茯苓菌丝体胞外多糖提取工艺条件的优化

茯苓菌丝体发酵条件的优化及其蛋白质抑菌活性胡朝暾;付明;邹娟;肖文超;张莉娜【摘要】With carbon , nitrogen , temperature , and trace elements as a single factor , Mycelium of Poria cocos was cultivated in submerged fermentation . Extraction , Content determination and antibacterial analysis of Mycelium protein were used ultrasonic broken , coomassie blue staining and disk diffusion method , respectively . The results showed that optimal growth of Poria cocos mycelium was achieved when carbon source was glucose , mixed nitrogen source as a nitrogen source , zinc sulfate as trace element , at the temperature of 26℃ . The content of protein in the mycelium was 5.9% , much higher than that in Poria cocos sclerotium (0.3% -0.6% ) . Mycelium protein had no significant inhibitory effect on Staphylococcus aureus , Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa and Bacillus subtilis .%以碳源、氮源、温度和微量元素为单因素，液体深层发酵培养茯苓菌丝体.分别采用超声波破壁法、考马斯亮蓝染色法和纸片扩散法（K-B法）进行菌丝体蛋白质的提取、含量测定和抑菌分析.结果表明：在碳源为葡萄糖，氮源为混合氮源，微量元素为硫酸锌，温度为26℃时，茯苓菌丝发酵较好；菌丝体蛋白质含量为5.9％，远高于茯苓菌核中蛋白质0.3％-0.6％的含量.抑菌分析表明蛋白质对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌，枯草芽孢杆菌均无明显抑制效果.【期刊名称】《怀化学院学报》【年(卷),期】2014(000)005【总页数】4页(P9-12)【关键词】菌丝体;茯苓;纸片扩散法;抑菌特性【作者】胡朝暾;付明;邹娟;肖文超;张莉娜【作者单位】怀化学院生命科学系，湖南怀化 418008; 怀化学院民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南怀化 418008;怀化学院生命科学系，湖南怀化 418008; 怀化学院民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南怀化 418008;怀化学院生命科学系，湖南怀化 418008; 怀化学院民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南怀化 418008;怀化学院生命科学系，湖南怀化 418008;怀化学院生命科学系，湖南怀化 418008【正文语种】中文【中图分类】Q936茯苓(poria cocos(Schw.)Wolf)是我国传统的大宗中药材，具有抗菌[1,2]，抗肿瘤[3-5]，免疫调节[6,7]等功能.但传统的茯苓栽培法生产周期长，松材消耗量大.采用液体深层培养技术可较好地解决人工种植茯苓的问题.液体培养生产茯苓菌丝体可连续规模化工业生产，大大缩短了生产时间，降低了生产成本[8-10].近年来，研究发现茯苓具有抗菌作用，但其作用机理目前尚不清楚.自1980年Boman等[11]从美国天蚕蛹中分离得到第一个抗菌肽——天蚕素(Cecropins)至今，抗菌肽和抗菌蛋白已被广泛发现于多种生物中.茯苓的抗菌是否与其蛋白有关，茯苓中是否存在我们尚不清楚的抗菌肽或抗菌蛋白？目前，未见此类研究报道.因此，开展茯苓菌丝体蛋白的抑菌性进行探索研究，为茯苓蛋白质的后续研究和茯苓活性化合物的开发提供支持.1.1 茯苓菌种茯苓菌种湘靖28购自湖南怀化靖州湘桂黔药用菌研究所，4℃冰箱保存备用.金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和枯草芽孢杆菌来自怀化学院生命科学系微生物学实验室.1.2 试剂与配制马铃薯培养基配制见文献[12]，磷酸盐缓冲液配制见文献[13]，基础培养基为：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、磷酸二氢钾3 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、VB1 40 mg、蒸馏水1 L、pH值自然.加热至溶解，趁热分装三角瓶每瓶45ml，用纱布封口，报纸包好，121℃灭菌20 min，冷却至室温后备用(微量元素试验时添加微量元素，用量为10 mg/L).其它试剂均为国产分析纯.1.3 主要实验仪器上海之信JY99-IID超声波细胞粉碎机，德国进口SIGMA 3-18K高速冷冻离心机，北京德天佑DJ-1冷冻干燥机，上海大普PHS-3C高精度酸度计.1.4 实验方法1.4.1 菌种的活化及发酵培养和种子液发酵培养菌种的活化及发酵培养：将接种铲放酒精灯火焰上灼烧后冷却，取黄豆大小的一块菌种，迅速移入新鲜无菌的PDA斜面试管中，于26℃恒温培养3 d，随后放入冰箱保存待用.种子液发酵培养：在装量为50 ml/250 ml的液体种子培养基中，接种3块约0.5 cm2大小茯苓菌块，160 r/min、26℃恒温摇瓶培养3 d.1.4.2 单因素实验分别选取葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、柠檬酸为碳源，蛋白胨、混合氮源(蛋白胨+酵母膏)、酵母膏、硝酸钾、硫酸铵为氮源，硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、钼酸铵为微量元素，置于22、24、26、28、30℃不同摇床内160 r/min培养8 d，测定菌丝体质量，确定各单因素对茯苓液体发酵的影响.1.4.3 茯苓菌丝体蛋白质的提取与含量测定精确称取2 g茯苓菌丝体于研钵中磨成粉末转移至干净烧杯中，加入pH 8.0，0.2 mol/L磷酸盐缓冲液50 ml，超声波(功率350 W)处理15 min.破碎后静置一小时，4℃，11 000 r/min，离心15 min，过滤，取上清液.滤液中加入饱和硫酸铵溶液分级沉淀，再以4℃，10 000 r/min离心30 min，沉淀用磷酸盐缓冲液充分溶解后在同种缓冲液中透析2 d；收集透析袋内的内透液，即为茯苓蛋白液，或者将其冷冻干燥，得到茯苓粗蛋白质.含量测定采用考马斯亮蓝染色法(Bradford法)[14]进行.1.4.4 茯苓蛋白质的抑菌检测抑菌试验采用K-B纸片扩散法，具体过程见文献[15].2.1 单因素实验2.1.1 碳源单因素试验由表1可知，上述六种不同碳源进行摇瓶培养时，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖作为碳源时，菌丝体产量相对较高，其中葡萄糖最好，柠檬酸最低，可能是高浓度的柠檬酸，抑制了柠檬酸循环.柠檬酸循环起始反应就是草酰乙酸和乙酰辅酶A形成柠檬酸，培养基中加入该反应的生成物柠檬酸，抑制正反应的进行.2.1.2 氮源单因素试验由表2可知，五种不同氮源中，混合氮源、蛋白胨、酵母浸膏为较佳氮源，其中混合氮源最好.硝酸钾效果稍差，硫酸铵为氮源时，菌丝体基本不能生长.说明有机氮源更有利于茯苓菌丝体的生长.2.1.3 微量元素单因素试验微量元素与酶的活动密切相关，他们中有的是酶的活性基团，有的是酶的激活剂，而且微量元素还可以调节培养液的渗透压，增强培养基的缓冲能力.如锌是乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶等活性基团的必需成分；钼和钒参与还原酶和固氮酶的构成.从表3看出硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠等对菌丝体的生长都有一定的促进作用.硫酸钠作为对照，说明并非是硫元素在起促进作用.硫酸铜和硫酸亚铁作用不明显，可能是没有找到合适的浓度或本身促进作用不明显.2.1.4 温度单因素试验不同温度对真菌生长影响较大，温度过高或过低都会抑制部分酶的活性.由表3.4可知在24～28℃时，菌丝体长势较好，其中26℃时生长最好，因此，茯苓菌丝体发酵培养的最佳温度是26℃.2.2 茯苓蛋白质的提取按照1.4.3的方法提取得到茯苓蛋白液和茯苓粗蛋白，2 g干重菌丝体通过超声波破壁法和透析后得到内透液(茯苓蛋白液)约33ml,经冷冻干燥后得到茯苓粗蛋白约0.148 g.茯苓蛋白液浓度约为4.48 mg/ml.按照标准曲线的制作方法配制溶液，充分混匀，静置10 min于595 nm处比色，记录A595值，记录在表5中.用标准蛋白质浓度(mg/ml)为横坐标，用吸光度值A595为纵坐标，用标准曲线计算程序软件作图，即得到一条标准曲线，见图1.将茯苓蛋白液用考马斯亮蓝法测定茯苓蛋白含量.分别用原液、10倍、50倍、100倍稀释液(管号分别为1、2、3、4)，进行吸光值测定，测得的A595值见表6. 由表6表明，1号和2号数值偏大，说明样品浓度偏大，需进一步稀释；4号数值偏小，不可取.3号值位于0.2-0.5中间，精确度高，所以选取提取液稀释50倍的溶液进行蛋白质含量测定.将0.3190代入标准曲线方程y=6.6126x+0.0067，对应的蛋白质浓度x=0.0472 mg/ml.所以，蛋白质含量为：W%=C0×V0×N/M×100% =0.0472×50×50/(2×103)×100% =5.9%注：W：蛋白质含量，C0:蛋白液浓度(mg/ml)，V0：蛋白液体积(ml)，N：稀释倍数，M：菌丝体质量(mg).2.3 茯苓蛋白的抑菌检测将预先在茯苓蛋白液和无菌水中浸泡的滤纸片分别放到涂有四种细菌的培养基上37℃培养24 h，然后观察抑菌圈的大小.结果如图2～5.在图2～5中，滤纸片周围没有出现明显的抑菌圈.上述抑菌图谱表明：茯苓菌丝体蛋白，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和枯草芽孢杆菌均无明显的抑制效果.3.1 茯苓菌丝体蛋白质的提取及含量测定蛋白质提取方法常见的有两种：有机溶剂提取法和水提取法.有机溶剂提取法主要是用乙醇、丙酮和丁醇等有机绍剂来提取，它们具有一定的亲水性，还有较强的亲脂性，是理想的提取脂蛋白的溶剂.但有机溶剂提取后蛋白质不易分离出来，且易引起蛋白质变性，不利于蛋白质的进一步分析.水提取法常用稀盐缓冲液提取，如Tris-HCl溶液、磷酸盐缓冲液等.水提取法能较好的保持蛋白质活性.茯苓成分分析表明，多糖占90%以上，蛋白质含量很低.实验室前期以茯苓菌核为原料，测得其蛋白质含量为0.3%-0.6%.蛋白质含量低加上多糖去除繁琐，成为茯苓菌核蛋白质研究的瓶颈.选取茯苓菌丝体为原料进行蛋白质研究，可以克服蛋白质含量低及多糖干扰的影响.本实验测得茯苓菌丝体中蛋白质的含量为5.9%，较菌核中蛋白质含量有了明显提高，为茯苓蛋白质的后续研究打下了很好的基础.3.2 茯苓蛋白抑菌活性纸片扩散法是一种半定量的实验方法，具有操作简便，工作量小的优点.但测定抑菌活性不够灵敏和快速，所以增加了实验难度[16].茯苓蛋白抑菌效果不明显，可能是茯苓蛋白确实无抑菌效果，也可能是茯苓中蛋白质含量低或者抑菌方法不灵敏导致抑菌效果不明显.【相关文献】[1]沈思，李浮杰，梅光明，等.茯苓皮三萜类物质含量的测定及其抑菌活性的研究[J].食品科学，2009，30(1)：95-98.[2]孙博光，邱世翠，李波清，等.茯苓的体外抑菌作用研究[J].时珍国医国药，2003,14(7)：394.[3]刘丹丹，戴娜，范婧莹.茯苓抗肿瘤药理作用研究[J].中国医药生物技术，2009,4(4)：291-294.[4]赵吉福，何爱民，陈英杰，等.茯苓抗肿瘤成分研究(I)[J].中国药物化学杂志，1993,3(2)：129-131.[5]黄灿，王玉明，赵骏.抗肿瘤活性茯苓多糖的提取、纯化与结构分析[J].中草药，2012,43(11)：2146-2149.[6]张敏，高晓红，孙晓萌，等.茯苓的药理作用及研究进展[J].北华大学学报(自然科学版)，2008，9(1)：63-68.[7]文妖强，彭腾，贾波，等.茯苓有效成分的药理学研究概况[J].新疆中医药，2007,25(增刊)：173-175.[8]林雨露，张俐娜，金勇，等.人工培养菌种茯苓菌丝体多糖的分离、组成和分子量[J].高分子学报,2003，(1):97-103.[9]李羿，万德光，裴瑾，等.茯苓液体发酵条件的研究[J].成都中医药大学学报,2005,28(1):52-55.[10]李慧，常景玲.茯苓多糖发酵工艺的优化[J].安徽农业科学,2006,34(5):920-921.[11]Steiner H,Hultmark D,Engstrom A,Bennich H,Borman HG.Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity[J].Nature,1981,292(5820):246-248.[12]沈萍，陈向东.培养基的配制[A].微生物学实验(第4版)[M].北京：高等教育出版社，2007.[13]陈钧辉，李俊，张太平，等.缓冲液的配制.生物化学实验(第四版)[M].北京：科学出版社，2008.[14]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry,1976，72:248-254.[15]胡朝暾，肖毅，周鹏飞，等.茯苓多糖的提取及其抑菌研究[J].怀化学院学报，2012，31(8)：15-18.[16]伍贤进，毛倩，刘胜贵，等.翻白草提取物的抑菌作用研究[J].辽宁中医杂志，2007，34(9)：1295-1296.。

圆园21年4月第42卷第8期DOI ：10.12161/j.issn.1005-6521.2021.08.028食品研究与开发茯苓（Poria cocos ）为多孔菌科真菌茯苓Poria co 原cos （Schw.）Wolf 的干燥菌核，是我国重要的传统药物之一[1]。

作为一种药食同源的物质，我国传统医学认为茯苓有利水渗湿、健脾和宁心的功效，可以用来治疗水肿、小便不利等。

研究发现，茯苓中多糖成分约占菌核干重的70%耀90%[2]，其余为三萜类化合物、甾体类、蛋白质等成分[3]。

自20世纪70年代报道茯苓多糖抗肿瘤作用以来[4]，茯苓多糖的功效报道集中于免疫活性调节、抗肿瘤、抗氧化等作用[5]。

茯苓中的多糖不易溶于水，经过结构改性后得到溶于水的茯苓多糖，抗肿瘤活性得以提高[6-7]。

因此，研究如何高效提取茯苓多糖及后续的活性、结构研究成为研究的热点。

本文综述了茯苓多糖的提取、结构研究、功能活性机制及安基金项目：国家重点研发计划（2018YFC1602106）作者简介：刘星汶（1995—），女（汉），硕士研究生，研究方向：生物活性多糖。

*通信作者：杨继国（1977—），男，教授级高级工程师，博士，研究方向：食品生物化学。

茯苓多糖的提取、结构、活性和作用机理研究进展刘星汶1，徐晓飞2，刘玮2，赵云鹏1，张尚微1，沈艺楠1，杨继国1，2*（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州510640；2.华南协同创新研究院，广东东莞523808）摘要：真菌多糖具有悠久的研究历史，且生物活性广泛。

茯苓多糖来源于多孔菌科真菌茯苓（Poria cocos ）的菌核，具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种功能活性，成为近年来的研究热点。

该文主要综述茯苓多糖的提取工艺、结构、功能活性、作用机理以及安全性研究进展，最后对茯苓多糖的应用前景进行展望。

关键词：茯苓多糖；提取工艺；功能活性；构效关系；安全性研究Research Progress on Extraction ，Structure ，Activity and Mechanism of Poria cocos -derived PolysaccharidesLIU Xing-wen 1，XU Xiao-fei 2，LIU Wei 2，ZHAO Yun-peng 1，ZHANG Shang-wei 1，SHEN Yi-nan 1，YANG Ji-guo 1，2*（1.College of Food Science and Engineering ，South China University of Technology ，Guangzhou 510640，Guangdong ，China ；2.South China Institute of Collaborative Innovation ，Dongguan 523808，Guangdong ，China ）Abstract ：Fungal polysaccharides have been intensively investigated for a long time ，which exhibited a widerange of biological activities.Poria cocos -derived polysaccharides ，which were obtained from the sclerotia of Poria cocos ，have been proven to have various bioactivities such as immunomodulation ，anti -tumor ，anti -inflammation ，anti-oxidation ，etc.In this paper ，the extraction methods ，structure ，functional activities and the corresponding mechanism of Poria cocos polysaccharides as well as the safety assessment were reviewed.Finally ，the application prospect of Poria cocos -derived polysaccharides was discussed.Key words ：Poria cocos -derived polysaccharides ；extraction method ；functional activity ；structure-functionalrelationship ；safety assessment引文格式：刘星汶，徐晓飞，刘玮，等.茯苓多糖的提取、结构、活性和作用机理研究进展[J].食品研究与开发，2021，42（8）：172-178.LIU Xingwen ，XU Xiaofei ，LIU Wei ，et al.Research Progress on Extraction ，Structure ，Activity and Mechanism of Poria cocos -derived Polysaccharides[J].Food Research and Development ，2021，42（8）：172-178.专题论述172食品研究与开发圆园21年4月第42卷第8期1.2茯苓多糖的结构研究来自茯苓菌核和菌丝体的茯苓多糖大多是以β-（1→3）-糖苷键为主链，伴有少量β-（1→6）-糖苷键的分支葡聚糖[22]。

茯苓提取工艺优化研究
王伟;刘宁宇;李建军
【期刊名称】《安阳师范学院学报》
【年(卷),期】2005(000)005
【摘要】对不同产地茯苓的甲醇提取物进行了提取工艺的的比较研究,得到了优化的提取工艺条件,为茯苓中药材的有效利用和质量控制提供科学依据.
【总页数】3页(P44-46)
【作者】王伟;刘宁宇;李建军
【作者单位】河南天方药业股份有限公司,河南,驻马店,463003;河南天方药业股份有限公司,河南,驻马店,463003;郑州大学,化学系,河南,郑州,450052
【正文语种】中文
【中图分类】R284.2
【相关文献】
1.茯苓菌皮中茯苓多糖的提取工艺和结构分析 [J], 程水明;程建华;周国钰
2.茯苓中茯苓多糖的含量测定方法及提取工艺优选 [J], 段启;庄义修
3.茯苓菌丝体多糖的提取工艺优化研究 [J], 韩勇;宋金玉
4.茯苓多糖的提取方法及提取工艺优化研究概况 [J], 袁勤洋;卢静;曲彩红;刘长利
5.茯苓皮中茯苓多糖的提取工艺优化 [J], 赵声兰;赵荣华;陈东;卫华
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湖南农业大学学报(自然科学版)2023，49(5)：543–548．DOI：10.13331/ki.jhau.2023.05.007Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)引用格式：谭智杰，张巧毅，赵柔，王常贵，林元山．茯苓菌液体发酵产胞内多糖条件的优化[J]．湖南农业大学学报(自然科学版)，2023，49(5)：543–548．TAN Z J，ZHANG Q Y，ZHAO R，WANG C G，LIN Y S．Optimization of liquid fermentation conditions of Poriacocos to produce intracellular polysaccharide[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2023，49(5)：543–548．投稿网址：茯苓菌液体发酵产胞内多糖条件的优化谭智杰1，张巧毅2，赵柔2，王常贵2，林元山1,2*(1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128；2.农业生物工程研究所，湖南长沙410128)摘要：以不同碳源、氮源、pH、温度、接种量、转速、时间为单一变量，通过单因素试验和Plackett–Burman 试验从7个因素中筛选显著性因素，对筛选出的显著性因素进行最陡爬坡试验，采用Box–Behnken试验探究茯苓菌液体发酵产胞内多糖的最优条件。

结果表明：接种量、pH、葡萄糖质量分数和酵母膏质量分数是茯苓菌液体发酵产胞内多糖的显著性因素；在接种量9%、pH 5.7、葡萄糖质量分数4%、酵母膏质量分数1%、时间7 d、温度28 ℃、转速170 r/min的条件下，茯苓胞内多糖的含量为(5.82±0.18) g/L，生物量为(14.63±0.21) g/L，分别为未优化前的1.6倍和2.0倍。

茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯化工艺的研究韩勇【摘要】在单因素试验的基础上,采用响应面法试验,优化了胞外多糖硫酸酯化的工艺条件.结果表明,优化的硫酸酯化条件为氯磺酸与吡啶摩尔比1:3.85,反应温度73℃,反应时间3.34 h.在此条件下,硫酸基团取代度为1.02.【期刊名称】《太原师范学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(012)001【总页数】5页(P130-133,137)【关键词】茯苓菌丝体;胞外多糖;硫酸酯化;响应面【作者】韩勇【作者单位】山西药科职业学院,山西太原030031【正文语种】中文【中图分类】Q539茯苓是我国传统的中药材，具有渗湿、利尿、健脾等功效.茯苓多糖因具有调节机体免疫，抑制肿瘤生长等功能，而成为近年来研究较多的真菌多糖.为提高多糖的生物学活性，将天然多糖进行硫酸酯化结构修饰已成为多糖研究的热点之一.众多研究发现，硫酸酯化多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、增强机体免疫功能等多种生物学活性[1－3].本实验室通过液体深层发酵培养茯苓，获得茯苓发酵液，经检测，发酵液中含有大量茯苓菌丝体胞外多糖.目前，关于茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯化的研究报道较少，本文通过响应面试验研究了茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯化的工艺条件，为今后该多糖的生物学活性研究提供了实验依据.1 材料与方法1.1 供实验用样品通过10L发酵罐进行液体深层发酵培养获得茯苓发酵液，经检测，发酵液中含有大量菌丝体胞外多糖.经提取纯化，得茯苓菌丝体胞外多糖.1.2 主要仪器设备752N紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），TGL20M－Ⅱ高速冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）.1.3 茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯化条件的优化采用氯磺酸—吡啶法制备茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯衍生物.在冰浴及搅拌的条件下逐滴将氯磺酸缓慢滴入吡啶中，配制成硫酸酯化试剂.称取1g多糖溶于20mL甲酰胺，然后加入硫酸酯化试剂.反应液水浴加热至一定温度，并持续搅拌反应一定时间.反应停止后冷却至室温，加入预冷的蒸馏水中，氢氧化钠中和至中性，后加入3倍体积无水乙醇，析出沉淀.6 000r／min离心10min，收集沉淀，得茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯衍生物.以硫酸基团取代度为检测指标，考察氯磺酸与吡啶摩尔比、反应温度和反应时间对多糖硫酸酯化效果的影响.通过单因素试验找出试验因素水平范围，经响应面试验确定最佳多糖硫酸酯化条件.1.3.1 氯磺酸与吡啶摩尔比优化试验将氯磺酸与吡啶以不同的摩尔比配制成硫酸酯化试剂，按1.3所述进行多糖硫酸酯化，其中，反应液水浴加热温度为70℃，持续搅拌反应3h.1.3.2 反应温度优化试验按1.3所述进行多糖硫酸酯化，其中，分别调节反应液水浴加热温度为50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃，持续搅拌反应3h.1.3.3 反应时间优化试验按1.3所述进行多糖硫酸酯化，分别持续搅拌反应1h，2h，3h，4h，5h.1.3.4 响应面试验在单因素试验的基础上，采用Box－Behnken试验设计对多糖硫酸酯化条件进一步优化，运用响应面分析确定影响因素的最佳条件.1.4 硫酸基团取代度检测采用硫酸钡浊度法测定硫酸基团含量（S%），硫酸基团取代度（degree of substitution，Ds）按公式:Ds＝l.62×S%／（32－l.02×S%）计算[4].2 结果与分析2.1 多糖硫酸酯化单因素试验2.1.1 氯磺酸与吡啶摩尔比优化试验以硫酸基团取代度为检测指标，考察氯磺酸与吡啶以不同的摩尔比配制成的硫酸酯化试剂对多糖硫酸酯化效果的影响，结果见表1.表1 氯磺酸与吡啶摩尔比对多糖硫酸酯化效果的影响摩尔比1∶6 1∶5 1∶4 1∶3 1∶2 Ds 0.55 0.90 1.02 0.94 0.83由表1结果可知，增加氯磺酸的比例，多糖可充分获得硫酸基，从而取代度明显提高，比例为1∶4时，取代度最高为1.02.当继续增加氯磺酸的比例，取代度反而有所降低，推测可能是反应液中酸度过高，导致了硫酸基的水解.2.1.2 反应温度优化试验将氯磺酸与吡啶以1∶4的摩尔比配制成硫酸酯化试剂，按1.3所述进行多糖硫酸酯化，以硫酸基团取代度为检测指标，考察不同反应温度对多糖硫酸酯化效果的影响，结果见表2.表2 反应温度对多糖硫酸酯化效果的影响温度／℃50 60 70 80 90 100 Ds 0.27 0.61 1.00 0.95 0.83 0.67由表2结果可知，随着反应温度的升高，硫酸基团取代度明显提高，当反应温度超过70℃后，硫酸基团取代度开始下降.升高温度有利于硫酸酯化反应的充分进行，但温度升高超过一定程度后，多糖可能被降解，酯化反应受到抑制，从而硫酸基团取代度下降.因此确定反应温度为70℃.2.1.3 反应时间优化试验将氯磺酸与吡啶以1∶4的摩尔比配制成硫酸酯化试剂，反应液水浴加热至70℃，按1.3所述进行多糖硫酸酯化，以硫酸基团取代度为检测指标，考察不同反应时间对多糖硫酸酯化效果的影响，结果见表3.表3 反应时间对多糖硫酸酯化效果的影响时间／h 1 2 3 4 5 Ds 0.430.67 1.03 0.92 0.88由表3结果可知，随着反应时间的增加，硫酸基团取代度明显提高，当反应时间超过3h后，硫酸基团取代度开始下降.因此，确定反应时间为3h.2.2 响应面优化多糖硫酸酯化条件在单因素试验的基础上，以氯磺酸与吡啶摩尔比、反应温度和反应时间为自变量，硫酸基团取代度为响应值，对多糖硫酸酯化条件进行Box－Behnken优化试验，因素水平见表4，试验设计及响应值见表5，回归分析结果见表6.表4 Box－Behnken设计因素水平表水平编码A B C摩尔比温度／℃ 时间／h－1 1∶5（0.20）80 4 60 2 0 1∶4（0.25）70 3 1 1∶3.3（0.30）表5 Box－Behnken试验设计及响应值表编号摩尔比温度／℃ 时间／h 取代度1 0.25 80 4 0.90 2 0.25 70 3 1.03 3 0.30 70 4 0.87 4 0.2560 2 0.54 5 0.20 80 3 0.71 6 0.25 70 3 1.05 7 0.25 60 40.73 8 0.30 60 3 0.68 9 0.30 70 2 0.70 10 0.25 70 3 1.02 110.20 70 2 0.47 12 0.25 70 3 0.96 13 0.25 70 3 1.00 14 0.20 70 4 0.81 15 0.30 80 3 0.88 16 0.25 80 2 0.65 17 0.20 60 3 0.71表6 Box－Behnken试验设计回归分析结果注:P＜0.05表示影响显著；P＜0.01表示影响高度显著；P＜0.001表示影响极显著.方差来源平方和自由度均方 F 值 Prob＞F 显著性模型 0.485 7 9 0.054 0 42.420 4 ＜0.000 1 0.494 6 16＊＊＊A 0.023 1 1 0.023 1 18.168 2 0.003 7 ＊＊B 0.028 8 10.028 8 22.639 0 0.002 1 ＊＊C 0.112 8 1 0.112 8 88.679 1 ＜0.0001 ＊＊＊AB 0.010 0 1 0.010 0 7.860 8 0.026 4 ＊AC 0.0072 10.007 2 5.679 4 0.048 7 ＊BC 0.000 9 1 0.000 9 0.707 5 0.428 1 A2 0.070 9 1 0.070 9 55.720 5 0.000 1 ＊＊＊B2 0.079 3 1 0.079 3 62.348 4 ＜0.000 1 ＊＊＊C2 0.121 3 1 0.121 3 95.371 8 ＜0.000 1 ＊＊＊残差 0.008 9 7 0.001 3失拟项 0.004 2 3 0.001 4 1.203 7 0.415 6误差项 0.004 7 4 0.001 2总离差运用Design Expert软件对表5数据进行二次多元回归拟合，得回归方程:Y＝1.012＋0.053 75A＋0.06B＋0.118 75C＋0.05AB－0.042 5AC＋0.015BC－0.129 75A2－0.137 25B2－0.169 75C2.回归方程的决定系数R2为0.982 0，说明回归方程的拟合程度很好，预测值与实测值之间具有高度的相关性.回归模型显著可靠（P＜0.000 1），而失拟项不显著（P＞0.05），表明可以利用该回归方程确定最优的多糖硫酸酯化条件.根据回归方程，作出不同因子的响应面分析图，见图1.响应面分析图直观的反映了各因素交互作用对响应值的影响.图1 各因素交互作用的响应面分析图由图1可知拟合曲面有最大值，通过岭脊分析[5]，得到最大值所对应的各因素的编码值:A＝0.204 8，B＝0.275 2，C＝0.336 6，通过Design Expert软件求解方程，得出多糖硫酸酯化优化的条件为:氯磺酸与吡啶摩尔比0.26即为1∶3.85，反应温度72.75℃，反应时间3.34h.该模型预测的取代度为1.05.考虑到实际操作，将硫酸酯化的最优条件修正为氯磺酸与吡啶摩尔比1∶3.85，反应温度73℃，反应时间3.34h.2.3 Box－Behnken回归模型验证为检验优化结果的可靠性，采用修正后的最优酯化条件进行多糖硫酸酯化验证试验，试验重复3次，结果取平均值，测得取代度为1.02，与模型预测值基本吻合，表明两者之间具有良好的拟合性，优化模型可靠.3 结论近年来，多糖的分子修饰和结构改造成为研究的热点，其中，硫酸酯化多糖以其诸多的生物和药理作用愈来愈引起人们的重视.但在硫酸酯化多糖的开发过程中，其硫酸酯化工艺条件的优化是关键.本实验采用单因素及响应面试验法优化了茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯化的工艺条件，优化后的工艺参数为:氯磺酸与吡啶摩尔比1∶3.85，反应温度73℃，反应时间3.34h.参考文献:[1]魏建经，邵树军，王天元.硫酸酯化多糖化学及临床应用研究进展[J].中国生化药物杂志，1999，20（5）:260－262[2]Katsuraya K，Nakashima H，Yamamoto N，et al.Synthesis of sulfated oligosaccharide glycosides having high anti－HIV activity and the relationship between activity and chemical structure[J].Carbohydr Res，1999，315:234－242[3]Hattori K.Synthesis of sulfonated aminopolysaccharides having anti－HIV and anticoagulant activities[J].Carbohydr Res，1998，312:1－8 [4]Dodgson K S，Price R G.A note on the determination of ester sulfate content of sulphated polysaccharides[J].Biochem J，1962，84（1）:106－110[5]曹小红，蔡萍，李凡，等.利用响应面法优化Bacillus natto TK－1产脂肽发酵培养基[J].中国生物工程杂志，2007，27（4）:59－65。

茯苓多糖的超高压萃取工艺优化及其在卷烟中的应用吕乔;陈长清;孙海峰;畅晓渊【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2013(041)016【摘要】[目的]研究超高压提取茯苓多糖的最佳工艺条件.[方法]在单因素试验的基础上,采用正交试验法对茯苓多糖的超高压提取工艺进行优选,选用L9(34)进行正交试验,以茯苓叶多糖的得率和纯度为指标,考察超高压压力、pH、料液比和保压时间对茯苓多糖提取率和纯度的影响.[结果]试验得出,茯苓多糖的最佳提取工艺条件为:压力250 MPa、pH 10、料液比1∶15 g/ml、保压时间12 min,此条件下茯苓多糖提取率为2.64％,纯度为24.61％.在卷烟中的初步应用显示,添加0.6％的茯苓多糖提取物后,能显著增加卷烟香气量和香气质,各香韵间的协调性较好,杂气降低,余味舒适,综合效果相对较好.[结论]同传统方法相比,超高压提取方法得率高,提取时间短,是提取茯苓多糖的适宜方法,研究可为茯苓多糖的工业化生产提供科学依据.【总页数】4页(P7304-7306,7309)【作者】吕乔;陈长清;孙海峰;畅晓渊【作者单位】湖南农业大学农学院,湖南长沙410128;深圳烟草工业有限责任公司,广东深圳518109;深圳烟草工业有限责任公司,广东深圳518109;深圳烟草工业有限责任公司,广东深圳518109;深圳烟草工业有限责任公司,广东深圳518109【正文语种】中文【中图分类】S567【相关文献】1.茶树花精油超高压、超声波与微波辅助萃取工艺优化 [J], 王娟;央金卓嘎;黄惠华2.超临界萃取麦芽浸膏中致香成份的研究及在卷烟加香中的应用 [J], 王海涛;杨虹;胡根英;白庆华;魏建斌3.干姜的超临界萃取及其萃取物在卷烟中的应用 [J], 陈子勇;朱巍;肜霖;黄龙;潘婷婷;吴昭4.珊瑚藻多糖酶法提取工艺优化及其在卷烟中的应用 [J], 张峰;洪祖灿;谢全灵;余志强;操晓亮;张怡评;赵敏;洪专;郭洪辉;陈晖5.茯苓皮中茯苓多糖的提取工艺优化 [J], 赵声兰;赵荣华;陈东;卫华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

响应面法优化茯苓菌丝体多糖的提取工艺研究
陶跃中;姜辉;舒志愚;杨生玉
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2010(038)017
【摘要】[目的]优化茯苓深层发酵菌丝体的多糖提取工艺.[方法]在单因素试验基础上,根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理,选取提取时间、提取温度和水料比3因素3水平的响应面法优化茯苓多糖的提取工艺.[结果]提取时间、提取温度以及水料比与茯苓多糖得率存在显著相关性(P<0.05);茯苓多糖水浸提最佳工艺条件为:提取时间4.3 h,提取温度73.8 ℃,水料比29.8∶ 1;多糖得率理论值达到
2.45%,实际得率可达2.57%.[结论]采用响应面法优化工艺得到的提取条件可信,具有可行性和应用价值.
【总页数】4页(P9095-9097,9364)
【作者】陶跃中;姜辉;舒志愚;杨生玉
【作者单位】河南大学生物工程研究所,河南开封,475004;江苏延申生物科技股份有限公司,江苏常州213100;河南大学生物工程研究所,河南开封,475004;河南大学生物工程研究所,河南开封,475004
【正文语种】中文
【中图分类】S567.32
【相关文献】
1.用响应面法优化灰树花菌丝体多糖微波提取工艺的研究 [J], 郭家瑞;王卫国;李鹏;崔羽佳
2.Plackett-Burman设计与响应面法对姬松茸菌丝体多糖提取工艺的优化 [J], 曹新志;赵迎庆;熊俐;李琳琳;任林生
3.茯苓菌丝体胞外多糖提取工艺条件的优化 [J], 韩勇;田艳花
4.响应面法优化鸡腿菇菌丝体多糖的提取工艺 [J], 闫舒雅;董岳峰;任翔萍;李娜
5.茯苓菌丝体多糖的提取工艺优化研究 [J], 韩勇;宋金玉
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