石蜡包埋技术要点总结

石蜡块包埋组织怎么用，一文就够了目前，随着高通量基因和生物信息学发展，常见的高端文章要么是冷冻电镜解析一个结构（大爆发，华人学者一周内发表10篇CNS 主刊！），要么就是大批临床标本的大规模测序识别突变和表达信息（简讯：太牛了！测了2000多肿瘤样本的circRNA数据，怪不得发Cell！）。

实验技术越来越先进，实验思路越来越跨界，而做实验的学生们则越来越迷茫。

为此，本文尝试“温故而知新”，选取了一个最普通基础的主题：石蜡块，来做一次相关内容的汇总。

图源：网络一、组织石蜡块的准备与制作用于制作石蜡块的组织要新鲜，组织固定液为10%中性福尔马林，固定液体积最好为组织体积的10倍以上，如果低于5倍或者只是液体浸没组织，则会导致组织固定不充分，只是表面固定，内部组织随着时间会腐烂，影响结果。

经福尔马林固定的组织并不是能够长时间保存，需要在72小时内尽快完成石蜡块的包埋为最佳，以保证组织蛋白的表达结果不受实验偏倚影响。

如果不能在数天内完成下一步的石蜡块包埋，最好能在4度冰箱冷藏保存，而不宜常温保存。

石蜡块的包埋需要经过脱水和浸蜡。

脱水的质量好坏直径影响后期组织与蜡的相互融合。

此外，石蜡原材料的原则也是至关重要，面对不同的组织，需要动态调整石蜡成分，韧性高的实质组织，可以采用高熔点的石蜡块，而像肠壁和腺体等柔软的组织，可以选较低熔点的石蜡块。

此外，包埋石蜡块的底座平整与否直接影响了标本切片时的损耗。

所以，这里提醒一点：同样的石蜡块组织，可能由于石蜡块底部的坑洼，导致修片过程中大量的损耗了组织。

二、常用制作石蜡块途径（如果是大佬课题组，请直接跳过这段。

）1. 自制优点：几乎没有额外费用，即做即用。

缺点：国内大部分中小规模的实验室或者课题组并没有配套相应石蜡块制作设备。

2. 石蜡块制作外包的选择目前大部分的课题所需石蜡块均为外包途径。

而外包对象主要有两种：专门实验技术公司和大学基础医学病理相关的服务支持。

如何选择呢？专门公司制作石蜡块，第一速度快，毕竟以利益为驱动；第二服务好，一个电话，就可以像寄快递一样，足不出户，上门收货上门送货；第三具有服务行业的优点，除外可能威胁直接经济利益的，其他配套服务，比如提供咨询和配套材料均会免费，毕竟现在国内的专门实验技术公司尚处于市场开展阶段，没有浓重的官僚气或者垄断局面。

石蜡包埋技术制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。

而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。

由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。

最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。

常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。

第一节脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。

此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。

一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。

但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。

因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。

第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。

如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。

但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。

经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。

用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。

用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。

一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。

但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。

组织块石蜡包埋的步骤：1.取材：尽量活杀，在处死30min内取材完毕，组织块的大小一般为（1.0-1.5cm）*1.0cm*(0.2-0.3cm)2.固定：常用甲醛液浓度为4%，是40%甲醛溶液和水按1:9比例配制而成。

固定时间以12-24h为宜。

（4℃冰箱可放置1-3个月）3.冲洗：将组织块放在固定的容器中用流水冲洗24h.4.脱水：一次70%酒精2h, 80%酒精2h, 90%酒精1h, 95%酒精40min,无水乙醇Ⅰ40min,无水乙醇Ⅱ30min。

可将组织放于70%酒精中过夜。

5.透明：将脱水后组织直接浸入二甲苯透明剂中（二甲苯Ⅰ, 二甲苯Ⅱ），每次透明为10min。

6.浸蜡：常规制片常用熔点高于56℃以上的石蜡，普通采用56℃-58℃石蜡。

先将组织浸入软蜡Ⅰ1h左右, 再浸入软蜡Ⅱ40min；硬蜡Ⅰ40min, 硬蜡Ⅱ1h。

（一般浸蜡时间为3-4h）软蜡熔点为45℃-50℃，硬蜡熔点为55℃-60℃。

7.包埋：将蜡液注入包埋硬具中，迅速将组织块平放入蜡液中，摆正并铺平，然后移至冷却台，使组织块同蜡液凝固在一起的过程。

（硬蜡凝固定型）石蜡切片法：在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（此过程称为“修块”），但也不能留得太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。

一般切片厚度为4-6μm。

贴片时先在干净的载玻片上涂一层蛋白甘油，然后于60℃恒温箱中烘烤1h，若未烤干可适当延长时间；若组织剥脱可涂一层蛋清加以固定。

做免疫组化时，玻片应涂多聚赖氨酸，亦可买防脱玻片。

HE染色的步骤：二甲苯Ⅰ5-10min→二甲苯Ⅱ5-10min→无水乙醇Ⅰ1-3min→无水乙醇Ⅱ1-3min→90%酒精1min→80%酒精1min→70%酒精1min→水洗→苏木精3-5min→水洗→盐酸酒精1-3s→水洗→饱和碳酸锂（氨水）10-30s→水洗→伊红3-5min→水洗（短）→70%酒精1-2s→80%酒精3-5min→90%酒精3-5min→95%酒精3-5min→无水乙醇5-10min→二甲苯Ⅰ3-5min→二甲苯Ⅱ3-5min→中性树胶封片染色液的配制：1.Harris苏木精的配制苏木精 1g硫酸铝钾 15g无水乙醇 10ml蒸馏水 200ml先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。

常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。

而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。

由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。

最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。

常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。

第一节脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。

此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。

一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。

但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。

因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。

第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。

如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。

但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。

经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。

用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。

用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。

一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。

石蜡包埋的基本步骤和注意事项第一部分石蜡包埋的基本步骤一、脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。

此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。

一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。

但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。

因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。

第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。

如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。

但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。

经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。

用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。

用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。

一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。

但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。

脱水时间应视组织种类，组织块大小，厚薄和固定剂的不同而异。

如脱钙的骨组织，实质性脏器等的脱水过程宜短，而疏松结缔组织，脂肪组织等，脱水过程则宜适当延长。

水分必须脱干净，脂肪必须溶去。

含有铬酸的固定剂固定的组织，脱水时间不宜过长，而镀银组织更应注意，脱水时间应比为镀银的同类组织要短。

脱水的基本原则：从低浓度酒精开始逐渐升到高浓度酒精，以保持组织中的水分完全脱净。

石蜡包埋的基本步骤和注意事项第一部分石蜡包埋的基本步骤一、脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。

此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。

一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。

但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。

因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。

第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。

如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。

但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。

经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。

用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。

用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。

一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。

但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。

脱水时间应视组织种类，组织块大小，厚薄和固定剂的不同而异。

如脱钙的骨组织，实质性脏器等的脱水过程宜短，而疏松结缔组织，脂肪组织等，脱水过程则宜适当延长。

水分必须脱干净，脂肪必须溶去。

含有铬酸的固定剂固定的组织，脱水时间不宜过长，而镀银组织更应注意，脱水时间应比为镀银的同类组织要短。

脱水的基本原则：从低浓度酒精开始逐渐升到高浓度酒精，以保持组织中的水分完全脱净。

一、石蜡包埋技术石蜡包埋技术制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡、包埋前必须将组织内所含的水分脱去。

常规的石蜡包埋过程包括5 个基本步骤、即固定、脱水、透明、浸蜡和包埋。

1.脱水用脱水剂完全除去固定好的组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件，还可使组织再次形成一定的硬化。

一般情况下组织需经过75％，85％，95％，100% 乙醇的脱水程序。

脱水时间视组织种类，组织块大小，厚薄和固定剂的不同确定。

脱水一定要充分、彻底。

2.透明纯乙醇不能与石蜡相溶，还需用能与乙醇和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的乙醇。

组织在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。

二甲苯和氯仿是常用的透明剂。

组织在氯仿和二甲苯中不宜放置过久，否则会造成组织脆硬，不利切片。

3.浸蜡组织经透明剂的透明作用之后，移入熔化的石蜡内浸渍，石蜡逐渐浸入组织间隙，取代透明剂，这一程序就叫浸蜡。

根据所用石蜡的熔点，浸蜡需要在60 ～62℃温箱内进行。

为了尽可能排除透明剂，浸蜡可以分两缸进行。

浸蜡时间应根据组织种类，组织块大小，厚薄确定，一般为1 ～4 h。

4.包埋是将已经经过固定、脱水、透明、浸蜡的组织块从最后的蜡浴取出，置入充满熔化石蜡的包埋框内，包埋成块，使组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却，这个程序称为包埋。

包埋剂凝固后，进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。

全自动石蜡包埋机包埋组织，采用金属包埋框盒。

通常石蜡采用熔点为60 ～62℃，包埋机设定温度64 ～65℃，先把组织材料放置于金属包埋框底，石蜡放满于金属包埋框内，组织用弯头镊子平整调整到底部，若镊子上的石蜡凝固，在乙醇灯上烤（温度不宜过高，以石蜡熔化为宜，否则将损坏组织）。

组织长径尽量与包埋框盒长径垂直，在石蜡表面发白时，放置塑料蜡块托（边上用铅笔标记病理号），按四角压紧。

待石蜡完全凝固后取出组织蜡块。

石蜡包埋技术制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。

而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。

由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。

最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。

常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。

第一节脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。

此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。

一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。

但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。

因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。

第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。

如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。

但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。

经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。

用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。

用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。

一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。

但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。

石蜡切片的注意事项石蜡切片是一种常见的组织学处理方法，它可以使组织切片变得更加透明，便于显微镜观察和分析。

但是在进行石蜡切片时，需要注意许多事项，以确保切片质量和实验结果的准确性。

下面将从样本处理、石蜡浸渍、包埋、切片和染色等方面详细介绍石蜡切片的注意事项。

一、样本处理1. 样本收集：在进行石蜡切片之前，必须先收集好样本。

样本应该是新鲜的，并且应该根据实验需要制备成合适大小和形状的块。

2. 固定：在进行石蜡切片之前，必须对样本进行固定。

固定方法应该根据不同实验目的选择不同的固定剂，并且固定时间也要控制好。

3. 剖解：在进行石蜡切片之前，还需要对样本进行剖解。

剖解方法应该根据不同实验目的选择不同的方法，并且要注意避免损伤组织结构。

二、石蜡浸渍1. 选择合适的溶剂：在进行石蜡浸渍之前，必须选择合适的溶剂。

不同类型的组织需要使用不同的溶剂，且浸渍时间也要控制好。

2. 温度控制：在进行石蜡浸渍时，需要控制好温度。

过高或过低的温度都会影响石蜡浸渍效果。

3. 石蜡质量：在进行石蜡浸渍时，还要注意石蜡质量。

低质量的石蜡会导致切片变形或断裂。

三、包埋1. 选择合适的模具：在进行包埋时，必须选择合适的模具。

模具应该根据样本大小和形状来选择，并且要注意避免空气泡存在。

2. 石蜡填充：在进行包埋时，还要注意将石蜡填充到模具中。

填充应该均匀，并且要避免产生空隙。

3. 冷却时间：在进行包埋时，还要注意冷却时间。

冷却时间应该根据样本大小和形状来确定，并且要保证完全固化后再进行下一步操作。

四、切片1. 刀片选择：在进行切片时，必须选择合适的刀片。

刀片应该根据样本硬度和大小来选择，并且要保证刀片的锋利度。

2. 切片厚度：在进行切片时，还要注意切片厚度。

切片厚度应该根据实验需要来确定，并且要保证每个样本的切片厚度一致。

3. 切片方向：在进行切片时，还要注意切片方向。

不同类型的组织需要选择不同的切片方向，以便于观察和分析。

五、染色1. 染色剂选择：在进行染色时，必须选择合适的染色剂。

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石蜡包埋原理石蜡包埋是一种常见的生物组织处理方法，广泛应用于病理学和解剖学领域。

它的原理是利用石蜡的渗透性和包埋性，将组织样本固定在所需位置，使其能够被切割成薄片并进行显微镜观察。

下面我们将详细介绍石蜡包埋的原理及其在实验室中的应用。

首先，石蜡包埋的原理是基于石蜡对生物组织的渗透性。

石蜡是一种疏水性物质，能够渗透到生物组织的细胞间隙中，将细胞间的液体逐渐替换掉，使细胞固定在石蜡中。

这样一来，组织样本就能够被有效地固定在石蜡中，不易变形和破坏。

其次，石蜡包埋的原理还涉及到石蜡的包埋性。

石蜡具有较高的熔点和凝固点，能够在较高温度下熔化成液态，然后在常温下迅速凝固成固体。

这种特性使得石蜡能够将组织样本包埋在其中，形成坚固的固体块。

这样一来，我们就能够将组织样本切割成薄片，进行显微镜观察。

在实验室中，石蜡包埋被广泛应用于生物组织的处理和研究。

首先，对于需要进行显微镜观察的组织样本，石蜡包埋能够有效地固定样本，使其能够被切割成薄片。

这样一来，我们就能够观察到组织的细胞结构和细胞器的分布情况，为研究细胞和组织的功能和病理变化提供了重要的依据。

其次，石蜡包埋还能够保护组织样本不受外界环境的影响。

石蜡具有较好的密封性，能够将组织样本包裹在其中，避免其受到空气、水分和细菌的侵蚀。

这样一来，我们就能够更好地保存组织样本，确保其在长期存储和运输过程中不会发生变化和损坏。

总的来说，石蜡包埋是一种重要的生物组织处理方法，其原理是基于石蜡的渗透性和包埋性。

在实验室中，石蜡包埋被广泛应用于生物组织的固定、切割和显微镜观察，为细胞和组织的研究提供了重要的技术支持。

希望通过本文的介绍，能够让大家对石蜡包埋的原理有一个更加深入的了解，为实验室工作提供帮助。

石蜡包埋切片技术实验目的：1、学习石蜡包埋切片技术的基本原理和基本步骤；2、掌握石蜡包埋切片技术。

实验原理：大家在生物学实验时，曾经观察过动物组织和植物组织的切片。

通过光学显微镜，我们可以观察到细胞内部的结构（例如细胞核、细胞质、肌肉组织的横纹等）、细胞相互间的联系以及组织的构成等。

那么，如何来制作这种切片呢？其过程是比较复杂的，我们利用3—4次实验来学习组织切片的制作。

大家知道，我们要在显微镜下研究生物体的内部结构，在自然状态下是无法观察的，因为整个动、植物体大部分都是不透明的，不能直接在显微镜下观察，一定要经过特殊的处理，使要观察的材料先减少它的厚度和体积，使光线能透过才能用显微镜观察。

通常应用的有两种方法：一种是非切片法，即用物理或化学的方法将生物体组织分离成为单个细胞或薄片，例如我们在生物学实验曾做过口腔上皮的观察、洋葱鳞茎表皮的观察。

这种方法的不足之处在于细胞彼此间相互的联系不一定观察到。

另外一种为切片法，即用刀将标本切成薄片。

非切片法比较简单，一学就会，我们这里不作介绍。

切片法也分徒手切片法和切片机切片法。

最简单的切片法是将新鲜植物材料直接用刀切成薄片，称之为徒手切片法。

切片机切片法是用特殊的切片机来切片，切片的厚度可薄到几个微米。

因此，切片机的发明与应用也是细胞学诞生的重要因素。

切片机切组织用的也是刀（切片刀），所要切的组织要有一定的软硬度，如刀切肉（新鲜、冷冻）。

但大部分生物材料比较柔软，所以为了能切出薄片，必须先使所切材料有一定的软硬度。

一些包埋剂可以达到这个目的，如石蜡，它融化时可渗入到组织内部；凝固时，使整个组织有一定的软硬度，正好能切出很薄的切片，故称为石蜡包埋切片法。

另外还有火棉胶包埋切片法（火棉胶做包埋剂）、冰冻切片法（使组织冷冻到一定的硬度）等。

其中最常用的切片方法还是石蜡包埋切片法，我们这里重点学习石蜡包埋切片技术。

实验器材：（一）小鼠、小广口瓶、标签、量筒、烧杯、95%酒精、无水酒精、蒸馏水、手术刀、剪刀、镊子、平皿、石蜡块、滤纸、甲醛液、苦味酸、冰醋酸、移液管、洗耳球。

石蜡切片及HE染色过程一石蜡切片1. 取材: 刀片要求锋利而薄,组织厚度约2—3mm, 大小1.5×1.5×0.2～0.3cm为宜. 取材时间越快越好.2. 固定: 组织取下后应立即放入10%福尔马林(相当于4%甲醛)固定.注意: (1). 固定液量应为组织块体积的40倍.(2) 固定时间固定时间与使用的固定液种类和组织块大小, 温度等有关. 一般为3—24h.(3)固定温度大多可在室温固定, 在低温(4℃)时间应延长.(4)固定容器应大些.3. 漂洗: 流水冲洗2—10h.4. 脱水: 从低浓度酒精到高浓度酒精.70%(数分钟)→80%(60-120’)→90%(60-120’)→95%(60-120’)→95%(60-120’)→100%(60-120’)→100%(6 0-120’).5. 透明: 组织块脱水后必须经过一种既能与酒精混合又能溶解石蜡的溶剂, 而使石蜡进入组织块. 常用二甲苯, 一般浸泡30m即可.6. 浸蜡: 组织经透明后在熔化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡. 一般需经2—3次浸渍才能完成, 总时间为3—4h. 用于浸蜡的石蜡熔点为52—56℃.7. 包埋: 先将熔化的石蜡倒入包埋框再用加热的镊子将组织块放入. 包埋面必须平整. 包埋后石蜡稍凝后可移入冷水或冰箱中加速凝固.8. 切片: 修块→切片→展片→捞片→烤片.二HE染色1. 染色前切片处理(1) 脱福尔马林色素.(2) 脱汞盐结晶.(3) 脱黑色素.2. 染色步骤二甲苯脱蜡(10’)→ 无水乙醇洗去二甲苯(1’×2次)→95%酒精(1’)→90%酒精(1’)→85%酒精(1’)→自来水洗(2’)→苏木精染色(1—5’)→自来水洗(1’)→1%盐酸酒精分化20s→自来水洗(1’)→稀氨水(1%)反蓝30s→自来水或蒸馏水洗(1’)→伊红染色(20s—5min)→自来水洗(30s)→85%酒精脱水(20s)→90%酒精脱水(30s)→95%酒精(1’)→95%酒精(1’)→100%酒精(2’)→100%酒精(2’)→二甲苯(2’)→中性树胶封片.3. 染色结果: 细胞核呈兰色, 胞浆呈红色.三盐酸酒精的配制浓盐酸0.5—1ml + 75%酒精99ml.此液用一段时间后需延长或更换液体, 新液体分化时间要短.脑组织的石蜡包埋过程中有很多干预因素，一个环节处理的不好就会影响整个实验，我把我们的制作方法说一下，供参考。

包埋的定义：是利用包埋剂将需要包埋的组织包裹起来以提供性能支撑或化学保护的过程。

包埋的关键一是平整和方位，二是要杜绝差错和污染。

1. 包埋机选择：尽量选择优质、功能完备的包埋机；
2. 包埋石蜡选择：尽量选用高熔点（58-60℃）、优质的切片石蜡，高熔点石蜡可以使组织蜡块内外有一个硬度差，便于组织切片，优质石蜡杂质少。

如果选用的石蜡杂质较多，建议先将石蜡融化，底层弃去不用，取上层干净石蜡，待凝固后放入包埋机内（禁止将融化的石蜡直接倒入包埋机内，否者影响包埋机使用寿命）。

3. 包埋模具选择：选择尺寸恰当的模具，要确保组织四周都被石蜡包围，组织应置于中心。

4. 包埋镊子的更换：不论组织大小和类型，包埋必须一块组织更换一把镊子；
5. 包埋操作的要求：
-包埋时，应采用镊子轻压组织块拱起部分，使之平贴于底部，如无特殊要求，通常采用组织的最大切片作为包埋面；
-囊壁、管腔组织应竖直包埋；
-穿刺或内镜活检的小块多颗组织，应尽量放在一起，并保证在一个平面上；
-仔细观察包埋面，如有线结或钢针必须去除；
-开一个包埋盒包埋一个组织，严禁在包埋台上同时打开2个组织；
-包埋完毕后需再次清点组织数量。

组织的石蜡包埋与切片一、石蜡包埋（1）取材。

将需要石蜡包埋的组织取下，并放入1×PBS 中清洗。

（2）组织固定。

将组织放入4%多聚甲醛（或4%甲醛）中固定24 小时至48 小时。

（3）逐级酒精脱水。

75%酒精→ 85%酒精→ 95%酒精I→ 95%酒精II→ 100%酒精I→ 100%酒精II，将组织块在各级酒精中浸泡1 小时，脱去组织中的水分。

（4）二甲苯透明。

二甲苯I → 二甲苯II 各15 分钟，或适当延长二甲苯浸泡时间，直至组织透明为止。

（5）浸蜡。

将淋巴结组织及其标签按顺序依次放入液体石蜡中（60℃孵育箱），依次浸润石蜡I → 石蜡II → 石蜡III，分别浸润20 至30 分钟（可依据组织的大小调整浸蜡时间）。

（6）包埋。

将已经充分浸润液体石蜡的组织进行包埋，包有组织的石蜡块自然冷却并凝固后存放于4℃冰箱。

二、组织切片（7）使用leica 切片机进行组织切片，每张切片的厚度约为4 至5 μm。

（8）将含有组织的石蜡切片放于39~40℃水浴锅，使组织切片充分展开。

（9）使组织切片贴于载玻片上，避免气泡产生。

（10）烤片。

把已贴有组织的载玻片放在60ºC 烤箱中过夜，可观察到玻片上的石蜡溶化成泪滴状，准备进行HE 或免疫组织化学染色。

苏木精&伊红染色（Hematoxylin and eosin stain, H&E stain）（1）切片脱蜡至水。

二甲苯I →二甲苯II →二甲苯III 各10 分钟；100%酒精I →100%酒精II → 95%酒精I → 95%酒精II→ 85%酒精→ 75%酒精→蒸馏水各5分钟。

（2）苏木精染细胞核。

苏木精溶液染2~3 分钟后，置于清水中漂洗。

（3）盐酸酒精分色。

显微镜下观察，如果染色过深，用1%的盐酸酒精（75% 酒精配制）脱色数秒，可将胞浆非特异性染色脱去。

（4）返蓝。

将玻片置于蒸馏水中5 分钟，使苏木精着色逐渐变蓝。

组织制片技术原理与流程及切片机的使用组织制片的特点组织制片是组织学、胚胎学、病理学、生物学等学科观察和研究组织、细胞的正常形态和病理变化的常用方法。

其基本原理是用固定剂固定组织、细胞以及各种亚细胞器，保持组织的微细结构，制成薄片，并用不同的染色方法增加各部分的色差，在显微镜下观察组织、细胞的形态结构，或利用化学或物理方法显示组织、细胞内的某些化学成分，并可进行形态和化学成分的定量分析。

随着细胞和分子生物学技术的发展，组织制片也为原位显示细胞内基因表达提供了基础。

一石蜡包埋切片制作石蜡不溶于水而溶于二甲苯等有机溶剂，故固定好的组织须先用乙醇、丙酮、正丁醇等脱水剂脱去组织中的水，后用二甲苯等透明剂置换出乙醇，此过程即脱水、透明。

再用石蜡渗入组织块，冷凝后变硬，即浸蜡、包埋，就可在切片机上切片了。

1.固定细胞、组织离体后要迅速用相应的固定剂固定，使蛋白质沉淀、变性、凝固，保持组织原有的形态结构和抗原性。

一般用多聚甲醛、FAA、丙酮或Carnoy于4℃并向固定过夜。

2.脱水与透明固定后的组织须由低浓度到高浓度的乙醇逐级脱水，一般为50%、70%、85%、95%、和100%（3次）3.渗蜡与包埋渗蜡是石蜡置换组织块中透明剂的过程，一般用熔点为52-60℃的石蜡。

透明后的组织块先于1/1体积的二甲苯与石蜡中37℃渗透过夜，后温度调至58℃换入纯石蜡继续渗透，一般每间隔3h换一次纯石蜡，直到无二甲苯气味即可进行包埋。

4.切片与展片先用刀片修去组织块周围多余的石蜡，一般保留2mm左右的石蜡，修整成梯形的组织块，以便于展片时蜡带的分离。

先加热刀片，后把修好的组织块快速粘到方形的小木块上，冷凝后即可进行切片。

一般组织切片的厚度为6-12um，切片速度以40-50次/min为宜，用毛笔托起蜡带，分割后依次放到洁净的载玻片上，蜡带的光滑面朝下放，后滴上适量的蒸馏水放至展片台上于37-40℃烤片过夜。

5. 染色、脱水、透明与封片染色一般是双重染色或单染，番红与固绿是常用双重染色法，而苏木精是最优良的核染色剂。