大鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及生物学特性

2002年8月第12卷　第4期中国实验动物学杂志CHINESE J OUR NAL OF LABOR ATORY ANIMAL SCIEN CE Augus t ,2002Vol .12　No .4研究报告小鼠胚胎成纤维细胞的分离、扩增和抑制刘民　李柏青(蚌埠医学院,蚌埠市　233003) 【摘要】　目的　建立有效的胚胎成纤维细胞饲养层体系,用于分离和克隆胚胎干细胞研究。

方法　取胎鼠组织制备小鼠原代成纤维细胞,观察不同分离和培养条件对细胞增殖的影响,以及丝裂霉素C 对细胞增殖的抑制作用;细胞增殖的数量用MTT 法测定。

结果　分离小鼠胚胎原代成纤维细胞的最适胎龄是12.5～14.5d ;20℃～25℃时,用0.25%胰蛋白酶消化组织的最佳时间为3min ;可在培养3～6d 后进行传代。

细胞冻存于-80℃3～4个月,复苏后能正常传代。

丝裂霉素C 抑制胚胎成纤维细胞增殖的合适浓度为每毫升20μg 105细胞,作用2～4h ,可维持小鼠原代胚胎成纤维细胞9d 内不增殖也不死亡。

结论　在合适条件下,小鼠原代胚胎成纤维细胞能顺利分离和培养,并能多次传代和冻存;经丝裂霉素C 处理后增殖受抑制,可作为饲养层细胞用于胚胎干细胞的研究。

【关键词】　小鼠;胚胎;成纤维细胞;胚胎干细胞【中图分类号】Q952 【文献标识码】A 【文章编号】1002-1485(2002)04-0215-05Study on the Proliferation and Inhibition of Mouse Embryonic FibroblastsLIU Min ,LI Baiqing(Bengbu M edical College ,Bengbu 233003,China )【Abstract 】　Objective To establish mouse fibroblast cells as feeder cells in order to isolate and clone mouse embryonic stem cells in vitro .Methods The mouse primary embryonic fibroblasts were isolated from mouse fetus of different gestational ag -es ,under different separation and culture conditions .The proliferation of fibroblasts and in hibition of mytomycin C were observed by measuring cell numbers using MTT assay .Results The optimal gestational age for isolation of mouse embryonic fibroblasts was from on 12.5to 14.5day .At the temperature of 20to 25℃,the optimal ti me for digestion of fetus tissue to obtain fibroblasts was 3min with digestion solution containing 0.25%of trypsin .The optimal concentration of mytomycin c to inhibit proliferation of fi -broblasts was 20μg 105cells for 2to 4hours ,at that condition of treatment of mytomycin C the fibroblasts were alive for 9days without proliferation .Conclusion In this study the mouse embryonic fibroblasts were successfully established for growth of mouse embryonic stem cells .【Key words 】　Mice ;Embryo ;Fibroblasts ;Embryo stem cells[作者简介]刘民,男(1963-),高级实验师。

甲状腺成纤维细胞的分离、培养和鉴定
材料和试剂：来源：SD大鼠
手术器材：手术剪（镊）、解剖镊、眼科剪（镊）、显微镊
清洗液：PBS
培养液：DMEM添加20%FBS200IU双抗
破红液：常规配方
具体操作：1、将300uL的3％戊巴比妥注入SD大鼠体内，待大鼠麻醉至昏厥状态时，将大鼠转入75%的酒精最浸泡5min。

2、在无菌条件下，将大鼠放置于泡沫板上，四肢用针头固定。

3、用左手持直头眼科镊子夹住大鼠腹部最下方的皮毛，右手拿手术剪将大鼠的皮剪开，沿着腹部下方一直剪至大鼠下颚，将下颚的皮毛去掉。

4、剪开大鼠的皮毛看见覆盖在气管上方的肌肉组织，左手换一个无菌的弯头眼科镊子，右手拿另一个无菌的手术剪，将肌肉组织剪开后即可发现气管，将气管周围的组织轻轻去除，即可看见气管及覆盖在气管周围的甲状腺组织，左手将气管下端轻轻固定，右手拿手术剪将甲状腺连着气管剪下来。

5、在无菌条件下，左手拿直头显微镊子将气管轻轻固定，右手拿弯头显微镊，除去连在气管及甲状腺外壁的结缔组织，然后用动脉剪将甲状腺从气管上剪下来，尽量不要剪刀气管，用预冷的PBS 清洗3次。

6、左手拿直头显微镊子将分离的甲状腺轻轻固定，右手用动脉剪剪成1mm³大小的组织块后，再用PBS清洗2-3次。

7、将组织块植入6孔板，组织块之间的间隙在3mm³左右，用枪头吸取多余的液体，将6孔板倒扣在培养箱中2小时，加入培养液1mL静置培养5天，5天即可观察到食管外膜成纤维细胞爬出，如图所示。

8、5天后移去组织块，待细胞长满6孔板后，用时差贴壁法纯化细胞，细胞纯度达90%以上后，可冻存保种。

图1.用Vimentin抗体鉴定甲状腺成纤维细胞
武汉云克隆诊断试剂研究所。

胎鼠肺成纤维细胞原代培养摘要：目的改良胎鼠肺成纤维细胞的培养方法方法：取19 d胎龄129孕鼠,开胸取出胎肺,用胰酶稍微消化,再进行组织悬液贴壁培养。

传代的肺成纤维细胞用免疫组化检测其vimentin和laminin的表达.结果24 h后镜下可见组织块周边有长梭型细胞爬出，48 h后生长迅速，3 d接近融合。

传代后杂细胞基本去除，5代后细胞的增殖能力逐渐下降。

结论：胰酶轻度消化后组织悬液贴壁法是一种可靠快速的肺成纤维细胞分离纯化培养方法.肺成纤维细胞的体外培养（Lung fibroblasti，LF）的体外培养为研究肺的发育，肺纤维化的发病机制以及其他肺部疾病的研究提供了重要的细胞模型。

而胎肺成纤维细胞的培养，对于早产儿肺部疾病、肺发育以及成纤维细胞的异质性研究均有重要意义。

为此，本文改良了以前我们所学过的小鼠肺原代培养技术，建立了一种胎鼠肺成纤维细胞分离纯化、培养的可靠简便方法。

一、材料与方法用超纯水溶解的H-DMEM的培养基（Gibo），补加NaHCO3 2g/L 及HEPES 2g/L,过滤除菌。

在-20℃以下保存备用，使用前添加15％新生牛血清（NBS）、青霉素100IU/ml、链霉素100ug/ml。

消化液：0.25％胰蛋白酶，抗vimentin(波形但蛋白)和laminin(层粘蛋白)。

二、实验动物年龄为7-8周的性成熟129小鼠，雌雄鼠按3:1同笼过夜，次日晨检查见雌鼠阴道阴栓针为孕0.5d。

孕期满18d(足月为22天)时，进行剖宫产术取出胎鼠。

三、肺成纤维细胞分离培养方法孕鼠断头处死小鼠，无菌术开胸，取出胎鼠，置于放有PBS的无菌培养皿中，取出胎肺，反复用PBS冲洗至肺组织发白，用手术剪将肺组织剪碎（小于1mm3）,移至10mL离心管中，静置5分钟后，尽量把PBS吸出，然后按1:1比例加入0.25％胰蛋白酶（37℃预温），用吸管反复吹打1分钟，加入含15％新生牛血清（NBS）的H-DMEM 的培养液终止消化，用吸管吹打均匀，1000r/min离心3min,弃上清，再加入少量15％新生牛血清（NBS）的H-DMEM的培养液悬浮组织块，加入培养液不飘起组织块为宜。

气管镜肺活检（TBLB）和局部肺泡灌洗，肺活检报告示慢性肉芽肿性病变伴凝固性坏死，灌洗液和痰均找到抗酸杆菌，最终诊断为两肺肺结核。

经过HRZE四联抗结核治疗，辅以激素控制结核中毒症状，患者病情迅速好转出院。

成人继发性肺结核影像常常呈现为多形态表现（即同时出现渗出、增殖、纤维和干酪性病变，还可伴有钙化），容易形成空洞。

而本例患者起病较急，影像表现为两肺弥漫性肺间质病变、左肺大片实变、两肺斑片状阴影等多种病变，显然与典型继发性肺结核的表现有许多不同。

与一般的成人继发性肺结核相比，有免疫损害及老年肺结核患者表现常常不典型。

有资料认为成人继发性肺结核的不常见的X线表现有：①下肺结核；②粟粒性肺结核伴两肺间质性病变；③类似肺癌的纤维干酪块；④胸片正常。

回顾本例的诊治过程，我们的体会是：目前肺结核的临床表现多种多样，为了尽可能的减少肺结核的漏诊和误诊，提高对类似下呼吸道感染表现的肺结核的认识，了解和熟悉肺结核少见的X线表现，注意结核的高危因素和高危人群及胸部影像学的追踪观察，重视痰找抗酸杆菌、纤维支气管镜、组织活检病理等检查是十分必要的。

成年大鼠肺成纤维细胞的原代培养和鉴定徐卫华沈华浩浙江大学医学院附属二院呼吸科，浙江大学呼吸疾病研究所（310009）体外培养肺成纤维细胞是研究肺部疾病如支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化等的重要手段和工具。

目前对于成年大鼠肺成纤维细胞的原代培养，国内尚未见报道。

我们利用组织块培养法对成年SD大鼠肺成纤维细胞进行了原代培养，并用免疫细胞化学的方法进行了鉴定。

一、材料和方法1．试剂和器材0.25%胰蛋白酶（杭州吉诺公司），DMEM细胞培养液（杭州吉诺公司），胎牛血清（杭州四季清公司），兔抗人Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体及鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司），免疫组化染色SP试剂盒（北京中山生物技术有限公司），小鼠抗波形蛋白单克隆抗体及免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养是一项重要的实验技术，可以用于研究心肌细胞的生理和病理过程。

下面将介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养的步骤和注意事项。

一、心肌细胞的分离鉴定：1. 材料准备：- 大鼠心脏- 胰蛋白酶- 培养基（如DMEM/F12）- FBS（胎牛血清）- 抗生素（如青霉素/链霉素）- 生长因子（如胰岛素、培养基因素等）2. 心肌细胞的分离：- 用冰盐水冲洗大鼠心脏，将心脏置于0.1%胰蛋白酶溶液中，37℃恒温水浴放置15-20分钟。

- 取出心脏，去除杂质，用小孔濾网过滤，收集滤液。

- 加入预先冷却的培养基，离心分离细胞。

- 以适当的浓度重新悬浮心肌细胞。

3. 心肌细胞的鉴定：- 用显微镜观察细胞形态，心肌细胞的特点是形状呈纺锤形，具有交叉纹理。

- 心肌细胞可以用荧光染色的方法标记心肌肌纤维，如使用α-肌动蛋白标记。

- 用特异性抗体进行免疫染色，如心肌细胞特异性标志物肌球蛋白T (cTnT)。

2. 培养心肌细胞：- 将分离得到的心肌细胞在含10% FBS培养基的培养皿中培养。

- 培养皿放置于37℃恒温培养箱中，维持5% CO2的湿润环境。

- 每2-3天更换一次培养基，并观察细胞生长情况。

3. 细胞的凋亡和增殖：- 可以通过荧光染色，如使用Dapi染色观察细胞核形态来检测细胞凋亡。

- 可以使用CCK-8法或MTT法来测定细胞增殖情况。

4. 细胞的存活和形态观察：- 可以使用乙酰胆碱酯酶染色来观察细胞存活情况。

- 使用显微镜观察细胞形态的变化和生长状态。

总结：大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养是一项重要的实验技术，在心脏病等相关研究中有着广泛的应用。

通过使用适当的培养基和条件，合理观察和分析细胞的形态和生理活性指标，可以用于研究心肌细胞的生理功能和分子机制，为心脏疾病的治疗提供基础和参考。

大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是心脏组织中最主要的细胞类型，其具有重要的研究价值和应用前景。

本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和技巧，以供需要的研究者参考。

一、大鼠心肌细胞的分离1. 质子化心肌细胞将雄性大鼠（体重200-250g）置于无菌条件下，去毛、消毒，然后迅速取出心脏，置于含有生理盐水的培养皿中。

使用显微镊子和显微刀将心脏分割成小块，使得心肌组织充分暴露。

将小块心肌组织转移至含有0.05%的胰酶和0.1%的胰蛋白酶的新鲜培养液中，温育30分钟至1小时。

温育完成后，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基冲洗心肌组织，过滤去除残留的纤维和细胞碎片。

对心肌组织进行胶原酶-胰蛋白酶消化，离心沉淀后获取心肌细胞。

2. 分离和纯化获得的心肌细胞需要经过一定的分离和纯化步骤，以消除其他非心肌细胞的干扰。

常用的分离方法包括稳定梯度离心法、摇床培养法和免疫分选法。

通过适当的分离方法，可以获得较为纯净的大鼠心肌细胞用于后续研究。

1. 形态学鉴定通过显微镜观察大鼠心肌细胞的形态结构，包括细胞形状、大小、核与细胞浆的比例等，进行初步的鉴定。

正常的心肌细胞呈长条状，具有跨膜结构，胞质内含有丰富的线粒体和肌纤维等特征。

2. 免疫细胞化学鉴定通过特异性抗体对心肌细胞进行染色和标记，观察其对特定标记蛋白的表达情况。

常用的标记蛋白包括肌动蛋白、肌球蛋白、心肌肌球蛋白等。

通过免疫细胞化学鉴定，可以明确心肌细胞的特异性。

1. 培养基的选择大鼠心肌细胞的培养通常选用DMEM（Dulbecco's modified eagle's medium）培养基，添加10%的胎牛血清和适量的抗生素。

培养基的pH值应调整在7.2-7.4之间，以及含有必要的营养物质和生长因子。

2. 细胞密度和培养条件将鉴定过的心肌细胞悬浮于培养基中，调整成合适的细胞密度后，接种于预先涂覆明胶质或明胶胱聚糖混合物的培养皿中。

中华鼢鼠成纤维细胞体外培养建系及其生物学特性分析中华鼢鼠(Mospalax fontanieri)为鼹形鼠科、鼢鼠亚科、鼢鼠属动物,目前还没有该动物成纤维细胞建系及细胞生物学特性的研究。

作为蒙古高原代表性动物遗传资源,本研究采集中华鼢鼠9种组织用于实验,其中气管、肺和剑状软骨3种组织成功建立成纤维细胞系并分析了这些细胞的生物学特性。

主要实验方法是通过细胞计数法计算细胞的贴壁率、冻存前及复苏后的存活率、绘制细胞生长曲线;制备常规染色体标本分析染色体核型;采用DNA测序方法测定中华鼢鼠线粒体DNA的Cyt-b,D-loop,ND4基因序列,评价其进化地位。

实验结果显示:中华鼢鼠气管、肺、软骨3种组织在体外条件下培养第3~4天出现成纤维样细胞,分别在培养第11天、第16天、第17天原代细胞90%以上汇合。

3种组织来源体细胞均显示成纤维细胞特征,气管成纤维细胞贴壁能力最强,24 h贴壁率最高能达到98.10%,肺成纤维细胞与剑状软骨成纤维细胞贴壁能力较弱,24 h贴壁率最高,分别为95.28%和94.88%。

3种不同组织来源成纤维细胞冻存成活率均显著下降,P4~P8气管成纤维细胞存活率为:冻存前98.92%~93.20%,复苏后91.57%~73.25%,P4~P8肺成纤维细胞存活率为:冻存前98.92%~89.33%,复苏后89.97%~70.21%,P4~P6剑状软骨成纤维细胞存活率为:冻存前98.52%~82.91%,复苏后88.23%~69.06%。

3种成纤维细胞的生长曲线均呈“S”型,其中气管成纤维细胞增殖能力最强,在24孔板的每个孔中,其最大增殖数目为2.435×10~4个,肺成纤维细胞最大增殖数目为1.813×10~4个,剑状软骨成纤维细胞最大增殖数目为1.521×10~4个。

核型分析结果显示,中华鼢鼠的成纤维细胞染色体数目为2n=62,30对为常染色体,形态类型为2st+28sm。