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《分子生物学检验技术》实验指导

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- 1 - 实验一 小鼠肝组织DNA的提取及鉴定 【实验目的】 1、 掌握动物组织DNA提取的方法； 2、 掌握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。

【实验原理】 获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。因此，DNA样品质量的好坏将直接关系到实验的成败。较理想的DNA样品应达到以下三点要求：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染和干扰。 DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开；为控制组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）以除去激动该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K可水解蛋白质，消化DNA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。 260nm处DNA有最大吸收峰，测DNA的A260，可计算其浓度。而蛋白质在280nm处有最大吸收峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8~2.0 - 2 -

之间。 【实验器材和试剂】 1、动物 小白鼠 2、设备 移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。 3、试剂 （1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K （7）生理盐水，4℃贮存 （8）无水乙醇、70%乙醇

【操作步骤】 1、制备肝匀浆 迅速处死小白鼠，称取新鲜肝脏组织50 mg，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300 μl Buffer CL。将肝匀浆液放入EP管，加入1.5 μl蛋白酶K，漩涡震荡10 s，55℃孵育直到组织溶解（约1小时）。 2、提取DNA （1）加入1.5 μl RNase A，颠倒混匀，37℃孵育15-60 - 3 -

min。 （2）冰上孵育1分钟使样品迅速冷却。 （3）加入1/3体积的Buffer PP，涡旋震荡20 s，12000 rpm离心3 min。 （4）将上清转移到—个新的离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，可见絮状沉淀（纤维状DNA）从溶液中析出。12000 rpm离心1 min，弃上清。 （5）加入300 μl 70％乙醇，颠倒数次以洗涤DNA沉淀。12000 rpm离心1 min，弃上清，室温干燥15 min。 （6）加入50 μl Buffer GE溶解DNA（如果DNA的量比较大，可以65℃孵育以促进DNA的溶解），室温保存待测。 3、DNA浓度和纯度的测定 取0.1 ml DNA样品，加蒸馏水至1 ml，在751紫外分光光度计上测A260值和A280值。 计算：DNA浓度（μg/ml）= A260×50×10 （请问系数50、10是如何得来的？） DNA纯度 = A260nm/A280nm

【注意事项】 （1）由于DNA主要存在于细胞核内，为便于提取DNA，肝脏的破碎要严格控制好。即要尽可能的将细胞膜破碎，又要尽可能多保留完整的细胞核，以保留60～70％的完整细胞核为宜。为避免DNA过度断裂，不宜用电动研磨器制备匀浆。 在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同 - 4 -

的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提，混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。 （2）用氯仿除去组织蛋白，要不断振荡使蛋白质变性。如要得到高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。 （3）酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应避免接触皮肤。 （4）室温下干燥时尽可能使残留的乙醇挥发掉（DNA中残留的乙醇会影响内切酶的活性或电泳时DNA不下沉），但不要让DNA完全干燥，否则极难溶解，DNA溶解过程通常需要12-24hr。 （5）提取过程应尽量保持低温。 （6）在波长260nm紫外线下，1OD的光密度值相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为40μg/ml；单链寡核苷酸为20μg/ml。据此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法只用于测定浓度>0.25μg/ml的核酸溶液。 （7）A260nm/A280nm比值应介于1.8~2.0之间，若比值>2表示DNA样品中含有较多的RNA，如比值<1.8表明样品中有蛋白质污染。应根据后续实验要求，采取不同的方法纯化。当然也会出现DNA溶液中既含蛋白质又含RNA，其比 - 5 -

值介于1.8~2.0的情况，所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。

【结果】 1、A260 = ，A280 = 。 2、小鼠肝组织中DNA浓度是 μg/ml。 3、小鼠肝组织中DNA的A260nm/A280nm比值是 。

【思考题】 1、 提取和纯化的真核组织DNA有何用途？ 2、 你的A260nm/A280nm比值结果是否介于1.8~2.0之间？有何意义？ 3、 请结合你的实验结果和操作步骤，分析如何检测和保证DNA的质量？ - 6 -

实验二 聚合酶链反应 【实验目的】 采用聚合酶链式反应技术扩增小鼠肝组织平滑肌收缩蛋白（SM22α）基因 【实验原理】 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）用于体外扩增位于两段已知序列之间的DNA区段（靶序列）。其原理是通过耐热DNA聚合酶催化的DNA合成反应达到对靶序列的扩增。反应中使用两条化学合成的寡核苷酸作为引物，分别与模板DNA两条单链互补，待扩增序列片段位于两条引物之问。PCR扩增包括3个步骤，即变性、退火和延伸。反应需要模板、引物、DNA聚合酶和脱氧核糖三磷酸(dNTP)等的参与。反应混合液被加热以使模板DNA双链变性成为二条单链，随后将反应混合液冷却至引物的熔点温度(Tm)以下，使引物能与靶序列形成杂交双链（退火）。当温度升至72℃左右时，反应体系中的DNA聚合酶按照模板链的序列以碱基互补方式依次把dNTP加至引物的3’端，使互补链从5 ‘向3’方向不断延伸，直至形成新的DNA双链。通过变性、退火和延伸的一个循环可以使靶序列的分子拷贝数增加一倍。由于每次扩增的产物又作为下一次扩增的模板，因此反应产物的量以指数形式增长，一个分子的模板经过n个循环可得2n个分子拷贝产物。 本实验扩增的是小鼠肝组织平滑肌收缩蛋白（SM22α）基因，扩增产物片段大小为541bp。扩增所用的上游引物序列为：5’-AGTTATATTAATTTTGCATAGTGCCTGGTTG-3’，下游引物序列为：5’-GCGCTAGCTACAAGGCTTGGTCGTTTG-3’。 - 7 -

【实验器材和试剂】 1、设备 PCR仪、0.2ml PCR反应管、1.5ml离心管、移液器、吸嘴、旋涡混合器。 2、试剂（20 μl体系） PCR试剂盒（北京康为世纪生物科技公司） 【操作步骤】 1、 分别在PCR反应管中加入2× PCR mix 10 μl、上游和下游引物各2 μl、DNA 2 μl和H2O 4 μl。 2、 把PCR反应管放人PCR仪，按仪器操作要求启动扩增程序。本实验的扩增程序为：94℃预变性5分钟后进入循环扩增，即94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1 min。重复35个循环后，于72℃再延伸10 min，最后4℃保温。 3、 反应结束后，将PCR反应管于12000 rpm离心15s，取扩增产物进行电泳分析。 【注意事项】

1、由于PCR技术的灵敏度高，极微量的污染也会造成扩增的假阳性结果。因此，必须采取相应措施避免发生污染。 2、PCR实验应设立阴性对照反应，即在反应体系中不加模板DNA。 3、多份样品同时扩增时，可配制总的反应混合液，并分装于PCR管中，然后再在各管中分别加入模板。 4、临床诊断用PCR反应必须在专门的PCR实验室中进行，实验室应包括试剂配制室、模板制备室、PCR扩增 - 8 -

室和产物检测室等功能区。PCR实验中的各个步骤应在相应的功能区中进行。 5、PCR试剂与模板DNA及样品应分别保存于不同功能区的冰箱中。 6、操作时应戴手套，配制反应体系和加模板时应分别使用专用的移液器，所有耗材使用前必须经高压灭菌，用后按规定处理并丢弃在指定容器中。

【结果】 【思考题】 1、 PCR各组分在反应中的作用是什么？ 2、 降低退火温度、延长变性时间会对反应有何影响？

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分子生物学实验技术全攻略

分子生物学实验技术全攻略

分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 2实验二质粒DNA的提取 3实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9实验八 RNA提取与纯化 11实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15实验十一感受态细胞的制备及转化 16实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18实验十三 DNA分析——Southern杂交 19一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。

二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。

质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。

特别是常用的大肠杆菌。

大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。

它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。

当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。

然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。

最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。

硕士分子生物学实验指导-精品

硕士分子生物学实验指导-精品

硕士分子生物学实验指导-精品2020-12-12【关键字】建议、情况、方法、条件、动力、前提、空间、质量、监测、运行、问题、系统、有效、继续、充分、良好、快速、配合、保持、发展、掌握、了解、研究、措施、特点、位置、关键、稳定、基础、需要、环境、工程、体系、能力、载体、方式、作用、标准、结构、水平、速度、关系、设置、分析、激发、调节、形成、丰富、满足、严格、引导、保证、确保、指导、帮助、支持、调整、取决于、方向、提高、规范、耐心【原理】DNA是所有生物体的基本组成物质。

真核生物DNA主要存在于细胞核中。

制备DNA 时应将细胞核膜打破方能释放出来。

细胞中的DNA和RNA分别与蛋白质相结合，形成脱氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。

在细胞破碎后，这两种核蛋白将混杂在一起。

因此，要制备DNA首先要将这两种核蛋白分开。

已知这两种核蛋白在不同浓度的盐溶液中具有不同的溶解度，如在0.15mol/L NaC1的稀盐溶液中核糖核蛋白的溶解度最大，脱氧核糖核蛋白的溶解度则最小（仅约为在纯水中的1%）；而在l mol/L NaCl的浓盐溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度增大，至少是在纯水中的2倍，核糖核蛋白的溶解度则明显降低。

根据这种特性，调整盐浓度即可把这两种核蛋白分开。

因此，在细胞破碎后，用稀盐溶液，反复清洗，所得沉淀即为脱氧核糖核蛋白成分。

分离得到的脱氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质成分变性，让DNA 游离出来，再用含有异戊醇的氯仿沉淀除去变性蛋白质。

最后根据核酸只溶于水而不溶于有机溶剂的特点，加入95%的乙醇即可从除去蛋白质的溶液中把DNA沉淀出来，获得产品。

当细胞破碎时，细胞内的脱氧核糖核酸酶（DNase）立即开始降解DNA，如果在破碎细胞后不及时采取抑制酶活的措施，最后将会得不到任何DNA。

为此，如在本实验中加入柠檬酸盐、EDTA等螯合剂以除DNase必需的Mg2＋离子，使DNase活性降低，并要求整个分离制备的过程均在4℃以下进行，以减少DNase的降解作用，最后加入SDS使所有的蛋白质（包括DNase）变性。

分子生物学常用实验指南

分子生物学常用实验指南

生命科学系2011-2012学年度分子生物学实验（0801班）2011-2012学年度分子生物学实验指导实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3)实验二质粒DNA的转化 (4)实验三质粒DNA的提取 (5)实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7)实验五PCR基因扩增 (9)实验六DNA重组 (10)实验七蓝白斑筛选实验 (11)实验八DNA酶切技术 (13)实验一大肠杆菌感受态细胞的制备一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。

我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。

因而具备了吸收外源DNA的能力。

三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪四、材料与试剂：1.大肠杆菌top10菌株2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL3..LB液体及固体培养基4.50%甘油500mL（灭菌）五、实验操作步骤：1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中，37℃振荡（200r/min）培养过夜。

2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600应在0.4～0.5之间)3.将菌液置冰浴中10min。

（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷）4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。

5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保温30min。

6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100µL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、100µL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。

药学本科分子生物学实验指导

药学本科分子生物学实验指导

实验项目一：总RNA的提取（必做）一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习总RNA的提取和分析方法。

三、实验内容利用匀浆裂解细胞，采用TRilzol试剂盒抽提RNA去除蛋白质和DNA。

四、实验要求学会提取基因组RNA的方法和操作过程提取RNA时，要特别注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均应用0.1％的二乙基焦碳酸盐(diethyl pyrocarbonate，DEPC)处理。

塑料器材均使用一次性用品，并高压灭菌处理，必要时，也可用0.1%DEPC处理。

五、实验所需仪器设备与试剂仪器：移液器及吸头，电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪等试剂：TRIzol 试剂、氯仿、异丙醇、75% 乙醇（DEPC H2O 配制）、DEPC H2O六、实验原理TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。

最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。

在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。

取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；七、实验步骤1. 颈椎脱臼法处死大鼠，打开大鼠腹腔，取出肝脏2. 将肝脏用ddH2O冲洗几遍，去除血液3. 将大鼠肝脏放入研钵，用剪刀剪成绿豆大小的组织块，4．冷冻离心机冷却到4℃（预冷半个小时）。

准备冰盒。

5．戴口罩，戴手套。

6. 每个EP管中，加入100mg左右的组织，加入1mL Trizol 试剂，7. 超声破碎仪破碎细胞8. 剧烈震荡30秒，室温静置10分钟。

9．加入200uL氯仿（三氯甲烷），剧烈震荡30秒，室温静置5分钟。

10. 离心：4℃，13,000rpm，10min。

11．取新EP管。

将上层水相（约600uL）加入新EP管，12. 再加入500uL异丙醇，室温静置10分钟。

13. 离心：4℃，13,000rpm，10min。

14. 去上清夜，加入20-30 uL DEPC水，55℃10min，以完全溶解RNA。