蜡包埋机的主要组成部分，每个部分都有其独特的功能和作用，共同协作完成石蜡包埋的过程。

石蜡包埋原理
石蜡包埋是一种常用的组织学技术，它可以帮助保护组织结构，使细胞和组织得以保存，为后续的切片和染色提供了可靠的基础。

石蜡包埋的原理主要包括脱水、透明化、浸渍和包埋四个步骤。

首先，脱水是石蜡包埋的第一步，它的目的是去除样本中的水分，使细胞和组织的结构得以保持。

脱水通常采用乙醇逐渐浓度升
高的方法进行，乙醇能够逐渐取代细胞和组织中的水分，使其逐渐
脱水。

脱水的过程需要严格控制时间和温度，以免对细胞和组织结
构造成损伤。

接下来是透明化步骤，透明化是在脱水之后进行的，其目的是
使细胞和组织透明化，为后续的浸渍和包埋做准备。

透明化通常采
用二甲苯或氯仿等有机溶剂进行，这些溶剂能够逐渐取代细胞和组
织中的乙醇，使其逐渐透明化。

透明化的过程同样需要严格控制时
间和温度，以免对细胞和组织结构造成影响。

浸渍是石蜡包埋的第三步，它是将样本逐渐浸入熔化的石蜡中，使细胞和组织与石蜡充分接触，最终被包裹在石蜡中。

浸渍的过程
需要控制石蜡的温度和浸渍时间，以免石蜡温度过高或浸渍时间过
长导致样本变性或破坏。

最后是包埋步骤，包埋是将经过脱水、透明化和浸渍处理的样本，置于包埋模具中，加入熔化的石蜡，使其充分包裹样本，形成石蜡块。

包埋的石蜡块可以为后续的切片提供支撑，并保护细胞和组织结构不受切割时的损伤。

总的来说，石蜡包埋的原理是通过脱水、透明化、浸渍和包埋四个步骤，使细胞和组织得以保存，并为后续的切片和染色提供可靠的基础。

这一技术在组织学研究和临床诊断中具有重要意义，对于保护细胞和组织结构，保证样本质量具有不可替代的作用。

石蜡包埋固定透明脱水浸蜡：4%甲醛固定（过夜）→自来水冲（8h）→70%乙醇（4℃，不超过1周）→80%乙醇（1h）→90%乙醇（1h）→100%乙醇A（1h）→100%乙醇B（1h）→丙酮（30min）→二甲苯A（30min）→二甲苯B（30min）→石蜡A（1h）→石蜡B（1h）→石蜡C（1h）→包埋包埋：1.将蜡块浸于包埋仪蜡槽约30min；2.将包埋框置于蜡槽预热备用；3.取出铁框，装清洁蜡，将组织置于其中，注意平整面朝下；4.将铁框放置于平台，保持组织块在蜡块范围内，平整面朝下；5.将包埋框压于表面，冷却凝固即可；6.蜡块凝固后可掰下放于4℃过夜；7.次日置于-20℃约25min；8.掰下铁框，修正蜡块周边不平整蜡，室温放置备用。

备注：※1：开水浴锅，确认水浴锅启动（摇晃），62.5℃。

※2：此处请务必保证时间的准确性,丙酮用于快速脱水,处理时间过久易使组织收缩硬化;二甲苯透明时间过短，则透明不彻底，石蜡难于浸入组织；透明时间过长，则组织硬化变脆，不易切出完整切片。

※3：提前1.5小时打开包埋仪,待包埋缸石蜡完全熔化后,再将标本框放入浸蜡30min左右,即可进行包埋。

※4：标本框可先在纱布上把试剂扣干之后,再移入下一个试剂,可确保试剂的使用效果及效率。

需注意的细节：1、固定。

新鲜标本放入甲醛（10%福尔马林）24 h～1W（不超过1W），甲醛固定液可重复使用一次。

（附）组织长时间的固定，福尔马林会产生一种酸，影响核的染色。

对于固定很长时间的陈列性标本制片后切片染色不鲜艳，显得非常陈旧。

另外，长时间的固定往往会出现福尔马林色素，尤其是造血器官的标本，更应注意。

固定时间过长，可降低抗原的活性。

2、冲水。

从甲醛中取出包埋块，放入包埋块盒，盖好盖子。

先用自来水冲洗2～3遍，然后用流动自来水冲洗包埋块盒6～8 h，间中移动数次。

3、脱水。

冲洗完后，把包埋块装在一个网兜里，放入70%乙醇，4℃过夜。

石蜡包埋的原理
石蜡包埋是一种常用于组织学研究中的样本处理方法，其原理是利用石蜡的固态性质将组织样本固定在包埋模块内部，使得组织样本可以被切片并进行显微镜观察。

石蜡包埋的具体步骤是：首先，将组织样本进行固定处理，一般是使用缓冲液、酒精等溶液进行固定。

然后，将固定后的组织样本逐渐浸入石蜡溶液中，利用石蜡的渗透性质逐渐替代组织内的水分，使得组织样本逐渐被石蜡取代。

此外，为了使得组织样本更加均匀地包埋在石蜡中，可以采用多次浸渍的方法，即将组织样本依次浸渍在不同浓度的石蜡溶液中。

最后，将浸渍后的组织样本放置于包埋模块中，再倒入石蜡液体，使得组织样本完全浸泡在石蜡中。

随后，石蜡会在常温下快速固化，使得组织样本固定在包埋模块内部。

此时，可以使用切片机将石蜡固化的组织样本切割成薄片，以便进行显微镜观察。

总的来说，石蜡包埋通过利用石蜡的渗透性和固态性质，使得组织样本在石蜡中得以固定和保护，并且可以进行切片制备，为后续的显微镜观察提供方便。