成纤维细胞分离方法

大鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及生物学特性商爱民;吴靖芳;薛刚;张静;张耕【摘要】目的:探讨影响大鼠胚胎成纤维细胞(REF)分离和培养的一些因素,以建立稳定的REF培养体系.方法:取SD大鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对REF的生长形态、生长曲线进行观察,以探讨不同胚胎日龄以及不同胰酶作用时间对REF分离及培养的影响,并对其进行免疫细胞化学鉴定.结果:13.5d 胎龄鼠胚的REF分离效果优于10.5d、18.5d 胎龄鼠胚;REF在体外为贴壁生长型细胞,第三代细胞增殖旺盛;并表达波形蛋白(vimentin)、层黏连蛋白(laminin,LN)和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)蛋白.结论:13.5d 胎龄SD大鼠REF以H-DMEM做培养基,在第3代增殖旺盛,合成多种细胞外基质,最适宜作胚胎干细胞或其它悬浮培养细胞的饲养层.【期刊名称】《神经药理学报》【年(卷),期】2010(027)003【总页数】4页(P17-20)【关键词】大鼠;胚胎;成纤维细胞;层黏连蛋白;纤维连接蛋白【作者】商爱民;吴靖芳;薛刚;张静;张耕【作者单位】河北北方学院教务处,河北,张家口,075000;河北北方学院基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北,张家口,075000;河北北方学院附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科,河北,张家口,075000;河北北方学院基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北,张家口,075000;河北北方学院基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北,张家口,075000【正文语种】中文【中图分类】R329.2;Q256胚胎成纤维细胞饲养层是体外成功培养人胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)细胞的必要条件。

主要分泌某些细胞因子如成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子[1],以促进 ES细胞增殖以及抑制分化。

同时又能分泌细胞外基质,如纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、层黏连蛋白(laminin,LN)等。

原代细胞分离与培养，你都掌握了吗？导语对于⼤部分科研⼈员来说，研究中⼀般⽤到均是现成的细胞系/株，我们只需要：进⾏细胞传代和保种。

然⽽，这些细胞系常常由于体外长期培养，⽽丢失原有⽣物学特性，对药物处理的反应差距越来越⼤。

因此，原代细胞的地位⽇渐凸显，Paper中若有了原代细胞的数据都会添⾊不少。

然⽽，就⼩编亲⽣经历，原代细胞分离着实是个技术活，今天我们就结合⾃⾝经验，为⼤家介绍：肿瘤组织和正常组织的原代细胞的分离与培养⽅法。

第⼀部分：原代细胞的基本知识1. 什么是原代细胞培养?原代细胞（Primary cells）：是指直接从机体取出的组织或细胞获得单个细胞并在体外进⾏培养的细胞。

这⾥的组织主要指：组织器官、外周⾎及胚胎等。

原代细胞培养：由于原代细胞⽣长缓慢，繁殖⼀定的代数停⽌⽣长（⼀般10代以内）。

所以⼀般认为：培养的原代的第1和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。

2. 原代细胞与细胞系（cell lines）的区别原代细胞和细胞系的⽐较：Primary cells Cell lines增殖能⼒较弱强繁殖代数⼀般只能传10代以内⽆限增殖，50代左右遗传物质完整性遗传物质未改变遗传物质发⽣改变⽣物特性最接近临床样本偏离临床样本培养容易程度⽐较复杂简单，易操作原代细胞和细胞系的⽐较3. 原代细胞的应⽤由于原代细胞⽣物学特性未发⽣很⼤改变，最接近和反映体内⽣长特性，因此是：(1) 研究⽣物体细胞的⽣长、代谢、繁殖提供有⼒的⼯具；(2)更好实现精准医疗的肿瘤诊治模式，实现个体化精准⽤药的⽬的。

第⼆部分：原代细胞分离和培养技术原代培养的原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常⽤胰蛋⽩酶/胶原酶)、螯合剂(常⽤EDTA)或机械⽅法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以⽣存、⽣长和繁殖，这⼀过程称原代培养。

主要包括取材——分离——培养等3部分；在原代细胞应⽤较多的包括：组织器官（如实体瘤、⽪肤等）、悬浮细胞的取材等。

成纤维细胞科技名词定义中文名称：成纤维细胞英文名称：fibroblast定义：普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞。

分泌前胶原、纤连蛋白和胶原酶等细胞外基质成分，伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。

所属学科：细胞生物学（一级学科）；总论（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布百科名片疏松结缔组织中的成纤维细胞成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。

成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。

根据不同功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。

成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。

目录编辑本段细胞的功能活动状态划分根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动；纤维细胞（fibrocyte）功能活动不活跃，细胞轮廓不明显，核小着色深，核仁不明显，细胞质少。

此二型细胞可互相转化。

[1]编辑本段来源成纤维细胞：数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平细胞，细胞核呈规则的卵圆形，细胞轮廓不清。

成纤维细胞摄取所需的氨基酸，如脯氨酸和赖氨酸等，在粗面内质网的核蛋白体上合成前α多肽链（proalpha polypeptide chain），多肽链输送到高尔基复合体后，组成前胶原分子（procollagen）。

前胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞外。

在前胶原肽酶催化下，将每一前α多肽链的尾段除去，成为原胶原分子（tropocollagen）。

早胜牛胚胎和耳缘成纤维细胞分离培养与鉴定陈士恩;仝伟建;郭鹏辉【摘要】为了建立早胜牛胚胎和耳缘成纤维细胞体外分离培养体系,采用植块法和酶消化法制备这两种组织成纤维细胞.结果显示,用植块法制备了耳缘成纤维细胞,组织块直径较小的成活率较高且生长速度较快；用酶消化法制备了胚胎和耳缘两种组织成纤维细胞,复苏后细胞的存活率:胚胎(96.8％)＞耳(94.7％00).2种组织成纤维细胞生长曲线均呈“S”型,胚胎组织(倍增时间29.7 h)生长速度快于耳组织(倍增时间31.2 h).用免疫组织化学染色鉴定证实,分离培养的成纤维细胞中间丝被染成棕黄色,波形蛋白呈阳性反应.%The embryo and ear marginal fibroblasts in Zaosheng cattle were isolated and identified in vitro using enzyme digestion and explant culture. The survival rate of ear marginal fibroblasts cultured with smaller explant were higher than that with bigger tissue. The growth curves of the embryo and ear marginal fibroblasts cultured with enzyme digestion were sigmoid type. The doubling time of embryo fibroblasts (29. 7 h) was shorter than ear marginal bibroblast (31. 2 h). The survival rate of defrozen embryo fibroblasts (96. 8%) was higher than that of ear marginal fibroblasts (94. 7%). The immunohistochemical staining was used to identify that intermediate filament proteins of isolated fibroblasts were stained tan, showing vimentin reaction is positive.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2012(039)003【总页数】5页(P148-152)【关键词】成纤维细胞;组织块培养;酶消化培养;免疫组织化学染色【作者】陈士恩;仝伟建;郭鹏辉【作者单位】西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030【正文语种】中文【中图分类】S852.16+1早胜牛主要分布于甘肃省庆阳市宁县境内，以牛肉适口性好、大理石花纹清晰、肉嫩多汁闻名于世，是甘肃省特有的地方黄牛品种，1986年被列入《甘肃省家畜品种志》。

巨噬细胞与成纤维细胞作用的研究套路巨噬细胞与成纤维细胞作用的研究套路可以包括以下几个步骤：
1. 巨噬细胞与成纤维细胞的分离和培养：通过适当的分离方法，将巨噬细胞和成纤维细胞从组织中分离出来，并在适当的条件下进行培养。

2. 观察巨噬细胞与成纤维细胞的相互作用：可以通过共培养、荧光染色、免疫荧光染色等技术观察巨噬细胞与成纤维细胞之间的相互作用。

3. 检测巨噬细胞与成纤维细胞之间的信号转导：通过检测相关的信号分子、激酶活性等，研究巨噬细胞与成纤维细胞之间的信号转导机制。

4. 基因敲除或药物干预：通过基因敲除技术或药物干预手段，研究特定基因或药物对巨噬细胞与成纤维细胞相互作用的影响。

5. 动物模型验证：将分离培养的巨噬细胞与成纤维细胞注入动物模型中，观察其在体内的相互作用和效果。

6. 临床样本分析：收集临床样本，通过免疫组化、qPCR、Western blot等技术分析巨噬细胞与成纤维细胞的相关指标，进一步验证研究结果。

7. 总结与展望：对整个研究过程进行总结，分析结果，并针对不足之处提出展望，为未来的研究提供思路和方向。

通过以上研究套路，可以深入探究巨噬细胞与成纤维细胞之间的相互作用及其在疾病中的作用，为相关疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。

一，酶消化法制备猪胎儿成纤维细胞猪胎儿成纤维细胞制作方法的改进及应用20021. 3. 1剪切猪妊娠35 d，剖腹手术取出子宫，用75% 的酒精浸泡消毒，无菌取出胎儿，用含双抗的PBS ( 137mmol /L NaCl2. 7 mmol /L KCl 10 mmol /L Na2HPO4 2 mmol /L KH2 PO4 1 mmol /L CaCl20. 5mmol /L MgCl2 ) 漂洗2 遍，放入含双抗的PBS 中，分离2 个胎儿,放于塑料平皿中, 用无Ca 2+、Mg2+，含有双抗的PBS 缓冲液洗涤3次, 洗至无色, 备用。

将洗涤好的胎儿转移到另一平皿中,用无菌剪子剪掉头,四肢, 尾,去掉内脏, 继续用无Ca2+、Mg2+- PBS 缓冲液洗涤数次, 洗至无色, 将剩余的部分放入到100mm 的平皿中，然后用剪子将胚胎剪切成2～3 mm 小块, 将碎块转移到50ml离心管中。

1. 3. 2消化向放有组织块的离心管中加入二分之一离心管体积的0.25% Trypsin-0.04%EDTA 消化液（胰蛋白酶常用浓度为0.25%，PH为8.0。

也有用胶原酶的，因为此酶消化温和，但是价格高，如果用胶原酶则为胶原酶+DMEM+Antibiotic-antimycotic，小鼠多用10ml离心管，因此加入胰酶消化液5ml即可）然后在室温下轻轻吹打组织块(或者，在37℃水浴摇床内消化)。

室温消化15～20 min 左右（如果在37摄氏度最好在5min 内消化完）。

可以边消化边吹打组织块, 也可以每隔5 min 吹打一次。

消化结束后, 加入等体积的终止液10% 胎牛血清的DMEM 培养液(即吸出来细胞上层液如果多则放于到5ml 离心管中，如果少则放于1.5ml离心管中）,并轻轻吹打。

1. 3. 3离心、接种和培养800 r·min 离心5 min, 弃上清液, 然后加入5ml（或1ml) 的含20%胎牛血清的低糖DMEM 培养液培养基, 轻轻吹打重新悬浮细胞, 按常规方法进行细胞计数（1ml离心沉淀的细胞数=5个中方格中细胞个数X 5 X10 X1000 X稀释倍数，此时的计算值为体细胞的密度即个/ml. 大约徘徊在1-3 x 106个/ml）。

原代细胞分离培养鉴定（SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞）目录 3 原代分离——SD 大鼠心肌细胞的分离4 原代分离——SD 大鼠心肌成纤维细胞的分离SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维的分离目的与意义（心肌细胞）心肌细胞体外培养可以为心肌细胞生理、药理及心血管相关研究提供有效、稳定的实验模型，在医学领域有着广泛的应用前景。

体外培养的心肌细胞可保存其形态结构和功能上的某些特点，同时去除了体内外各种限制因素的影响 , 具有精确和重复性好等优点, 可广泛用于心肌结构、病理生理、电生理、药理及毒理、受体及作用机制、心室肌细胞损伤模型及药物保护等的研究。

其次，大鼠动物模型广泛用于心血管系统疾病的基础研究。

目的与意义（心肌成纤维细胞）心脏由心肌细胞和非心肌细胞组成。

非心肌细胞占细胞总数的 70%，其中 90%以上的非心肌细胞由心肌成纤维细胞组成。

近年来，人们逐渐了解到非心肌细胞不仅对心肌细胞具有结构上的支持、保护作用，而且还具有自分泌和旁分泌功能，影响心肌细胞的结构和生理功能，与风湿性心脏病、心肌炎、心肌肥厚、慢性心肌缺血、心肌梗死、炎症等病理状态均密切相关，因此 ,对心肌成纤维细胞的生理学研究成为现代心血管领域研究的一个重点。

心脏 大鼠的心脏位于胸腔内，两侧隔心包与左、右肺紧邻，背侧有气管、支气管和食管。

腹侧借较宽的胸心包韧带和胸骨相连，腹前方与胸腺相贴，后面靠近膈。

C腹侧面B A心肌细胞根据组织学特点、电生理特性分为两类：工作细胞：普通心肌细胞：如心房肌细胞、心室肌细胞，无自律性，主要执行收缩功能；自律细胞：特殊分化的心肌细胞，组成心脏特殊传导系统，如窦房结细胞，收缩功能基本丧失；DESD Rat心脏HE染色F7心肌成纤维细胞 1、 心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts ，CFS)遍布于心肌组织，包绕心肌细胞并连接心肌细 胞间质。

CFS 参与细胞外基质的合成和沉积，与心脏发育、结构、细胞信号系统、物质代 谢等密切相关；它还可与心肌细胞、其它CFS 甚至内皮细胞之间相互接触，影响电机械功 能、细胞因子分泌和血管生成。

乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养一、实验动物1~3日龄C57小鼠乳鼠10只。

二、试剂及配制高糖DMEM( gibco)、Ⅰ型胶原酶（MP）、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清（gibco 160000-044）、青霉素-链霉素混合液（solarbo）。

培养液: DMEM培养基：FBS：双抗 100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)稀释, 配成0.1%胰蛋白酶消化液;将Ⅰ型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)中, 配成0.1%的胶原酶消化液。

0.1%胰蛋白酶及01% Ⅰ型胶原酶以2∶1混合, 现配现用。

三、实验仪器超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机……四、组织消化和分离细胞1、将乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。

用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用聚维酮碘消毒胸、腹部皮肤。

2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。

用眼科虹膜剪在剑突处正中线稍偏左向上开胸后用剪子压住胸骨右缘, 使心脏自然跳出, 用弯镊子勾住心脏根部, 取出心脏, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。

3、将鼠心脏全部取出后, 剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管, 预冷ＰＢＳ液清洗3次, 去除血污。

4、将心脏剪成约1mm ×1mm×1mm的组织块, 刮入加有搅拌子的锥形瓶中, 酶消化液冲洗剪刀及培养皿, 转移至锥形瓶中。

5、加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍, 37 ℃水浴, 打开磁力搅拌器, 60r/min搅拌10min, 吸管轻轻吹打组织块1min分散细胞, 自然沉降2min后遗弃上清液。

6、再次加入消化酶液8～15ml消化8min。

五、培养细胞1、吸取上清液入离心管, 加入预冷培养液2ml, 吹打均匀后, 1 200r/min离心4min, 弃上清, 细胞沉淀加预冷的培养液吹打后成细胞悬液用封口膜封口放于冰中备用。

成纤维细胞科技名词定义中文名称：成纤维细胞英文名称：fibroblast定义：普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞。

分泌前胶原、纤连蛋白和胶原酶等细胞外基质成分，伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。

所属学科：细胞生物学（一级学科）；总论（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布百科名片疏松结缔组织中的成纤维细胞成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymalcell) 分化而来。

成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。

根据不同功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。

成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。

目录细胞的功能活动状态划分来源特征创伤修复分离培养原代培养展望展开编辑本段细胞的功能活动状态划分根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动；纤维细胞（fibrocyte）功能活动不活跃，细胞轮廓不明显，核小着色深，核仁不明显，细胞质少。

此二型细胞可互相转化。

[1]编辑本段来源成纤维细胞：数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平细胞，细胞核呈规则的卵圆形，细胞轮廓不清。

成纤维细胞摄取所需的氨基酸，如脯氨酸和赖氨酸等，在粗面内质网的核蛋白体上合成前α多肽链（proalphapolypeptidechain ），多肽链输送到高尔基复合体后，组成前胶原分子（procollagen ）。

前胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞外。

在前胶原肽酶催化下，将每一前α多肽链的尾段除去，成为原胶原分子（tropocollagen ）。