DREB基因原核表达载体的构建及检测李典鹏1霍凯丽1李政1陈丽萍1刘超2*（1.新疆农业大学草业与环境科学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2．新疆农业大学农学院，新疆乌鲁木齐 830052）摘要：以从苜蓿基因组获取的DREB基因为目的基因，经过大肠杆菌液体培养基和固体筛选培养基的制备、大肠杆菌工程菌平板培养、PCR扩增目的基因片段、PCR产物回收与纯化、回收产物与PSURE-T载体连接、大肠杆菌液体培养、大肠杆菌感受态细胞制备及转化、筛选重组转化菌落以及通过TPTG的诱导等一系列实验，使DREB基因在原核生物体内表达，最后通过酶切及电泳检测分析，确定了由DREB基因编码翻译蛋白的正常表达，达到了DREB基因在原核体内表达的目的。
关键词：DREB；原核表达；大肠杆菌；PCR0 引言高等植物中脱水应答元件结合蛋白（Dehydration－responsive element binding protein，DREB）属于转录因子家族AP2/EREB亚族。
在应答脱水、高盐和冷胁迫中具有重要的作用［1，2］。
DREB参与了植物胁迫中有ABA 依赖和非ABA 依赖响应的2 种响应途径，研究发现DRE2 结合蛋白DBF1 和DBF2 可以与干旱响应基因的顺式作用元件特异性结合，并在ABA 依赖的小麦水分胁迫反应途径中调节与抗旱相关的rab17 基因的表达[3]提高转基因植物对干旱、高盐和冷胁迫的耐受性［4,5］。
通过在模式植物中过表达DREB 基因，已经揭示了许多植物的DREB基因在逆境胁迫应答中的作用［6］。
大肠杆菌DH5α是目前原核细胞表达系统中应用最普遍的基因工程菌之一 [7]。
大肠杆菌表达系统的发展历史可追溯到20 年前。
科学家分别将酿酒酵母DNA 片段、粗糙链孢霉DNA 片段和哺乳动物cDNA 片段导入大肠杆菌，引起其表型的改变，证明了外源基因在大肠杆菌中可以使现有功能的活性表达[8]。
与其他表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期短、抗污染能力强等特点[9-10]，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具[11-12]。
本实验通过对大肠杆菌DH5α构建DREB基因的表达载体的构建，为后续试验以及相关研究打下坚实基础。
其次，通过对含有DREB基因的大肠杆进行工程培养，也为生物科学专业学生的实验学习提供较为稳定的菌种。
1材料与方法1.1材料供试原核表达载体为大肠杆菌菌株DH5α，由新疆农业大学农学院生物技术引论与实践课程组提供。
1.2 方法1.2.1DREB 基因编码区的克隆50μL体系中含目的基因1μL，Buffer 25μL，dNTPs 2μL，正反引物1μL以及Taq 酶0.5μL［天根生物技术有限公司］，补ddH2O 至50μL。
PCR 程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。
PCR产物以1．5％琼脂糖凝胶电泳检测，利用紫外凝胶成像仪观察结果。
采用琼脂糖凝胶回收试剂盒［天根生物技术有限公司］回收目的片段，将回收产物与PSURE-T载体连接后转化E.coli DH5α感受态细胞，与X－gal 和IPTG涂于含有氨苄青霉素的LB 固体培养基上，过夜培养后挑取白色克隆，经含有氨苄青霉素的液体培养基振荡培养12h，菌液PCR 检测是否有插入片段。
1.2.2 DREB基因原核表达载体的构建及鉴定以含有DREB 基因编码区质粒为模板，使用引物，用高保真酶扩增两端带有EcoRI 和HindⅢ酶切位点的大肠杆菌DREB 基因编码区序列。
PCR 扩增体系和扩增程序同上。
获得的DREB 基因PCR 产物，凝胶回收后，用EcoRI和HindⅢ酶切PCR 回收产物和表达载体质粒。
25μL体系中包含：质粒DNA 7μL，EcoRI 1μL，HindⅢ1μL，Buffer 2.5μL和ddH2O 13.5μL。
回收双酶切产物，用T4 DNA 连接酶将DREB片段连接到载体中。
连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。
最后通过菌液PCR和酶切分析鉴定构建的DREB 基因植物表达载体，最后通过SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。
1.2.3 大肠杆菌液固体培养基的制备LB液体培养基的配制（50ml体系），胰蛋白胨0.5g；NaCl0.5g；酵母提取物0.25g，双蒸馏水约40mL（溶解）；（调pH值7.0）定容到 50ml后置于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min。
LB固体培养基的配制（50ml体系），胰蛋白胨0.5g；NaCl0.5g；酵母提取物0.25g，双蒸馏水约40mL（溶解）；（调pH值7.0）定容到 50ml，往制备好的50ml培养基倒入100mL 的三角瓶中，再往三角瓶中加入琼脂粉0.75 g ，封口，准备灭菌。
灭菌仪器为高压蒸汽灭菌锅，本次培养制备灭菌条件为121℃，20min。
2 结果与分析2.1 DREB基因的PCR扩增效果分析根据GenBank中的苜蓿DREB基因序列，设计一对带有酶切位点的引物，用PCR方法扩增DREB基因的编码区，扩增大小约为670bp（图1）。
将扩增片段与基因片段大小进行比较，结果表明两个基因大小完全一致，说明获得的DREB基因编码区是正确的，没有发生碱基变化，可以用来构建原核表载体。
但在8组平行试验中，任有一组未出现扩增效果。
出现此类结果的原因可能是该组同学在添加试剂的时候误将试剂加错，点样计量太少或者漂样也可能是导致此类结果的原因。
M．Marker DL1500；1.DREB基因扩增产物图1 DREB基因的PCR扩增结果2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化2.2.1 感受态制备原理在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌的细胞膨胀成球形。
转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基----钙磷酸复合物，此复合物粘附与细菌的表面，42℃短时间的热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。
将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得新的表型（如Amp抗性）得到表达。
然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，在37℃培养过夜，这样就得到了转化的菌落[13]。
2.2.2感受态制备步骤从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于1ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右。
将培养液转入1.5ml离心管中，4℃下5000rpm离心5min，弃上清并轻轻振动菌体；加入0.1MCaCl2溶液1ml使细胞轻悬；冰浴30min后在4℃下5000rpm离心5min；弃上清珍松菌体，加入50μL 0.1M的预冷CaCl2溶液重悬便得到了感受态细胞悬液。
2.2.3转化用移液器移取50ul感受态细胞和2μL质粒，轻轻混匀，勿吹打；同时做阴性对照即受体菌对照，50μL感受态细胞中加入2μL无菌水；冰浴30min，随后将其放入42℃恒温水浴锅中静置90s，再次冰浴2min，加入800ul 事先37℃预热的LB培养基，最后在120rpm 下恒温培养45min即转化成功。
2.3 DREB基因表达载体的构建用前向带有EcoRI和反向带有HindⅢ酶切位点的小麦DREB基因引物，以T－DREB质粒为模板，经PCR 扩增获得两端带有EcoRI 和HindⅢ酶切位点的DREB 基因编码区片段，扩增产物大小约670 bp，与预期大小相符，且无非特异扩增带。
用EcoRI和HindⅢ酶切，连接到用相同酶切回收后的表达载体上，转化E.coli DH5α，获得DREB 表达载体（图2）。
对含有重组子的大肠杆菌进行培养，然后进行菌液PCR鉴定，能够扩增出一条长约670 bp 的目的基因条带（图3）。
将阳性克隆片段大小与序列已知大小对比，结果正确，说名大肠杆菌DH5α DREB基因表达载体构建成功。
由图3可知，CK为本次试验的空白对照，但是在500bp至700bp之间也出现了较为明显的条带。
通过分析，其原因可能是由于引物受到模板DNA的污染导致条带出现。
除此之外，点样时也有可能出现漂样，样品沉降到CK的点样孔，故有条带但并不是很明显。
图2 DREB 基因原核表达载体结构示意图M．Marker DL1500；1-1至8-2.含有pSURE－DREB重组质粒的大肠杆菌DH5α菌液PCR产物图3 pSURE－DREB重组质粒PCR鉴定1.重组质粒DNA；M.Maker DL1500图4 重组质粒DNA电泳检测2.4 DREB原核表达及蛋白检测按1:100接过夜培养的菌液于50mL LB液体培养基中，220rpm，37℃恒温培养约3h，培养至OD=0.6-0.8，用不同浓度的IPTG进行诱导使其表达。
诱导结果表明，随着IPTG浓度的增加，其诱导DREB基因表达的效果越好，当IPTG的浓度为0.5mM时诱导效果最佳，浓度大于0.5mM时，诱导结果不随浓度的变化而变化。
由图（图4）可知通过SDS-PAGE电泳检测，所获得的蛋白大小在45kda左右，通过与老师验证，此蛋白大小确实为DREB基因指导翻译的蛋白大小，故DREB基因在原核大肠杆菌DH5α中表达成功。
图4 SDS-PAGE蛋白检测3讨论3.1 PCR扩增目的基因的影响因素在PCR扩增目的基因的试验中，出现了片段条带强弱分明的效果。
段新华[14]等研究表明，随着引物浓度的增加，扩增产物主带减弱，甚至可能出现非特异产物和弥散背景增强的的现象。
这是因为过高的引物浓度会增加错配的机会，试验中适当的降低引物浓度是适合的选择。
除引物的影响之外，不同的退火温度也会影响扩增效果，同样是段新华等研究结果表明，随着退火温度的降低，非特异性相对增加，也会出现背景弥散；退火温度升高，特异性相对增加。
Taq酶是Mg2+依赖型酶，反应体系中Mg2+的浓度也会影响扩增结果，随着Mg2+浓度增加，其催化作用增强，扩增产物的增多，背景也会明显增强[15]。
3.2 制备感受态细胞的影响因素感受态细胞制备是基因工程实验中尤为重要的一个部分，其结果直接影响蓝白斑筛选转化菌落。
李明才[16]等研究结果表明，CaCl2溶液浓度和感受态细胞的存放时间对转化效率有显著影响；而转化冰浴时间和转化后的振荡培养时间对转化效率无明显影响，100mmol/LCaCl2溶液制备感受态细胞，冰浴5min转化质粒，经42℃热休克作用90s后直接涂平板选择转化子，可获得快速、高效的转化效果。
本实验的蓝白斑筛选重组转化菌落实验不是很成功，其原因很有可能就是在制备感受细胞时出现差错，导致最终的筛选失败。
