发酵液中提取胞外多糖

取１ｍＬ稀释样品，分别浇注于ＭＲＳ培养基、Ｅｌｌｉｋｅｒ培养基和Ｍ１７培养基，在适宜条件下培养，用于样品中乳酸菌的分离［１１．２．２分离菌株的分离和保存将１．２．１得到的菌落在相应的平板培养基上划线纯化得到纯培养物，进行革兰氏染色，接触酶实验。

纯化菌株在ＭＲＳ斜面上４℃短期保存，置于３０％（Ｗ／Ｗ）无菌甘油中在一７０℃超低温冰箱中长期保存‘１１．２．３利用茵落拉丝法初步筛选产胞外多糖的乳酸菌将分离纯化菌株在ＭＲｓ筛选培养基上进行划线分离，在２５℃厌氧培养４８ｈ，观察并记录菌落特征。

用无菌牙签接触菌落，轻轻地向外拉，然后在２ｓ内垂直离开以在培养基表面形成连续的拉丝，重复操作５—６个菌落，每个菌落平行做２次，测量菌落拉丝的最大长度（伽ｎ），结果以“平均值士标准方差”表示。

１．２．４乳酸茵胞外多糖的提取将１．２．３得到的菌株接种于筛选ＭＲＳ液体培养基中，３０℃发酵２４ｈ，取１０ｍＬ培养物，沸水浴１０ｍｉｎ，冷却至室温，加质量分数为８０％的三氯乙酸至终浓度为４％，４℃静置过夜，１２ｏｏｏｇ离心２０ｍｉｎ，轻倾上清液于透析袋中，对流水透析２４ｈ，再对双蒸水透析３６ｈ，４次换水，定容，待用。

１．２．５硫酸－苯酚法测定乳酸茵胞外多糖（ＥＰＳ）的含量将１．２．４得到的胞外多糖样品用Ｄｕｂｏｉｓ推荐的硫酸一苯酚法［１５］测定，用葡萄糖做标准曲线（如图１），从曲线上求得ＥＰＳ的含量。

以空白培养基为对照，扣除背景干扰。

’１．２。

６·显微镜观察产胞外多糖乳酸茵细茵形态对分离菌株进行革兰氏染色，用ＭｏｔｉｃＰＭＢ５—２２３２—５摄影显微镜观察细胞形态。

１．２．７产胞外多糖乳酸茵的鉴定产胞外多糖乳酸菌的鉴定采用法国梅里埃公司鲁奎、蠢棺益图１硫酸一苯酚法测定胞外多糖含量的标准曲线的ＡＰＩ细菌鉴定系统进行，将纯菌株在ＭＲＳ琼脂培养基上３７℃微厌氧培养４８ｈ，用无菌棉拭子收集细菌，在ＡＰＩ５０ＣＨ试剂条凹槽中加ＡＰＩ５０ＣＨＬ培养基并接种，用石蜡油封好，３７℃培养２４～２８ｈ，记录菌株对碳水化合物的发酵结果，将其输入梅里埃公司的鉴定软件ＡＰＩＬＡＢＰｌｕｓ进行鉴定。

胞外多糖(EPS extracellular polysaccharide)早在50年代人们就认为胞外多糖可能是青枯菌的致病因子，随后围绕青枯菌胞外多糖的病理学意义进行了大量研究。

H u sain和Kelman比较了青枯菌自发无毒突变株和野生型菌株的特点，发现自发无毒突变株不产生胞外多糖，致病力丧失，因此认为胞外多糖在致病过程中可能具有重要作用l 5l。

青枯菌的胞外多糖是由多种化学物质组成的复合物，其中主要的组成成分是氮乙酞半乳糖醛酰胺。

研究发现，不同青枯菌小种的胞外多糖的组分有所不同，同一小种也存在不同类型的胞外多糖。

一些研究显示，一个称为EPS I的胞外多糖，可能与Ralstonia solanacearum的致病性最为相关I6J EPS I合成的特异突变研究显示，即使直接注入大量的突变菌细胞进入植物茎组织，与非突变菌比较，其植株的萎蔫和死亡程度也很低。

通过土壤接种试验也显示，尽管突变菌在维管组织中繁殖，但植株的发病很轻。

近年来的研究发现，胞外多糖的合成受l6 kI1的eps操纵子调控，涉及l0个调控基因产物和3个不同的调控信号，这种严谨的调控也从另一个角度说明EPS I对病原菌本身的重要性以及在病原菌对植物的致病性中的重要作用『青枯假单胞菌(pseudomonassolanacearu‘)或称青枯菌引起许多重要经济作物如烟草、花生、番茄等植物的萎焉病。

主要通过土壤传染病害，它的寄主范围很广泛，有33科100多个种，危害茄科植物为最多“。

青枯菌毒力株能产生胞外多糖，用特殊固体培养基培养时形成两种菌落形态即易变的和固定的，前者产生胞外多糖有毒力，后者很少产生这种多糖。

为此，日本科学工作者研究了这种胞外多糖的组成以及它与致病性的关系。

发现这种多糖是一种混合物一主要由N一乙酸半乳糖胺(2一氨基2半乳糖)和少量鼠李糖、葡萄糖以及某些简单肤所组成。

事实上，这是同型一N一乙酞半乳糖胺葡聚糖的一个例证。

其化学性质还不清楚，但认为这种胞外多糖与毒力有关系‘，这是因为它阻滞寄主植物维管束组织，导致水分输导的困难。

Advances in Microbiology 微生物前沿, 2017, 6(2), 27-34Published Online June 2017 in Hans. /journal/ambhttps:///10.12677/amb.2017.62004Research Status of MicrobialExopolysaccharide and ItsMetabolic PathwayNing Pang1,2, Jiaqi Zhang1, Jin Qi3, Binhui Jiang1*1School of Resources and Civil Engineering, Northeastern University, Shenyang Liaoning2Beijing Yingherui Environmental Technology Co. Ltd., Beijing3Fushun Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fushun LiaoningReceived: May 22rd, 2017; accepted: Jun. 9th, 2017; published: Jun. 12th, 2017AbstractDue to their unique physical and chemical properties, rheological properties and biological safety, microbial polysaccharides have been widely used in many fields, such as industrial production and life. But due to high production costs and less production limit its wide application. The screening, isolating and culturing of microbial strains of extracellular polysaccharides were in-troduced in this paper, and the optimization of production of flocculant conditions and the sepa-ration and purification of extracellular polysaccharides were also discussed. Furthermore, the re-search status of the microbial exopolysaccharide metabolic pathway was focused. The method of improving the production of extracellular polysaccharides can be found by the study of metabolic pathways of microbial exopolysaccharides, which lays the foundation for the industrial applica-tion of microbial extracellular polysaccharide.KeywordsMicrobial Flocculant, Glycobacter, Biosynthetic Pathway微生物胞外多糖及其生物合成途径研究现状庞宁1,2，张佳琪1，齐进3，姜彬慧1*1东北大学，资源与土木工程学院，辽宁沈阳2北京盈和瑞环境科技股份有限公司，北京3抚顺出入境检验检疫局，辽宁抚顺*通讯作者。

产胞外多糖菌株的筛选及胞外多糖性质和结构分析多糖具有降血糖、降血脂、免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等诸多优良的生物活性,广泛应用于医药、食品、化妆品等领域,其中微生物胞外多糖具有产生量大、生产周期短、成本相对较低等优势,是研究和应用较多的一类多糖。

筛选新的产胞外多糖菌株和具有良好理化性质的胞外多糖具有很大的意义。

本研究从土壤样品中筛选出一株产胞外多糖的菌株WL113,并对其产生的胞外多糖的性质、结构等作了初步的分析研究。

通过形态特征观察及16SrDNA序列鉴定筛选出的产糖菌株WL113是一种肠杆菌,命名为Enterobacter sp.WL113.向发酵2d的发酵液中加入2-3倍体积95%乙醇提取胞外多糖获得粗多糖,粗多糖中总糖含量为68.33%,蛋白质含量为12.91%。

粗多糖经纯化后通过高效液相色谱、红外光谱和核磁共振进行结构分析表明,此多糖主要由6.46%甘露糖,18.20%葡萄糖,30.90%半乳糖,42.96%岩藻糖,1.47%葡萄糖醛酸组成,摩尔比为0.36：1.00：1.70：2.36：0.08,分子为吡喃糖环,存在a型和p型吡喃糖苷键,分子中存在糖醛酸,是一种酸性杂多糖。

通过单因素实验优化菌株产糖条件,得到最适合菌株产糖的碳源为蔗糖,氮源为酵母粉,且在蔗糖浓度范围为10-30g/L、酵母粉浓度为1-3g/L时,胞外多糖产量逐渐增加,碳氮比为15：1时,产糖量最高；最适培养温度30℃,pH8.0,装液量20mL/100mL(20%).菌株在最适条件下培养后,胞外多糖产量提高至7.67g/L。

流变特性研究表明,胞外多糖溶液粘度随质量浓度升高而增大,浓度为10g/L时粘度比1g/L时提高约33倍；对温度敏感,随着温度升高,粘度下降明显,100℃时粘度比25℃时降低了89.8%;在酸性、中性和弱碱性条件下粘度相对稳定,pHH10以上时粘度下降很快;对Na+、K+、Mg2+、和Ca2+等金属盐离子耐受性能良好,Fe3+会导致多糖沉淀。