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人神经营养素-3基因真核表达载体的构建和鉴定陈昌杰;赵莉【期刊名称】《中国临床解剖学杂志》【年(卷),期】2004(22)6【摘要】目的:构建含有人NT-3基因真核表达载体pcDNA3.1-NT-3。
方法:采用PCR技术,扩增编码神经营养素-3基因,克隆到PMD18-T载体上,再亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1的Hind Ⅲ和BamHI位点。
结果:重组真核表达载体pcDNA3.1-NT-3经酶切鉴定证明NT-3基因正向插入真核表达载体中,碱基序列的测定证明重组质粒中含有人的NT-3基因序列。
结论:构建的真核表达载体携有人NT-3cDNA序列,并且含有巨细胞病毒强启动子、ploy(A)加尾信号和neo标志基因,可能具有转染多种哺乳类细胞通用性,可用于NT-3基因的真核表达及基因治疗的研究。
【总页数】3页(P652-654)【关键词】神经营养素-3;真核表达载体【作者】陈昌杰;赵莉【作者单位】蚌埠医学院生化与分子生物学教研室;蚌埠医学院解剖学教研室【正文语种】中文【中图分类】Q528.2【相关文献】1.人Bcl-2基因短发夹样RNA真核表达载体的构建和鉴定 [J], 肖文静;沈方臻;林明刚2.人纤溶酶原K5区基因真核表达载体的构建和活性鉴定 [J], 杨健;王跃祥;官孝群;马春姑;陶贤梅;宋后燕3.人HoxA10基因真核表达载体构建和表达产物的鉴定 [J], 胡双纲;姚广新;赵晓明;孙赟;高玉平4.人重组5-脂氧合酶基因真核表达载体的构建和鉴定 [J], 白春英;史铁伟;瑞云;李天柱5.人ClC-2基因小分子干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定 [J], 杨翔云;张勇;赖小刚;裴建明;杨安钢;胡玉珍;周士胜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
pcdna31质粒DNA质粒是一种常见的分子生物学工具，广泛应用于基因工程和遗传学研究中。
pcdna31质粒是一种特定的质粒，常用于基因表达、DNA克隆和蛋白质过表达等研究领域。
本文将详细介绍pcdna31质粒的构建原理、重要特征和应用。
一、构建原理pcdna31质粒是由一段DNA序列经特定操作组装而成的，其构建原理主要包括以下几个步骤：1. 选择适当的载体：选择pcdna31作为载体，基于其在常见宿主细胞中的高稳定性和易操作性。
2. DNA序列设计：根据需要，设计引物和目的序列，目的序列可以是某种基因、DNA片段或其他DNA序列。
3. PCR扩增：利用引物与目的序列进行PCR扩增，得到待插入质粒的目的序列片段。
4. 酶切和连接：将PCR扩增产物进行酶切，然后与pcdna31质粒进行连接，形成目的序列插入到载体中。
5. 转化宿主细胞：将连接好的质粒引入目标宿主细胞，经培养和筛选，获得含有pcdna31质粒的稳定细胞。
二、重要特征pcdna31质粒具有以下重要特征：1. 载体大小：pcdna31质粒的大小约为6.6kb左右，适中的大小有利于质粒的稳定性和转化效率。
2. 多克隆位点：pcdna31质粒含有多个限制性内切酶位点，可用于插入目的序列，方便多个片段的克隆。
3. 抗生素标记：pcdna31质粒通常带有抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因（ampicillin resistance gene），可通过抗生素筛选细胞。
4. 合成子启动子：pcdna31质粒中常含有强启动子，可在宿主细胞中高效表达插入的目的序列。
三、应用pcdna31质粒在生命科学研究中具有广泛的应用，主要包括以下几个方面：1. 基因表达：利用pcdna31质粒作为表达载体，插入目的基因，通过转化宿主细胞实现目的基因的高效表达。
2. DNA克隆：pcdna31质粒含有多个限制性内切酶位点，可用于多个DNA片段的克隆和拼接。
3. 蛋白质过表达：利用pcdna31质粒中的强启动子和表达调控元件，使目的蛋白质在宿主细胞中得到高水平的表达。
HBeAg真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达杨军;刘妮;卫阳;靳耀锋;王军宁;康安静;苏宝山;李宗芳【期刊名称】《临床肝胆病杂志》【年(卷),期】2012(028)011【摘要】目的克隆HBeAg基因,构建重组HBeAg真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中进行表达.方法采用PCR法从HBeAg阳性乙型肝炎患者血清HBV DNA中扩增HBeAg基因,克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体中,构建重组pcDNA-HBeAg真核表达载体,经PCR、双酶切、测序鉴定后,将其转染入CHO细胞,G418筛选,用PCR、免疫斑点、Western Blot、免疫细胞化学方法检测HBeAg在CHO细胞中的表达.结果成功克隆到HBeAg基因,并构建了重组pcDNA-HBeAg真核表达载体；基因测序证实克隆的HBeAg基因中共有12个位点发生单碱基置换突变(C1819G,A2007T,C2046T,C2061G,G2106A,C2109A,C2146T,T2172C,C2203T, A2235G,G2253A,C2298T),1个位点发生缺失突变(2346 del T)；成熟HBeAg蛋白中149位缬氨酸(valine,V)突变为苯丙氨酸(phenylalanine,F)(V149F),在HBeAg蛋白羧基端融合有一段长11个氨基酸的多肽(RLESRGPVZTR).PCR、免疫斑点、Western Blot和免疫细胞化学方法证实重组pcDNA-HBeAg真核表达载体可在CHO细胞中表达分泌型HBeAg蛋白.结论重组HBeAg真核表达载体的构建和表达为HBeAg的临床诊断和深入研究提供了条件.【总页数】4页(P845-848)【作者】杨军;刘妮;卫阳;靳耀锋;王军宁;康安静;苏宝山;李宗芳【作者单位】西安交通大学医学院第二附属医院病理科,西安710004;西安交通大学医学院第二附属医院病理科,西安710004;西安交通大学医学院第二附属医院科研实验中心,西安710004;西安交通大学医学院第二附属医院病理科,西安710004;西安交通大学医学院第二附属医院病理科,西安710004;西安交通大学医学院第二附属医院病理科,西安710004;西安交通大学医学院第二附属医院病理科,西安710004;西安交通大学医学院第二附属医院外科,西安710004【正文语种】中文【中图分类】R512.62【相关文献】1.重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α分泌型真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达 [J], 赵亮;姚丽娟;孔建新;濮跃晨;孙安源;罗以勤;张林杰2.骨形态发生蛋白基因真核表达质粒的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达 [J], 王海彬;刘少军;樊粤光;何伟;刘武;徐传毅;姜自伟;曾意荣3.丙型肝炎病毒核心区截短型基因真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达 [J], 韦三华;尹文;雷迎风;胡兴斌;吕欣;杨敬;孙梦宁;徐志凯4.HBeAg真核表达载体的构建及其在Bewo细胞中的表达 [J], 资捷;王前;郑磊;熊石龙;蔡贞5.中华鼢鼠卵透明带3基因(mZP3)真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达 [J], 张冬辉;郑雪莉;李昊;周智敏;吴景龙;隋丹丹;韩崇选因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
真核表达载体pcDNA3.1-β淀粉样前体蛋白裂解酶的构建及其在COS-7细胞中瞬时表达董炜疆;宫惠琳;冯改丰;胡海涛【期刊名称】《中国修复重建外科杂志》【年(卷),期】2006(20)4【摘要】目的构建β淀粉样前体蛋白裂解酶(β-siteamyloidprecursorproteincleavingenzyme,BACE)基因的真核表达载体,为修复阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)损伤神经元奠定基础。
方法采用RT-PCR方法,从人的成神经细胞瘤的总cDNA中,扩增出1.5kb的BACEcDNA片段,再用BamHI和XhoI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;以免疫细胞化学法检测BACE 基因的表达情况。
结果人BACE基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1质粒中;经脂质体转染COS-7细胞后,并由潮霉素进行筛选,可见转染细胞胞浆中和胞膜上有较高量的BACE蛋白表达。
结论成功构建了pcDNA3.1-BACE的真核表达载体,为研究BACE基因在AD发病机制中的作用及抑制BACE,为治疗AD奠定一定的实验基础。
【总页数】4页(P423-426)【关键词】基因克隆;阿尔茨海默病;β淀粉样前体蛋白裂解酶【作者】董炜疆;宫惠琳;冯改丰;胡海涛【作者单位】西安交通大学医学院人体解剖学与组织胚胎学系;西安交通大学医学院第一附属医院病理科【正文语种】中文【中图分类】Q753;R749.16【相关文献】1.人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达 [J], 刘映霞;胡国龄;刘敏;谭德明;沙新平;何淑雅2.β淀粉样前体蛋白裂解酶特异性小干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定 [J], 董炜疆;胡海涛;冯改丰;杨广笑;王全颖3.真核表达载体pcDNA3．1-β淀粉样前体蛋白裂解酶的构建及其在COS-7细胞中瞬时表达 [J], 董炜疆;宫惠琳;冯改丰;胡海涛4.β淀粉样前体蛋白裂解酶特异性小干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定 [J], 董炜疆;胡海涛;冯改丰;杨广笑;王金颖5.汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的瞬时表达 [J], 薛小平;徐志凯;马文煜;闫岩;张芳琳;尹文;吴兴安;白文涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
二实验方法“。
”４”１技术路线１．１质粒构建藉弼丈学矮士学柱论定椽穗杰结果１质粒ｐＣＤＮＡ３．１“）和ｐＥＧＦＰ一１的双酶切鉴定ｐＣＤＮＡ３．１（＋）质粒经过ＢａｍＩｔＩ、ＮｏｔＩ双酶切后，电泳结聚（见阉ｌ一８）显示有一条５。
４Ｋｂ麓絷带，穰据ｐＣＤＮＡ３。
ｉ（＋）瘊粒酶窃图谱分析，该质救含有ＢａｍＨｌ和ＮｏｔＩ酶切位点各一个，经过双酶切后得到线性化载体ｐＣＤＮＡ３．１（＋）和另外一个很短的片段，电泳时这令缀籁静冀蔽燕出了璩瓣糖凝黢，最蘑凝胶上褥剿的条带聿誊合线往化载体ｐＣＤＮＡ３．１（＋）的长度，故可以验证所获质粒确为ｐＣＤＮＡ３．１（十）质粒。
ｐＥＧＦＰ－１蒺载经过８ａ硎ｉ、Ｎｏｔ｛瑟酶切鑫，电濠结莱（冕圈ｌ—Ｃ）鼹示有瓶条分别为３．５Ｋｂ卸０。
７Ｋｂ的祭带，根据ｐＥＧＦＰ—ｌ质粮酶切图谱分析，该质粒同样含商ＢａｍＨＩ和ＮｏｔＩ酶切位点各一个，经过载酶切籁得嚣露静蘩茜ＥＧＦＰ片段帮勇终一个鞍长豹的片段，电泳时凝胶上的条带符合鼹个片段的长度，数可以验证雕获质粒确为ｐＥＧＦＰ一１质粮。
豳ｌｐＣＤＮＡ３．１（＋）羊¨ｐＥＧＦＰ—ｌ质粒的酶切分毫斥Ａ：ＤＮＡ分子量标记：Ｂ：ｐＣＤＮＡ３．１（＋）质粒ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ舣酶切Ｃ：ｐＥＧＦＰ－ｔ矮粒ＢａｍＨ｛、Ｎｏｔ｛鼹酶鞠鞫ｊｌ｜大学疆士学盈论文撩谗杰２垂缣质粒ｐＣＤＮＡ３．１（＋）－ＥＧＦＰ的酶稍釜定重组厦粒ｐＣＤＮＡ３。
ｌ（＋）一ＥＧＦＰ经过ＢａｍＨＩ单酶切基，电溶结果（见图２一Ｂ）显示有一条单一的６．１Ｋｂ条带，根据ｐＣＤＮＡ３．１－ＥＧＦＰ强谱分析，该质粒含有单一的ＢａｍＨＩ酶切位点，全长为６．１Ｋｂ左右。
耋组质粒ｐＣＤＮＡ３．１（＋）～ＥＧＦＰ经过ＢａｍＨｌ、ＮｏＬＩ双酶切蜃，电泳结果（见网２一Ｃ）显示有两条分别为５．４Ｋｂ和０．７Ｋｂ的条带，符台线赣ｐＣＤＮＡ３。
ｌ（十）载体和ＥＧＦＰ片段的长发，故可以验证所较质粒确为耋缀质粒ｐＣＤＮＡ３，ｌ《＋）－ＥＧＦＰ。
HBeAg真核表达载体的构建及其在Bewo细胞中的表达资捷;王前;郑磊;熊石龙;蔡贞【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2010(20)1【摘要】目的构建乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Hbe,并观察其在Bewo细胞中的表达.方法用PCK方法从质粒pMD18T-HBV中扩增HBeAg基因,克隆到pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-Hbe,通过酶切、PCR及测序鉴定,并将该裁体转染Bewo细胞,72 h后,用Western 免疫印迹和微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测HBeAg蛋白在胞内和上清中的表达.结果通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建HBeAg表达载体,该载体可以在Bewo细胞系中表达HBeAg,并可分泌HBeAg.结论构建了HBeAg真核表达载体pcDNA3.1(+)-Hbe,为研究胞内HBeAg对Bewo细胞Toll样受体表达的作用奠定了基础.【总页数】4页(P54-56,68)【作者】资捷;王前;郑磊;熊石龙;蔡贞【作者单位】南方医科大学南方医院,检验医学中心,广东,广州,510515;南方医科大学南方医院,检验医学中心,广东,广州,510515;南方医科大学南方医院,检验医学中心,广东,广州,510515;南方医科大学南方医院,检验医学中心,广东,广州,510515;南方医科大学南方医院,检验医学中心,广东,广州,510515【正文语种】中文【中图分类】R512.62【相关文献】1.HBeAg真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达 [J], 杨军;刘妮;卫阳;靳耀锋;王军宁;康安静;苏宝山;李宗芳2.PcDNA3肿瘤坏死因子α真核表达载体的构建及其在真核细胞中的表达 [J], 齐力;季雪莲;王秀梅;张智清3.兔病毒性出血症病毒VP60基因真核表达载体的构建以及在真核细胞中表达 [J], 张夏兰4.HCV复合多表位基因真核表达载体的构建及在真核细胞中的表达 [J], 韦三华;尹文;雷迎峰;胡兴斌;吕欣;杨敬;孙梦宁;徐志凯5.人miR-155真核过表达载体的构建及其对HepG2.2.15细胞中HBeAg的抑制效应 [J], 蔡启茵;任广立;张卫云;马恒灏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一．载体酶切线性化（TOYOBO EcoR I）1.载体pCDNA浓度0.8 ug/ul2.酶切体系（总50ul体系）pCDNA 3ul10*H Buffer 5ulddH2O 41ulEcoR I 1ul（8U/ul）3.反应条件37°C 1h 至多2h*已经试过37°C过夜，本以为会酶切充分，但是不想把条带全切成小片段了，而且电泳后是一条宽宽的泳谱*另外，多次酶切证实，所加的酶量过多在酶切一小时的情况下仍然会出现酶切过度的情况，尽可能按照说明书上的量和时间做二．取2ul稀释成5ul于1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定有无条带及大小用大凝胶回收pcDNA（按2.5：1加入SYBR Green）电泳30min准备两支EPPendorf管，调60°C水浴锅切胶称重（1.5ml EPPendorf管重约0.82g）三．OMEGA gel purification kit回收pcDNA1.平衡柱子加200ulBuffer GPS到DNA收集柱中，静置4min，12000xg*2min，加700ulDEPC处理H2O，12000xg*2min2.溶胶按1ml/kg的比例加Binding Buffer到凝胶中3.60°C水浴7mins，迅速转移至DNA收集柱中（至多700ul，超过的再转移一次），10000xg*1min，弃收集管中的液体4.加300ulBinding Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体5.加700ulwash Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体6.加350ulwash Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体7.最大转速（>13000rpm）空转2min，弃收集管8.转移收集柱至1.5mlEPPendorf管，打开盖子静置2min9.加30ulElution Buffer静置2min，最大转速1.5min，弃收集柱10.取2ul稀释成5ul点胶*所加Elution Buffer的量是根据所纯化的产物的量来判断的，如果回收产物较多可以增加其量至50ul*纯化的理论效率为70%，如果先加一次Elution Buffer 20ul，静置2min，1000xg*1min,然后再加一次Elution Buffer20ul，静置离心。
应用体外DNA同源重组技术构建pcDNA3.1-NGF和pcDNA3.1-TrkA张严;龚爱华;金洁;邵根宝;彭琬昕【摘要】目的:利用体外DNA 同源重组的方法分别构建含神经生长因子(NGF)和神经生长因子受体(TrkA)基因的真核表达载体.方法:在引物5′加上一段与载体克隆位点两端碱基序列相同的序列,PCR扩增目的基因NGF和TrkA,线性载体片段和目的基因片段经T4 DNA 聚合酶的外切产生互补的单链DNA,然后37℃退火实现体外同源重组,转化并鉴定;将重组质粒转染293A细胞,免疫印迹鉴定目的基因的表达情况.结果:成功构建真核载体pcDNA3.1-NGF和pcDNA3.1-TrkA,转染细胞后的表达产物相对分子质量分别是31×103和140×103.结论:与常规重组技术相比,体外DNA 同源重组技术是一种高效的DNA 重组方法,且不需考虑目的片段的限制性酶切位点.%Objective: In this study, we use the DNA homologous recombination in vitro to construct NGF and tyrosine kinase A (TrkA) eukaryotic expression vector. Methods: PCR primers for inserts were designed to contain appropriate 5' extension sequences. For the cloning reaction we generated the vector by cleavage with double restriction enzyme and generated the inserts TrkA and NGF by PCR. We treated both the vector and the inserts with T4 DNA polymerase to generate overhangs, then incubated vector and insert to promote recombination, and transformed the products into E. Coli and identified. Transfect the recombination DNA into 293A and identify the gene expression. Results: The expression vector pcDNA3. 1-NGF and pcDNA3.1-TrkA were constructed successfully by homologous recombination. Western blotshowed TrkA protein expression in infected 293A cells was 140 x 103 and NGF was 31 x 103. Conclusion: Compared with conventional recombination technology, homologous recombination in vitro was a kind of high efficient DNA recombination method, and with no need for consideringthe restriction enzymes' site.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(021)005【总页数】5页(P390-393,401)【关键词】体外DNA;同源重组;TrkA;神经生长因子;T4 DNA;聚合酶【作者】张严;龚爱华;金洁;邵根宝;彭琬昕【作者单位】江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏,镇江,212013【正文语种】中文【中图分类】R393基于限制性内切酶的DNA重组技术是20世纪最具卓越成就的生物学技术之一［1］。
・学术交流・pcDNA3-hNGFb真核表达载体的构建及其表达
邓兴力 杨智勇 董坚 王廷华 徐丹 冯忠堂【摘要】 目的 构建人神经生长因子β(NGF-β)基因真核表达载体并观察其在L929细胞内的表达。方法 以RT-PCR从人脑组织总RNA中扩增NGF-βcDNA,将其克隆到真核表达载体pcD2NA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以Lipofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和westernblot鉴定NGF-β在细胞内的表达。结果 RT-PCR产物为750bp的特异片段,重组质粒pcDNA3-hNGFb酶切后产生750bp和5.2kb的片段,DNA测序证实750bp片段的碱基序列与人NGF-βcDNA完全一致。将其转染L929细胞后,免疫细胞化学、westernblot结果表明NGF-β及其
前体proNGF-β能在真核细胞中正确表达。结论 成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3-hNGFb,
为后续的研究奠定基础。【关键词】 神经生长因子; 真核表达; 重组质粒; 转染
ConstructionofrecombinantplasmidpcDNA32hNGFbanditsexpression
DENGXing2li,YangZhi2yong,
DONGJian,etal. DepartmentofNeurosurgery,1stAffiliatedHospitalofKunmingMedicalCollege,Kunming650032,China【Abstract】 Objective ToconstructtheeukaryoticexpressionrecombinantplasmidpcDNA3-
hNGFbandinvestigateitsexpressioninL929cells.Methods ThecDNAofhumannervegrowthfactorbetasubunit(NGF-β)wasamplifiedbyRT-PCRfromhumanbraintissue.Bygenerecombinationtechnique,humanNGF-βcDNAwasinsertedintoeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.Therecombi2nantplasmidwasverifiedwithrestrictionenzymedigestionandDNAsequencing.Transfectedtherecom2binantvectorintoL929cellswithLipofectamine2000transfectionreagent.TheexpressionofNGF-βwasanalyzedbyimmunocytochemisteryaswellaswesternblot.Results TheRT-PCRproductis750bpspecificsegment.Byrestrictionenzymedigestion,therecombinantplasmidwasdigestedinto750bpand5.2kbfragments.DNAsequenceresultshowedthe750bpfragmentwasidenticalwithhumanNGF-βcDNAinGenBank.ImmunocytochemisteryandwesternblotshowedtheNGF-βwasexpressedsuccessfullyinL929cells.Conclusions TherecombinantplasmidpcDNA3-hNGFbwasconstructedsuccessfully,whichwillprovidethefoundationforfurtherresearch.【Keywords】 Nervegrowthfactor(NGF);Eukaryoticexpression;Recombinantplasmid;Transfection
中图分类号:R741 文献标识码:A 文章编号:100926574(2008)0220114204
神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)是神经营养因子家族中最早被发现也是迄今为止研究得最为深入的细胞生长因子。NGF在体内首先以其前体的形式合成,随后在各种蛋白酶的作用下裂解为成熟体[1]。最近研究表明,NGF前体(proNGF)具有与成熟NGF相反的生物学活性,其通过作用于p75NTR受体及sortilin受体介导包括神经细胞内的多种细胞凋亡[2-5]。本研究将构建人NGF-β基因真核表达质粒pcDNA3-hNGFb,并研究其在L929细胞中的表达情况,为进一步研究proNGF的 作者单位:650032昆明医学院第一附属医院神经外科(邓兴力,杨志勇),生物治疗中心(董坚);昆明医学院神经科学研究所(王廷华、徐丹、冯忠堂) 作者简介:邓兴力(1979-),男,博士研究生。研究方向:细胞移植治疗帕金森病的研究。 通讯作者:冯忠堂 fzt@163.com生物学功能奠定实验基础。
1 材料与方法1.1 材料 1.1.1 质粒、细菌与脑组织 真核表达质粒载体pcDNA3由昆明医学院第一附属医院生物治疗研究中心保存;小鼠成纤维细胞系L929、E.coliDH5α由昆明医学院神经科学研究所保存;人脑肿瘤旁组织由昆明医学院第一附属医院神经外科提供。1.1.2 主要试剂与工具酶 TRIzol,Lipofectamine2000Reagent,G418,RPMI1640培养基,小牛血清(Invitrogen);Hind,xho,T4DNALigase,CalfIn2
testineAlkalinePhosphotase,FirstStrandcDNASynthesisKit,HighFidelityPCREnzymeMix(MBIFermentas);凝胶回收试剂盒,DNA纯化试剂盒,质粒DNA提取试剂盒(OMEGA);DNAMAKER
DL2000,DNAMAKERλ-EcoT14(Takara);6×・411・
NervousDiseasesandMentalHealth,2008,Vol.8,No.2RNALoadingbuffer,LBBroth,LBAgar,5×Pro2teinLoadingbuffer(上海生工);NGF多克隆抗体(SantaCruz);辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG,SABC免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥);LumiGLO化学发光底物(KPL)。1.1.3 引物的设计与合成 根据GenBank公布的人NGF-βcDNA(X52599),用PrimerPremier5.0软件设计引物,由Takara生物有限公司合成,序列如下:上游引物,5’-cgaagcttagcgtaatgtccatgttg-3’(含限制酶切位点Hind);下游引物,5’-GC2CTCGAGGGCAGGTCAGGCTCTTCT-3’(含限制酶切位点xho)。1.2 方法 1.2.1 总RNA的提取和RT-PCR 用TRIzol试剂从人脑组织中提取总RNA。紫外分光光度法及甲醛变性凝胶电泳鉴定提取RNA的纯度和完整性。用RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit,以oligo(dT)18为引物反转录合成cDNA第一链,然后进行PCR扩增,反应条件为94℃预变性3min;94℃1min,60℃1min,72℃1min,共30个循环;72℃延伸10min。RT-PCR产物用DNA纯化试剂盒纯化。1.2.2 pcDNA3-hNGFb重组载体的构建与鉴定1.2.2.1 目的基因的扩增 以纯化的RT-PCR产物为模板进行PCR扩增,设定条件为94℃预变性3min;94℃1min,60℃1min,72℃1min,30个循环;72℃延伸10min。用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物,紫外分光光度法测定其浓度和纯度。1.2.2.2 酶切反应 分别取10μg质粒pcDNA3和纯化的目的基因进行Hind、xho双酶切。碱性磷酸酶去除酶切后载体5’末端磷酸基。用凝胶回收纯化试剂盒纯化经酶切的载体和目的基因。1.2.2.3 连接反应 在20μl反应体系中加入400ng去磷酸反应后的DNA载体与175ng酶切后的目的基因(两者的摩尔比约为1∶3),进行连接反应,构建重组质粒pcDNA3-hNGFb。1.2.2.4 重组载体的鉴定 将连接产物转化E.coliDH5α,接种LB/Amp平板37℃培养过夜,挑取单菌落,摇菌扩增后用质粒提取试剂盒提取质粒。Hind、xho双酶切鉴定后,送上海博亚生物技术有限公司测序。1.2.3 NGF-β在L929细胞中的表达1.2.3.1 基因转染 转染前1d胰酶消化L929细胞,调整细胞密度至1×105个/ml,每孔2ml接种6孔板。37℃5%CO2培养18～24h,细胞达90%融合。取4μg质粒pcDNA3-hNGFb加入250μlOp2ti-MEM培养基中,得到A液。取10μlLipo2fectamine2000加于250μlOpti-MEM培养基中,得到B液,室温静置5min。将A、B液混匀,室温静置20min后均匀滴加于细胞培养基中,轻轻晃动细胞培养板,混和均匀。37℃5%CO2培养48h后检测。设置转染质粒pcDNA3和不转染基因的细胞为阴性对照。1.2.3.2 免疫细胞化学检测 基因转染48h后,细胞分别经4%多聚甲醛固定,0.25%TritonX-100
透化,3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶的活性,
3%BSA封闭,再依次与NGF抗体、生物素化的山羊抗兔IgG以及SABC分别孵育后,DAB显色,显微镜观察并照相。1.2.4 Westernblot检测 转染48h后收集细胞,用Pro-PREPTM蛋白提取液提取总蛋白,Brandford
法测定总蛋白量。总蛋白各60μg分别上样进行15%SDS-PAGE,电泳结束取出凝胶,用转印仪将蛋白转移在硝化纤维膜上。转移膜经5%脱脂奶粉封闭后,分别与兔抗NGF多抗、HRP标记的山羊抗兔IgG孵育,然后与LumiGLO化学发光底物孵育后X光片直接曝光。2 结果2.1 总RNA的提取 提取的总RNA经甲醛变性凝胶电泳、EB染色,凝胶成像系统下观察其完整性。28S和18S条带清晰可见,5.8S隐约可见,说明RNA完整未降解,见图1。紫外分光光度法鉴定其纯度,OD260/OD280为2.23,RNA纯度高,符合RT-
PCR要求。2.2 RT-PCR扩增人NGF-βcDNA RT-PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳显示为750bp的特异条带,与预期结果相符,见图2。2.3 重组质粒的酶切鉴定与序列分析 重组质粒pcDNA3-hNGFb经Hind、xho双酶切后,琼脂糖凝胶电泳分离可见750bp和5.2kb的两个片段,与预期结果一致,见图3。GenBankBLAST分析显示,
