鸭胚成纤维细胞的分离培养.

一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法真皮成纤维细胞是一种重要的细胞类型，其在生物医学研究、组织工程和再生医学等领域具有广泛的应用前景。

以下是一种常用的小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法：1. 实验前准备：- 小鼠或大鼠- 麻醉剂，如异氟醚等- 消毒剂- 必需的培养基和培养液2. 小鼠/大鼠的取材：- 麻醉小鼠或大鼠，确保其在实验过程中不会感到疼痛或不适。

- 消毒动物的表面，以减少细菌或其他微生物的污染。

- 取下小鼠/大鼠的皮肤。

使用消毒剪刀和镊子将皮肤切割成小块，以便后续的分离过程。

3. 细胞的分离和培养：- 将皮肤块转移到含有酶解消化液（如胰蛋白酶）的培养皿中，并在37°C的恒温搅拌器上进行酶解（通常为1-2小时）。

- 将酶解后的皮肤块过滤，移至新的培养皿中，加入培养基和培养液，如DMEM/F12或RPMI-1640，并添加10%胎牛血清。

- 将培养皿放在37°C的细胞培养箱中，保持适当的温度、湿度和CO2浓度。

- 培养皿中的细胞会开始生长和扩增。

定期更换培养基，并进行细胞的孵育以保持其正常生长。

4. 细胞的传代：- 当细胞密度达到80-90%时，使用胰蛋白酶或胰蛋白酶-EDTA溶液将培养皿中的细胞与培养皿底部松散的连接断开。

- 将细胞计数，并根据需要的细胞数量进行传代。

一般情况下，将细胞按照1:3或1:4的比例重新分装到新的培养皿中。

- 重复上述步骤，直到获得足够数量且健康的细胞。

这种方法能够有效地分离和培养小鼠或大鼠真皮成纤维细胞，为相关研究提供了重要的细胞资源。

通过优化培养条件和细胞的传代方法，可以获得高质量和稳定的细胞群体，以支持各种实验或应用的需要。

鸭瘟病毒的分离与初步鉴定程晓霞;林锋强;黄梅清;肖世峰;江斌;吴南洋;陈少莺;俞伏松【摘要】Tissue samples of liver and spleen from the Muscovy ducks that were suspected to have died from the duck plague were collected for this study.Viruses were isolated from the Muscovy duck embryo fibroblasts (MDEF) for a preliminary identification using hemagglutination assay (HA),immunofluorescence analysis (IFA),qPCR,PCR product sequencing,and animal infection test.Four virus strains,DPVfj1,DPVfj2,DPVfj3 andDPVfj4,were thus identified for further investigation.Subsequently,it was found that these strains (a) would not cause red blood cell agglutination on pigeon erythrocytes;(b) were tested negative on IFA with goose parvovirus,Muscovy duck parvovirus,duck reovirus,duck paramyxovirus,and Tembusu virus;(c) showed positive on test with fluorescence RT-PCR kit;(d) had a positive result on their PCR-amplified pair of primers from the specific fragment of gJ protein gene,JQ673560,and a homologygreater than 99 ％ on the sequence of the fragment with that of the duck plague virus (DPV) gJ protein gene;(e) infected 30-day-old ducks by injection and 5-day-old ducklings by co-habitation showing exactly the same clinical symptoms and postmortem signsas in the natural cases;and,(f)were recovered from the diseased birds.The results seemed to verify the fact that DPV caused the duck plaque in natural environment,and that the isolated strains possessed the virulent nature in question.%采集疑似鸭瘟病毒自然感染的病死番鸭的肝脾等组织,应用番鸭胚成纤维细胞(MDEF)进行病毒分离,通过对分离毒的血凝特性(HA)测定、间接免疫荧光试验(IFA)荧光定量PCR、PCR 产物测序和动物回归试验等初步鉴定.结果显示:通过MDEF从疑似病料中分离到4株病毒(DPVfj1、DPVfj2、DPVfj3、DPVfj4),均不能凝集鸽红细胞;IFA结果排除了分离毒为鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭副粘病毒和禽坦布苏病毒;鸭瘟病毒荧光PCR试剂盒检测分离毒核酸均为鸭瘟阳性;鸭瘟病毒(JQ673560)酣蛋白基因序列特异引物进行PCR扩增均为阳性,且PCR产物序列与鸭瘟病毒参考株gJ蛋白基因序列相似度均大于99％;动物回归试验显示,分离毒人工感染30日龄番鸭和同居感染5日龄雏番鸭均可复制出与自然感染一致的临床表现及病理变化,并能回收到病毒.上述结果表明4株分离毒均为鸭瘟病毒强毒株.【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2017(032)008【总页数】4页(P833-836)【关键词】鸭瘟病毒;分离;鉴定【作者】程晓霞;林锋强;黄梅清;肖世峰;江斌;吴南洋;陈少莺;俞伏松【作者单位】福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州 350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州 350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州 350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州 350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州 350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州 350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州 350013;福建省农业科学院生物技术研究所,福建福州 350003【正文语种】中文【中图分类】S852鸭瘟(Duck plague，DP)，又名鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis，DVE)，是由鸭瘟病毒(duck plague virus，DPV)引起的鸭、鹅、雁及其他雁形目禽类的急性、败血性、高度致死性传染病，是危害养鸭业的重要疾病之一，该病流行广泛，传播迅速，发病率和死亡率高，曾给世界各国造成巨大的经济损失[1-3]。

小氯歴於成纤维细胞的分离和培养、实验材料1. 主要仪器役备(1) 倒置显微镜(Olympus, Japan)(2) CO2培养箔(BB16HF,上海力申科学仪器有限公司)(3) 100ml 的玻璃焙养瓶(江苏海门市大路塑料实验仪彖厂)(4) 6孔培养板(COSTA, R 每孔直径为3.5cm)(5) Eppendroff 管(6) 1ml,2ml,5ml 的玻璃摘管各30支；10ml 尖底禽心管和直径为8cm 的平皿(7) 雳心机(8) 5ml 冻存管(9) 两套小亂用解刘器械(包括眼科剪和眼科＜)2. 主要试利配制(1) MEF(mouse embryo fibroblast ,小亂軀於成纤维细胞)培养液---- 低糖DMEM 母液1) 用一个1000ml 的大烧杯加入1000ml 无蔺无内毒素的超纯木(购自福州新北生化工业有限公 司)； 2) 将一小软低DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，幷冲 洗 包装袋的内面以冼下所有的粉未。

3) 每升培养基中添加3.7gNaHCO3。

4) 搅拌直至完全涿鮮。

5) 用1NHCI 或1NNaOH 调培养基的pH 至比最终的工作液的PH 低0.2-0.3 ,调好PH 后，将彖器•密 封01该实验中用1NHCI 调PH 至7.3 )o6) 立即用0.22um 的滤彖过德除菌，装入需压过的盐木瓶中，4°C 保(1存个月内用完)。

----------------- MEF 培 养液取100ml 上述配好的低穗DMEM 液体，加入10000IU 青霉素钠(6.25mg )和10mg 链霉素，溶鮮后再次 调节PH 至7.3,经0.22um 的滤黑过滤至壽压过的血请瓶中，再添加 10ml 分装好的新 生牛血请(Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需 56°C, 30min 夭涪过)，4°C 保存至使用。

鸭子白点病的诊治-养鸭技术鸭“白点病”是由鸭疱疹病毒III型引起番鸭和半番鸭的一种病毒性禽类传染病，鸭子一般多在35日龄以内发病，发病率为30-90%，死亡率一般在65%-85%以上，因此又叫鸭新病。

应激条件下、环境卫生差的场易发，且在应激和混合感染的情况下，其死亡率高可高达90％，是目前危害养鸭业的又一大敌。

一、病原有关该病的病原还有不同的观点，有人认为番鸭“花肝病”病原是呼肠孤病毒科呼肠孤病毒属的一个新种。

他们在番鸭胚成纤维细胞培养上接种病料后，在胞浆内看到大量球形、无囊膜、双层衣壳(外壳直径70-75纳米，内核直径45纳米)的病毒粒子。

但是，还有一种观点认为本病是由一种疱疹病毒引起。

由于该病主要发生在雏鸭特别是雏番鸭，而成年普通鸭发病轻微，且不被经典的抗鸭瘟血清所中和，因而被认为是一种在血清型上不同于鸭瘟病毒的刨疹病毒。

二、临床症状病鸭精神高度沉郁、全身无力，不喜欢走动；脚发软，愿意趴着；鸭头无规则摆动，还有的扭脖子或者转圈；食欲和饮欲减退；严重腹泻，排白色或绿色稀粪[]，肛周羽毛沾有多量粪便。

病鸭具有代表性的的剖检变化是在鸭子的肝脏、脾脏、肾脏、胰腺等内脏表面有针尖大小并且数量不等的白色或红白色坏死灶；在鸭子肠道剖检时可以见到出血面。

三、剖检病变病死鸭最具有特征的剖检病变为肝脏、脾脏、胰腺、肾脏有数量不等、针尖大的白色或红白色坏死点。

肠道（主要是十二指肠、直肠）可见出血及出血环。

此外，脑壳内壁、脑膜等轻度出血，胆囊充盈胆汁、极度臌胀。

四、预防措施1.整个鸭场在饲养环节上一定要加强管理，才能使整个鸭群的健康水平得到提高，鸭群的机体抗病能力不断增强。

2.坚持自繁自养是鸭场的关键所在，即使需要从外地购进种蛋或名种雏的时候，一定要严格依照国家规定的程序进行检验，确保没有感染该种疫病后，才能把它引入鸭场。

3.消毒是饲养环节的关键，所以鸭场消毒设施必须达到饲养场标准，并且要建立严格的防疫消毒制度和程序。

鸭胚脐带间充质干细胞的分离培养及其生物学特性王文杰;关伟军;马月辉;李向臣【摘要】为了给脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)的临床应用提供依据,以鸭胚UCMSCs为研究对象,采用胶原酶Ⅳ消化法分离脐带间充质干细胞,用表面标记分子CD29,CD44,CD71,CD73对纯化细胞进行鉴定,建立了鸭胚UCMSCs的体外培养体系.结果表明,UCMSCs能够诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞,证明了鸭胚UCMSCs的多能性.【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2015(027)011【总页数】7页(P1903-1909)【关键词】鸭胚;脐带间充质干细胞;生物学特性;诱导分化【作者】王文杰;关伟军;马月辉;李向臣【作者单位】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193【正文语种】中文【中图分类】S834;Q813.1间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，主要存在于结缔组织和器官间质中。

其中脐带间充质干细胞（UCMSCs）具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等优点，因此有可能成为具临床应用前景的多能干细胞。

脐带由被覆羊膜的上皮细胞包裹。

脐带内含两条动脉和一条静脉，在血管周围含有胚胎结缔组织——华尔通胶。

华尔通胶含有糖蛋白微纤维和胶原纤维网络［1］。

脐带血管由交错的胶原纤维和小维管束排列而成的一个连续而柔软的骨架包裹［2］。

华尔通胶中最丰富的糖胺聚糖是透明质酸［3］，它在成纤维细胞和胶原原纤维周围形成了一个水合凝胶层并支持脐带的组织结构来保护脐带免受压力［4］。

华尔通胶中的表型基质细胞是成纤维样细胞［5］，这些成纤维样细胞就是脐带间充质细胞。

骨骼肌成纤维细胞分离培养
骨骼肌成纤维细胞（skeletal muscle fibroblasts）的分离和
培养是一种常用的实验技术，用于研究骨骼肌相关的生物学过程以及
肌肉疾病等。

以下是骨骼肌成纤维细胞分离培养的一般步骤：
1.准备离体骨骼肌组织。

从小鼠或人的骨骼肌中取出组织，最好是新鲜组织以确保细胞的活力。

2.组织消化。

将骨骼肌组织切成小块，用胶原酶或胰蛋白酶等消化酶进行消化，使细胞从组织中释放出来。

3.细胞筛选。

通过过筛网或离心的方式将消化后的细胞悬浮液筛选，去除大部分的纤维束和其他细胞类型。

4.细胞培养。

将筛选后的细胞悬浮液转移到培养皿中，添加含有合适培养基和补充物的培养液，将培养皿放置在适当的培养箱中。

5.培养条件。

骨骼肌成纤维细胞通常在37°C的孵育箱中，与5% CO2的空气保持湿润的环境中培养。

6.细胞生长和传代。

骨骼肌成纤维细胞会在培养皿中黏附并开始增殖。

当细胞达到一定密度时，可以进行传代，将细胞分离并分散到
新的培养皿中。

需要注意的是，分离和培养骨骼肌成纤维细胞需要一定的实验技巧和设备，以保证细胞的存活和生长。

同时，细胞的培养基选择和培
养条件的控制也对细胞的生长和功能有重要影响。

因此，在进行这项
技术时，需要按照具体实验要求和相关文献中的方法进行操作。

鸡马立克氏病病毒的实验室诊断
从病鸡和许多外表正常的鸡体中都不难分离出病毒株。

供分离病毒用的首选样品是肿瘤细胞、肾细胞以及脾或周围血液的白细胞。

由于mdv在这些组织中是高度细胞结合性的，所以必须用全细胞作为接种物。

羽毛囊是从病鸡中分离完整病毒粒子的唯一良好来源。

被怀疑含有mdv的样品，可以用接种易感鸡、细胞培养物和鸡胚的方法来分离病毒。

雏鸡接种法：这是分离mdv最敏感的方法。

选择易感鸡，在1日龄或l周龄内用腹腔接种的途径进行感染，然后严格隔离饲养观察。

接种后经18 -21天，对试验鸡连同相应的阳性和阴性对照，进行有无感染迹象的检查。

试验应至少持续10周。

细胞培养法：这种方法的敏感性虽不如雏鸡接种法，但简单易行，仍很有实用价值。

首先要制备鸭胚成纤维细胞或鸡肾细胞的培养物，最适宜的接种物是白细胞、肿瘤细胞或血液。

5 - 14天出现典型的mdv 蚀斑，而对照培养物中不见这种变化，这就是分离到mdv的证据。

这种特征性的蚀斑，由圆形和梭形的折光性细胞和含有cowdrva型核内包涵体的多核细胞所组成。

鸡胚接种法：通过卵黄囊或绒毛尿囊膜途径接种病毒的鸡胚，分别于接种后4-6天或10-11天在绒毛尿囊膜上产生痘样病斑。

在实验室诊断中，md的血清学试验通常用琼脂凝胶免疫扩散试验，检测mdv抗原及其沉淀抗体。

用荧光抗体法或酶抗体法检查病鸡组
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