PAX-5在Barrett食管、食管腺癌中的表达及其对食管腺癌细胞侵袭和转移的影响

ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００６￣５７０９.２０１９.０７.００９第一作者简介:朱晓文ꎬ硕士ꎬ研究方向:食管肿瘤临床与基础ꎮＥ￣ｍａｉｌ:１８２８７１２５０２＠ｑｑ.ｃｏｍ

通讯作者:许为佳ꎬ硕士ꎬ研究方向:临床肿瘤诊疗ꎮＥ￣ｍａｉｌ:６５１８８２４０９＠ｑｑ.ｃｏｍ

ＰＡＸ￣５在Ｂａｒｒｅｔｔ食管、食管腺癌中的表达及其对食管腺癌细胞侵袭和转移的影响朱晓文１ꎬ孙传涛１ꎬ李胜保１ꎬ许为佳２湖北省十堰市太和医院１.消化内科ꎻ２.肾内科ꎬ湖北十堰４４２０００【摘要】　目的　检测配对盒基因￣５(ｐａｉｒｅｄｂｏｘꎬＰＡＸ￣５)在Ｂａｒｒｅｔｔ食管、食管腺癌组织和食管腺癌细胞系中的相对表达ꎬ及其对食管腺癌细胞转移的作用和机制ꎮ方法　以食管腺癌细胞、正常食管组织、Ｂａｒｒｅｔｔ食管和食管腺癌组织为研究对象ꎬ采用实时荧光定量ＰＣＲ(ｑＲＴ￣ＰＣＲ)检测ＰＡＸ￣５ｍＲＮＡ在食管腺癌细胞系中表达ꎻｑＲＴ￣ＰＣＲ和免疫蛋白印迹实验验证ＰＡＸ￣５ｍＲＮＡ和蛋白在组织中的

相对表达ꎮ采用表达最低的ＯＥ３３为研究对象ꎬ分别转染ｐｃＤＮＡ３.１(＋)￣Ｆｌａｇ￣ＰＡＸ￣５质粒(实验组)和ｐｃＤＮＡ３.１(＋)￣Ｆｌａｇ￣Ｖｅｃｔｏｒ质粒(对照组)至ＯＥ３３细胞系ꎬ利用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ迁移和侵袭实验检测ＰＡＸ￣５的迁移和侵袭的影响ꎬ并用ｑＲＴ￣ＰＣＲ和免疫蛋白印迹验证ＰＡＸ￣５基因迁移和侵袭的分子机制ꎮ结果　食管腺癌中ＰＡＸ￣５ｍＲＮＡ和蛋白的表达显著低于Ｂａｒｒｅｔｔ食管和正常食管组织(Ｐ<０.００１)ꎬＰＡＸ￣５ｍＲＮＡ在食管腺癌细胞系中表达下调(Ｐ<０.００１)ꎻＴｒａｎｓｗｅｌｌ实验研究显示:与对照组相比ꎬ实验组迁移和侵袭能力

明显受到抑制ꎻ过表达ＰＡＸ￣５抑制上皮－间质转化(ＥＭＴ)相关基因的表达(Ｐ<０.００１)ꎮ结论　ＰＡＸ￣５在食管腺癌中表达下调ꎬ可能作为潜在的抑癌基因参与食管腺癌的进程ꎮ【关键词】　食管腺癌ꎻＢａｒｒｅｔｔ食管ꎻＰＡＸ￣５ꎻ抑癌基因ꎻ转移

中图分类号:Ｒ７３５.１ 文献标识码:Ａ 文章编号:１００６－５７０９(２０１９)０７－０７６１－０６ 收稿日期:２０１８￣０５￣２３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＡＸ￣５ｉｎＢａｒｒｅｔｔ’ｓｅｓｏｐｈａｇｕｓꎬｅｓｏｐｈａｇｅａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｉｎｖａｓｉｏｎａｎｄｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆｅｓｏｐｈａｇｅａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓＺＨＵＸｉａｏｗｅｎ１ꎬＳＵＮＣｈｕａｎｔａｏ１ꎬＬＩＳｈｅｎｇｂａｏ１ꎬＸＵＷｅｉｊｉａ２

１.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙꎻ２.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＮｅｐｈｒｏｐａｔｈｙꎬＴａｉｈｅＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｈｉｙａｎꎬＳｈｉｙａｎ４４２０００ꎬＣｈｉｎａ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＡＸ￣５ｉｎｈｕｍａｎｅｓｏｐｈａｇｅａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓａｎｄｔｉｓｓｕｅｓꎬａｎｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＰＡＸ￣５ｏｎｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｅｓｏｐｈａｇｅａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓＯＥ３３.Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＥｓｏｐｈａｇｅａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓꎬｎｏｒｍａｌｅｓｏｐｈａｇｕｓꎬＢａｒｒｅｔｔ’ｓｅｓｏｐｈａｇｕｓａｎｄｅｓｏｐｈａｇｅａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｔｉｓｓｕｅｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄ.Ｓｅｍｉ￣ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ(ｑＲＴ￣ＰＣＲ)ａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＰＡＸ￣５ｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｈｅｓｅｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｃｅｌｌｌｉｎｅｓ.ＰＡＸ￣５ｗａｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏｌｏｗｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌＯＥ３３ｃｅｌｌｓꎬｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＰＡＸ￣５ｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄꎬＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇａｎｄｑＲＴ￣ＰＣＲｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＰＡＸ￣５ｉｎｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎ.Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＢａｒｒｅｔｔ’ｓｅｓｏｐｈａｇｕｓａｎｄｎｏｒｍａｌｅｓｏｐｈａｇｕｓｔｉｓｓｕｅｓꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＰＡＸ￣５ｍＲＮＡａｎｄｐｒｏ￣ｔｅｉｎｗｅｒｅｌｏｗｅｒｉｎｈｕｍａｎｅｓｏｐｈａｇｅａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ(Ｐ<０.００１)ꎻｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＡＸ￣５ｍＲＮＡｗａｓｄｏｗｎ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｅｓｏｐｈａｇｅａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓ(Ｐ<０.００１)ꎻＴｒａｎｓｗｅｌｌａｓｓａｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓｏｆｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄꎬａｎｄｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＡＸ￣５ｉｎｈｉｂ￣ｉｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ￣ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ(ＥＭＴ)(Ｐ<０.００１).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅｄｏｗｎ￣ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＰＡＸ￣５ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｅｓｏｐｈａｇｅａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｍａｙｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｅｓｏｐｈａｇｅａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉ￣ｎｏｍａａｓａｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｇｅｎｅ.【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】　ＥｓｏｐｈａｇｅａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａꎻＢａｒｒｅｔｔ’ｓｅｓｏｐｈａｇｕｓꎻＰＡＸ￣５ꎻＴｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｇｅｎｅｓꎻＭｅｔａｓｔａｓｉｓ

近年来ꎬ随着生活水平的不断提升及人口的老龄化ꎬ食管腺癌的发病率呈逐年上升的趋势[１]ꎬ有文献报道ꎬＢａｒｒｅｔｔ食管被认为是食管腺癌发生、发展过程中的关键步骤ꎬ预防或靶向干预Ｂａｒｒｅｔｔ食管病变可预防食管腺癌的形成[２]ꎮ目前缺乏从“食管上皮黏膜－Ｂａｒｒｅｔｔ食管－食管腺癌”诊断和治疗的有效靶点ꎮ目

前基因组学的发展为肿瘤的治疗提供了新的思路ꎬ肿瘤相关抑癌基因丢失是肿瘤形成的重要因素[３]ꎮ

ＰＡＸ￣５作为新发现的抑癌基因ꎬ其异常表达与多种实

体肿瘤密切相关ꎬ如:乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌中异

􀅰１６７􀅰胃肠病学和肝病学杂志　２０１９年７月第２８卷第７期　ＣｈｉｎＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌＨｅｐａｔｏｌꎬＪｕｌ２０１９ꎬＶｏｌ.２８ꎬＮｏ.７常表达[４￣６]ꎬ但其在食管腺癌中的致病机制尚未见报道ꎮ１　资料与方法１.１　一般资料　选取十堰市太和医院２０１５年８月至２０１７年８月就诊的胃食管反流病患者的病理资料ꎮ纳入标准:(１)所有诊断Ｂａｒｒｅｔｔ食管的患者符合中华医学会消化病学分会制订的«Ｂａｒｒｅｔｔ食管诊治共识(２０１１修订版)»的诊断标准[７]ꎻ(２)正常食管上皮和食管腺癌的病理诊断由本院２位高年资病理科医师诊断ꎮ排除标准:临床资料不全者、合并严重糖尿病和(或)心脏病疾病、转移性肿瘤、既往胃肠道手术治疗史ꎮ１.２　主要试剂　蛋白提取试剂盒购自北京普利莱科技公司(批号:１８０７７８)ꎬＰＡＸ￣５单克隆抗体购自美国Ａｂｃａｍ公司(批号:ａｂ１０９４４３)ꎬ二抗ＧＡＰＤＨ购自上海碧云天科技公司(批号:３１２３４５５)ꎬＰＡＸ￣５引物由上海生工生物工程股份有限公司合成及提供(批号:１８２２８３４)ꎬＲＮＡ提取试剂盒购自美国应用生物系统公司ꎬ逆转录试剂盒购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司(批号:４５１２３８６)ꎮ消化内镜购自奥林巴斯公司ꎬ蛋白凝胶系统成像仪购自美国Ｌｉｇｈｔｏｏｌｓ公司ꎬ实时荧光定量ＰＣＲ仪购自美国应用生物系统公司ꎮＳＥＧ１和ＯＥ３３是食管腺癌细胞系ꎬＣＰ￣Ｃ和ＣＰ￣Ｄ是Ｂａｒｒｅｔｔ食管细胞系ꎬＨｅｔ￣１Ａ是正常食管上皮细胞系ꎬ所有细胞系均来源于ＡＴＣＣ细胞库ꎮ１.３　组织ＲＮＡ和蛋白提取　所有细胞系、组织ＲＮＡ和蛋白提取按照试剂盒说明书操作[８]ꎮ提取的ＲＮＡ和蛋白测浓度后置于－８０℃冰箱中保存ꎮ１.４　细胞转染　ＰＡＸ￣５过表达载体购自广州辉骏生物科技有限公司ꎮ质粒转染方法和步骤同文献[８￣９]ꎬ活性状态下的食管腺癌细胞ＯＥ３３种于６孔板中ꎬ离心半径１３.５ｃｍꎬ１８００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ消化离心并重新种板ꎬ当细胞融合度为８０％~９０％时进行细胞转染ꎮ转染载体:Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００(美国通用应力公司)ꎬ细胞转染４８ｈ后收集实验组和对照组细胞进行相应的功能实验ꎮ１.５　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验　迁移实验:收集上述过表达ＰＡＸ￣５和对照ｐｃＤＮＡ３.１(＋)的食管腺癌细胞ＯＥ３３ꎬ离心半径１３.５ｃｍꎬ１８００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ消化离心ꎬ倒置显微镜下计数ꎬ并分别取实验组和对照组细胞(４×１０３个)ꎬ种于Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室上室ꎬ下室加入质量浓度为１５０ｇ/Ｌ胎牛血清１６４０约７００μｌꎬ置于细胞孵育箱中继续培养ꎬ待２０ｈ后取出小室ꎬ固定、染色、计数(显微镜下随机５个视野)ꎬ计数并评价细胞迁移能力ꎮ侵袭实验:在Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室上室中加入基质胶(无血清１６４０∶基质胶＝１∶７)混匀后加入ꎬ将加入基质胶的小室放入细胞孵育箱中２~４ｈꎬ待基质胶凝固后进行侵袭实验ꎬ侵袭实验步骤基本同细胞迁移实验ꎮ１.６　ｑＲＴ￣ＰＣＲ　核酸检测仪进行总ＲＮＡ定量检测ꎬ

所取的细胞和组织的ＯＤ２６０/ＯＤ２８０比值为１.８~２.２ꎮ按照５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ试剂盒说明书逆转录

为ｃＤＮＡꎬ以及Ｐｒｏｍｅｇａ试剂盒中说明书进行扩增ꎮｑＲＴ￣ＰＣＲ上机总反应体系如下:９５℃５ｍｉｎꎻ９５℃

３０ｓꎻ５５℃３０ｓꎻ７２℃３０ｓꎻ２５℃１０ｍｉｎꎮ其中内参循

环２３个ꎬ目的循环３２个ꎮ引物序列:ＰＡＸ￣５￣Ｆ:５′￣ＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＣＣ￣３′ꎬＰＡＸ￣５￣Ｒ:５′￣ＴＧＣＴＣＴ￣

ＣＡＴＴＡＴＧＡＴＡＧＣＴＧ￣３′ꎻＥ￣ｃａｄ￣Ｆ:５′￣ＴＡＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡ￣３′ꎬＥ￣ｃａｄ￣Ｒ:５′￣ＴＧＧＣＡＣＣＡＧＴ￣ＧＴＣＣＧＧＡＴＴＡ￣３′ꎻＶｉｍ￣Ｆ:５′￣ＧＡＣＣＡＧＣＴＡＡＣＣＡＡＣＧＡ￣ＣＡＡ￣３′ꎬＶｉｍ￣Ｒ:５′￣ＧＴＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＴＣＴＧＡＡＡＧＡＴ￣３′ꎻＮ￣ｃａｄ￣Ｆ:５′￣ＣＧＡＡＴＧＧＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣＡＴＣＣ￣３′ꎬＮ￣ｃａｄ￣Ｒ:５′￣ＧＧＡＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴＴＣＡＴＡＧＴＣＡ￣３′ꎻＯｃｃ￣Ｆ:５′￣ＧＧＡＧＴＣＣＧＣＡＧＴＣＴＴＡＣＧＡＧ￣３′ꎬＯｃｃ￣Ｒ:５′￣ＴＣＴＧＧＡＧ￣ＧＡＣＣＴＧＧＴＡＧＡＧＧ￣３′ꎮ１.７　免疫蛋白印迹实验　提取上述组织蛋白质ꎬ采用ＢＣＡ法测定蛋白浓度ꎮ配制分离胶和浓缩胶ꎬ分别取４５μｇ/孔进行凝胶电泳ꎬ转膜ꎬ质量浓度为５０ｇ/Ｌ脱