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第4卷 第3期 食品安全质量检测学报 Vol. 4 No. 32013年6月Journal of Food Safety and Quality Jun. , 2013基金项目：北京市教育委员会项目(19000550012)Fund: Supported by Beijing Municipal Commission of Education (19000550012)*通讯作者: 杨贞耐, 教授, 主要研究方向为乳品加工及交叉学科的理论和应用。
E-mail: yangzhennai@*Corresponding author: YANG Zhen-Nai, Professor, Beijing Technology and Business University, No.11, Fucheng Road, Haidian District, Beijing 100048, China. E-mail: yangzhennai@乳酸菌胞外多糖的结构及功能特性研究进展田 政1, 王 辑2, 郑 喆1, 杨贞耐1*(1. 北京工商大学食品学院, 北京 100048; 2. 吉林大学生物与农业工程学院, 长春 130025)摘 要: 乳酸菌胞外多糖是一种天然的高分子聚合物, 具有诸多功能特性, 如改善发酵乳的质构特性及对人体的多种健康作用等。
许多学者对乳酸菌胞外多糖的结构和功能特性及其构效关系进行了广泛而深入的研究。
本文综述了有关乳酸菌胞外多糖的种类、化学组成、结构和功能等方面的研究进展, 以期为乳酸菌胞外多糖及相关功能食品的进一步研究开发提供参考。
关键词: 乳酸菌; 胞外多糖; 结构; 功能Research advances on structure and function of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteriaTIAN Zheng 1, WANG Ji 2, ZHENG Zhe 1, YANG Zhen-Nai 1*(1. School of Food Science , Beijing Technology and Business University , Beijing 100048, China ; 2. College of Biological andAgricultural Engineering , Jilin University , Changchun 130025, China )ABSTRACT: The exopolysaccharides (EPSs) produced by lactic acid bacteria were natural biological poly-mers with many special functions such as improvement of textural characteristics of fermented dairy products and beneficial health effects for human beings. EPSs of lactic bacteria had been extensively and thoroughly studied with respects to the structure and function, as well as their relations. This paper reviewed the research advances on the EPS types, chemical composition, structure and function, in order to provide references for further research and development of functional foods related to the EPSs of lactic acid bacteria.KEY WORDS: lactic acid bacteria; exopolysaccharides; structure; function1 引 言胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)是细菌和微藻类微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的粘液或荚膜多糖[1]。
取１ｍＬ稀释样品，分别浇注于ＭＲＳ培养基、Ｅｌｌｉｋｅｒ培养基和Ｍ１７培养基，在适宜条件下培养，用于样品中乳酸菌的分离［１１．２．２分离菌株的分离和保存将１．２．１得到的菌落在相应的平板培养基上划线纯化得到纯培养物，进行革兰氏染色，接触酶实验。
纯化菌株在ＭＲＳ斜面上４℃短期保存，置于３０％（Ｗ／Ｗ）无菌甘油中在一７０℃超低温冰箱中长期保存‘１１．２．３利用茵落拉丝法初步筛选产胞外多糖的乳酸菌将分离纯化菌株在ＭＲｓ筛选培养基上进行划线分离，在２５℃厌氧培养４８ｈ，观察并记录菌落特征。
用无菌牙签接触菌落，轻轻地向外拉，然后在２ｓ内垂直离开以在培养基表面形成连续的拉丝，重复操作５—６个菌落，每个菌落平行做２次，测量菌落拉丝的最大长度（伽ｎ），结果以“平均值士标准方差”表示。
１．２．４乳酸茵胞外多糖的提取将１．２．３得到的菌株接种于筛选ＭＲＳ液体培养基中，３０℃发酵２４ｈ，取１０ｍＬ培养物，沸水浴１０ｍｉｎ，冷却至室温，加质量分数为８０％的三氯乙酸至终浓度为４％，４℃静置过夜，１２ｏｏｏｇ离心２０ｍｉｎ，轻倾上清液于透析袋中，对流水透析２４ｈ，再对双蒸水透析３６ｈ，４次换水，定容，待用。
１．２．５硫酸－苯酚法测定乳酸茵胞外多糖（ＥＰＳ）的含量将１．２．４得到的胞外多糖样品用Ｄｕｂｏｉｓ推荐的硫酸一苯酚法［１５］测定，用葡萄糖做标准曲线（如图１），从曲线上求得ＥＰＳ的含量。
以空白培养基为对照，扣除背景干扰。
’１．２。
６·显微镜观察产胞外多糖乳酸茵细茵形态对分离菌株进行革兰氏染色，用ＭｏｔｉｃＰＭＢ５—２２３２—５摄影显微镜观察细胞形态。
１．２．７产胞外多糖乳酸茵的鉴定产胞外多糖乳酸菌的鉴定采用法国梅里埃公司鲁奎、蠢棺益图１硫酸一苯酚法测定胞外多糖含量的标准曲线的ＡＰＩ细菌鉴定系统进行，将纯菌株在ＭＲＳ琼脂培养基上３７℃微厌氧培养４８ｈ，用无菌棉拭子收集细菌，在ＡＰＩ５０ＣＨ试剂条凹槽中加ＡＰＩ５０ＣＨＬ培养基并接种，用石蜡油封好，３７℃培养２４～２８ｈ，记录菌株对碳水化合物的发酵结果，将其输入梅里埃公司的鉴定软件ＡＰＩＬＡＢＰｌｕｓ进行鉴定。
高产胞外多糖乳酸菌的筛选及培养条件优化孙军德;刘先【摘要】从酸菜汁和生鲜奶中筛选出一株高产胞外多糖的乳酸菌L3,应用苯酚一硫酸法测定其胞外多糖的产量.分别改变基础培养基的碳源、氮源、发酵温度、时间、pH等条件,探索其对乳酸菌L3胞外多糖生物合成能力的影响.结果表明:葡萄糖和蛋白胨分别是乳酸菌产生多糖的良好碳源和氮源.该菌株胞外多糖的最佳生物合成条件为:初始pH值6.5,发酵温度37℃,发酵时间24h,此条件下胞外多糖的生物合成量为108.49mg·L-1.【期刊名称】《沈阳农业大学学报》【年(卷),期】2010(041)001【总页数】4页(P90-93)【关键词】乳酸菌;胞外多糖;筛选;培养条件优化【作者】孙军德;刘先【作者单位】沈阳农业大学,土地与环境学院,沈阳,110866;沈阳农业大学,土地与环境学院,沈阳,110866【正文语种】中文【中图分类】Q939.11.7乳酸菌是能从葡萄糖（或可利用的碳水化合物）发酵产生大量乳酸的一群细菌。
它们无处不在，广泛分布在人体、动物、植物和整个自然界。
乳酸菌用途广泛，在食品中的应用有着悠久的历史，很多乳酸菌菌株被认为是没有致病可能的。
因为其的安全性，乳酸菌广泛应用于食品和药品领域。
作为保健食品和药品，可以改善和提高人的健康水平，延年益寿；还可以作为微生物学和微生态学领域研究的模式生物。
大量的乳酸菌被人们给予“安全”或“通常是安全的”（GRAS）的地位[1-3]。
多糖是指由20个以上单糖组成的糖类化合物，根据来源不同分为植物多糖、动物多糖和微生物多糖。
根据糖类组成不同，又可分为同多糖和杂多糖。
乳酸菌胞外多糖（lactic acid bacterium expolysaccharides，LAB EPS）是由乳酸菌在生长代谢过程中发酵产生并分泌到细胞外的黏液或荚膜多糖，是常渗入培养基中的一种糖类化合物[4-5]。
乳酸菌EPS可以改善发酵乳的组织状态和菌株对肠道黏膜的吸附。
乳酸菌胞外多糖的研究贾俊伟（XX大学生命科学院生物工程）摘要:本文主要从产胞外多糖的菌株的筛选，生理功能，分离纯化的方法，测定方法四个方面论述了关于乳酸菌胞外多糖的研究进展。
目的在于为乳酸菌胞外多糖以后的研究和应用奠定理论支持。
关键词：乳酸菌胞外多糖；生理功能；分离纯化；Advances in exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria Abstract:this article mainly from the screening of strains of exopolysaccharide production, physiological functions, separation and purification methods, four aspects discusses the determination method of the research progress of exopolysaccharide produced by lactic acid bacteria.Aims to extracellular polysaccharide of lactic acid bacteria and application to lay the theoretical support for the later research.Key words: extracellular polysaccharide of lactic acid bacteria;Physiological function;Separation and purification;乳酸菌是一类革兰氏染色呈阳性、可以将糖类发酵成乳酸的、无芽孢的的益生菌，是安全的、可食用的微生物。
LAB EPS是指在生长过程中,LAB分泌到细胞壁外的、不与细胞表面永久粘附的、在培养基中渗透的一类功能性生物大分子。
第27卷 第2期 中 国 乳 品 工 业Vol 127,No 12 1999年 4月 CHINA DA IR Y INDU STR YApr.1999乳酸菌胞外多糖的研究进展Advance in Exopolysaccharide R esearch by Lactic Acid B acterium 顾瑞霞Gu Ruixia 骆承庠Luo Chengxiang 张 文Zhang Wen (东北农业大学畜产品加工研究所・哈尔滨150030) (呼伦贝尔盟招商局・海拉尔市021008) (Institute of Animal Food Processing ,Northeast Agri.Univ.)(Hulunbeir League Investment Attract Bureau )摘 要 介绍了乳酸菌胞外多糖的生物合成、分离、提纯及结构分析,生物功能特性及其应用。
关键词 乳酸菌 胞外多糖 评述Abstract This paper is aimed to provide an overview of t he synt hesis conditions ,extraction met hods and structure analysis ,biological properties and t heir ap 2plications of exopolysaccharides production by lactic acid bacterium.K ey w ords lactic acid bacterium EPS review0 引 言 蛋白质、核酸和多(寡)糖是最重要的3种生物大分子,蛋白质和核酸在生命现象中的重要性为世人所知。
多糖是指由20个以上单糖组成的糖类化合物,根据来源不同,可分为植物、动物和微生物多糖。
根据糖类组成不同,又可分为同多糖和杂多糖。
多(寡)糖的结构常因单糖的构型(L 或D 型,α或β型)、糖基化方式(五或六环)、有无分支、糖中多个羟基是否被取代(如氨基、硫酸基、磷酸基、酰基)、相邻单糖基糖苷的位置等的不同而不同。
乳酸菌胞外多糖生理功能的研究进展摘要：食品级乳酸菌分泌的胞外多糖是近年来乳品科学的研究热点。
概述了乳酸菌胞外多糖的来源、分类及生理功能，重点介绍了有关乳酸菌胞外多糖免疫调节和抗肿瘤活性的相关研究，展望了其在发酵制品、保健品和医药等领域研究的开发前景。
关键词：乳酸菌；胞外多糖；生理功能；免疫活性；抗肿瘤Advancements on physiological functions of LAB exopolysaccharidesAbstract:Exopolysaccharide produced by lactic acid bacteria (LAB> have been the focus of dairy researchin recent years. This article provides an overview of source, classification and physiological functions ofLAB exopolysaccharides, introduces immunomodulatory and antitumor activities of exopolysaccharidesand looks forward to the prospects of exopolysaccharides in fermented products, health products andmedicine in many fields.Key words:lactic acid bacteria (LAB>。
exopolysaccharide (EPS>。
physiological functions。
immuno-modulatory。
antitumor1 乳酸菌及其胞外多糖乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB>是能够发酵碳水化合物并产生大量乳酸的微生物总称，是具有悠久历史的食品工业生产菌株，被广泛应用于发酵制品、肉类制品及医药保健品等领域。
《蒙古口蘑胞外多糖提取、纯化及生物活性研究》篇一一、引言蒙古口蘑是一种具有重要经济价值的食用菌，其胞外多糖（EPS）因其独特的生物活性而备受关注。
EPS具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等多种生物活性，因此对其提取、纯化及生物活性的研究具有重要意义。
本文旨在研究蒙古口蘑胞外多糖的提取、纯化方法，并探讨其生物活性。
二、材料与方法1. 材料（1）菌种：蒙古口蘑。
（2）试剂：包括各种提取、纯化及生物活性检测所需试剂。
（3）仪器：离心机、旋转蒸发仪、高效液相色谱仪等。
2. 方法（1）胞外多糖的提取：采用热水浸提法提取蒙古口蘑胞外多糖。
（2）纯化：通过透析、醇沉、柱层析等方法对提取的多糖进行纯化。
（3）生物活性检测：采用体外细胞实验、动物实验等方法检测多糖的抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等生物活性。
三、结果与分析1. 胞外多糖的提取通过热水浸提法成功提取出蒙古口蘑胞外多糖，得率较高，且多糖纯度较好。
2. 纯化结果经过透析、醇沉、柱层析等纯化步骤，成功得到较为纯净的蒙古口蘑胞外多糖。
高效液相色谱分析表明，多糖的分子量分布较为集中，纯度较高。
3. 生物活性检测（1）抗肿瘤活性：通过体外细胞实验发现，蒙古口蘑胞外多糖对肿瘤细胞具有显著的抑制作用，且呈剂量依赖性。
进一步研究表明，该多糖主要通过诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖等机制发挥抗肿瘤作用。
（2）抗氧化活性：动物实验表明，蒙古口蘑胞外多糖具有显著的抗氧化作用，能够显著提高体内抗氧化酶的活性，降低氧化应激水平。
（3）免疫调节作用：该多糖能够显著增强机体的免疫功能，提高免疫细胞的活性，对免疫系统具有调节作用。
四、讨论本研究成功提取、纯化了蒙古口蘑胞外多糖，并对其生物活性进行了研究。
结果表明，该多糖具有显著的抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等生物活性，具有重要的应用价值。
在今后的研究中，可以进一步探讨该多糖的作用机制，以及其在药物、保健品等领域的应用前景。
此外，还可以尝试对不同来源、不同种类的食用菌胞外多糖进行类似的研究，为食用菌的开发利用提供更多的科学依据。
食品与药品 Food and Drug 2010年第12卷第05期 217细菌胞外多糖提取分离技术研究进展王桂兰1,2，凌沛学1,2*（1.山东大学药学院，山东 济南 250012；2. 山东省生物药物研究院 博士后科研工作站，山东 济南 250101）摘 要：细菌胞外多糖是当今进入工业化发酵生产的一类重要的多糖。
由于多糖种类的不同，其分离纯化工艺不尽相同。
本文综述细菌胞外多糖发酵生产中提取分离技术的研究进展，并比较了各种分离技术，介绍了针对极具商业价值的微生物多糖的几种新型提取分离技术，展望了微生物多糖研究的发展趋势。
关键词：胞外多糖；提取；分离；发酵中图分类号：Q539 文献标识码： A 文章编号：1672-979X （2010）05-0218-03收稿日期：2010-03-01作者简介：王桂兰（1986-），女，山东滨州人，硕士研究生，微生物与生化药学专业*通讯作者：凌沛学，男，研究员，博士生导师 Tel:（0531）81213003 E-mail:peixue.ling@Progress on Extraction and Isolation T echnologies of Bacterial Exocellular PolysaccharidesW ANG Gui-lan 1,2, LING Pei-xue 1,2（1. School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Jinan 250012, China; 2. Post-doctoral Scientific ResearchWorkstation, Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province, Jinan 250101, China ）Abstract: Bacterial exocellular polysaccharides are important in industrial fermentation now. Because of different species, the technologies of extraction and isolation are different for each polysaccharide. All the technologies applied usually at home and abroad in fermentation industry are reviewed in this paper and compared with each other. The paper also introduces some new technologies and methods for the extraction and isolation of certain valuable polysaccharides, and gives an outlook about the progress on bacterial exocellular polysaccharides.Key Words: exocellular polysaccharide; extraction, isolation; fermentation多糖在自然界高等植物、藻类、微生物及动物体内均存在，分布极广。
一种微生物胞外多糖及其制备方法微生物胞外多糖是一类由微生物细胞合成并分泌到细胞外的复杂碳水化合物。
它们由多种糖分子通过特定的化学键连接而成，具有多样的结构和生物活性。
微生物胞外多糖具有广泛的应用领域，例如在医药、食品、化妆品等行业中被用作功能性添加剂，具有抗菌、抗氧化、免疫调节等多种生物活性。
制备微生物胞外多糖的方法有多种，下面将介绍其中一种常用的方法。
首先，需要选择合适的微生物菌株作为产生胞外多糖的来源。
常见的菌株有蓝藻、酵母菌、乳酸菌等。
选择菌株时需考虑其菌株特性、产量以及产生胞外多糖的能力。
接下来是培养菌株。
通常采用液体培养的方式，将选定的菌株接种到培养基中，提供菌株所需的养分和环境条件，如温度、pH值等。
培养过程中需要注意菌株的生长状态，及时调节培养条件以促进菌株生长和胞外多糖的产生。
在培养菌株达到一定生长状态时，需要采集菌体和胞外多糖。
一般采用离心的方法将培养液中的菌体和胞外多糖分离。
离心后，可将胞体分离出来，以获得胞外多糖。
此外，还可以通过过滤等方法将胞外多糖从培养液中提取出来。
提取的过程中需要注意对胞外多糖的保护，避免其在提取过程中受到损伤。
提取得到的胞外多糖需要经过一系列的纯化步骤，以去除其他杂质和溶剂。
通常采用离子交换层析、凝胶过滤层析等技术来纯化胞外多糖。
纯化过程中需要注意对胞外多糖分子结构的保护，避免其发生断裂或降解。
最后是对纯化得到的微生物胞外多糖进行表征和分析。
常用的方法有核磁共振（NMR）、质谱（MS）等。
这些分析方法可以确定微生物胞外多糖的分子结构、组成和理化性质，从而为进一步的研究和应用提供依据。
通过上述方法，我们可以制备得到微生物胞外多糖，并对其进行分析和表征。
制备方法的选择和优化对于获得高产量和高质量的微生物胞外多糖至关重要。
同时，制备过程中需要注意对微生物菌株的培养和胞外多糖的保护，以确保最终得到的产品具有较好的生物活性和应用性能。
微生物胞外多糖作为一类重要的生物大分子，具有广泛的应用前景。
微生物胞外多糖的提取与应用研究进展王蓓蓓1张伟2周晓伦2*（1白水镇白水中心卫生院，甘肃平凉744000；2甘肃医学院，甘肃平凉744000）摘要：随着科学研究的不断深入与提取技术的提高，近年来对多糖生物学功能的认识有了量的提升和质的飞跃，多糖的生物学功能涉及免疫、癌变、肿瘤和衰老等方面，可以应用于食品、医药、农业、污水处理等领域。
该文对多糖的定义、分类、生物合成和多糖的提取方法进行了概述，重点阐述了高压脉冲电场技术、超临界流体萃取法、双水相萃取法。
虽然对微生物多糖的研究仍在不断深入，但微生物多糖真正的应用价值尚未得到实现。
目前，胞外多糖已经作为食品添加剂运用到食品工业中，除此之外多糖还可用于制备抗肿瘤新药或疫苗、抗凝血等应用。
关键词：微生物胞外多糖；提取方法；生物合成；超临界流体萃取法中图分类号Q539文献标识码A文章编号1007-7731（2021）18-0021-03Research Progress on Extraction and Application of Microbial Extracellular Polysaccharides WANG Beibei1et al.（1Baishui Central Health Center,Pingliang744000,China）Abstract:With the continuous development of scientific research and the improvement of extraction technology,re⁃searchers in recent years on the biological function of polysaccharide understanding has a quantity of improvement and qualitative leap,involving immunity,cancer,tumor and aging and other aspects,can be applied to food,medi⁃cine,agriculture,sewage treatment and other fields.This article gives a detailed overview of the definition,classifica⁃tion,biosynthesis and extraction methods of polysaccharides,with emphasis on high-voltage pulsed electric field technology,supercritical fluid extraction,and aqueous two-phase extraction.Although the research on microbial polysaccharides continues to deepen,the true application value of microbial polysaccharides has not been realized. At present,extracellular polysaccharides have been used as food additives in the food industry.In addition,polysac⁃charides can also be used to prepare new anti-tumor drugs or vaccines.Key words:Microbial Exopolysaccharide;Extraction method;Biosynthesis;Supercritical fluid extraction1多糖的定义与分类多糖（Polysaccharide）属于典型的糖类物质，其分子结构十分庞大而且复杂，是由多个单糖分子失水与缩合构成，为典型的聚合糖高分子碳水化合物，由至少4个单糖并通过糖苷键进行结合。
产胞外多糖(EPS)乳酸菌菌株的分离、筛选1.目的要求(1)熟悉产胞外多糖乳酸菌菌株的筛选方法(2)了解乳酸菌产胞外多糖的基本原理2.基本原理微生物胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离的荚膜多糖或黏液多糖，属于微生物的次级代谢产物。
微生物EPS是一种长链、高分子质量的聚合物，甚独特的物理学和流变学特性以及使用安全性使它在食品和非食品工业备受青睐，尤其是它在医药领域所具有的巨大应用潜能正日愈引起人们的广泛关注。
自然界中能产生多糖的微生物种类很多，涉及细菌、酵母和丝状真菌。
长久以来，乳酸菌用于发酵乳的生产，通常认为乳酸菌EPS安全性更为可靠，而且乳酸菌作为生理功能调节剂，利用益生菌制成活菌制剂，省去常规发酵、提取等繁琐工艺。
因此，开发乳酸菌EPS较其他微生物EPS来说，更具有理论意义与实际价值。
多糖难溶于乙醇，因此如果乙醇溶液中有絮状沉淀出现，通常可认为样品中含有多糖。
本实验就是利用多糖的这种性质来沉淀分离微生物EPS以供下一步的多糖检测。
目前用于多糖检测的方法较多，主要有干燥称重法、硫酸一蒽酮法、DNS(3, 5一二硝基水杨酸）法、苯酚一硫酸法、相对黏度法和Imshenetskii等报道的浊度法等。
由于苯酚一硫酸法具有简单方便、显色稳定、灵敏度高、重现性好、不受蛋白质干扰等优点而深受欢迎。
其原理是根据苯酚一硫酸试剂与游离的寡糖和多糖中的己糖、糖醛酸（或甲苯衍生物）发生的显色反应。
己糖在490nm处（戊糖及糖醛酸在480nm处）有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。
具体操作见实验步骤。
本实验利用多糖难溶于乙醇的性质来沉淀分离微生物EPS。
本实验以乳制品和肉制品为初始原料，分离产EPS的乳酸菌菌株并筛选高产EPS的优良菌株。
3实验材料3.1原料从市场上购买的乳制品、肉制品。
3.2培养基MRS液体培养基、固体培养基（1.5％琼脂）。
乳酸菌发酵产生胞外多糖的研究进展刘先;康小红;龄南【摘要】本文概述了乳酸菌胞外多糖(EPS)的生物合成途径,EPS产量的影响因素及对其结构性能的研究.【期刊名称】《中国乳业》【年(卷),期】2010(000)002【总页数】3页(P46-48)【关键词】乳酸菌;胞外多糖;功能;研究进展【作者】刘先;康小红;龄南【作者单位】沈阳农业大学;内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司;内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司【正文语种】中文按照组成的不同，乳酸菌（lactic acid bacteria，缩写为LAB）产生的胞外多糖（exopolysaccharides，缩写作EPS）可以分为3类：①葡聚糖类，即右旋糖苷、改性葡聚糖及变异聚糖；②果聚糖类，如左聚糖；③由嗜温乳酸菌及嗜热乳酸菌产生的杂多糖类。
在过去，人们对黏乳酸菌的兴趣与日俱增，比如乳酸乳球菌乳脂亚种（Lactococcus lactis subsp.cremoris）、乳酸乳球菌乳亚种（ctis ctis）、德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbreuckiisubsp.bulgaricus）以及唾液链球菌嗜热亚种（Streptococcus aslivariussubsp.thermophilus）等。
由于这些细菌具有公认的安全（generally recognized as safe，缩写为GRAS）性，所以它们产生的EPS被广泛地用作食品工业中的增稠剂、凝胶剂以及稳定剂。
1 EPS的生物合成途径因菌种不同，乳酸菌EPS的合成会发生在生长的不同阶段。
按合成位点和模式不同，乳酸菌EPS的生物合成分为2种类型，即位于细胞壁外的同源多糖（homopolysacchride）的合成和位于细胞膜上的异源多糖（heteropolysaccharide）的合成。
1.1 同源多糖的生物合成同源多糖（如葡聚糖、果聚糖）是在胞外合成的。
合成体系包含糖基供体（蔗糖）、糖基受体及葡聚糖蔗糖酶（dextransucrase）。
乳酸乳球菌胞外多糖提取纯化工艺研究陶静*，凌飞跃，张博，宋佳静，周安琪，纵伟（郑州轻工业学院食品与生物工程学院，郑州 450002）摘要：乳酸菌胞外多糖分离纯化的步骤一般可由蛋白质的分离、多糖的提取纯化和粗多糖的纯度鉴定三个部分组成。
本文对分离蛋白以及乙醇沉淀多糖阶段中各个条件分别进行单因素优化实验，正交试验得到乳酸乳球菌胞外多糖提取纯化的最佳工艺条件为60%三氯乙酸处理后14000×g离心40 min可有效除去发酵液中多数蛋白质，用3倍体积100%乙醇处理12 h可有效沉淀多糖。
得到纯度高、含杂量低粗多糖，有利于进行进一步结构鉴定和分析，为乳酸乳球菌胞外多糖的进一步研究和应用提供了理论依据。
关键词：乳酸菌；胞外多糖；多糖提取；工艺优化中图分类号：TS202.1/Q939.9 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2019）10-0100-05doi：10.19804/j.issn1006-2513.2019.10.010Study on extraction and purification technology of Lactococcus lactisexopolysaccharideTAO Jing*，LING Fei-yue，ZHANG Bo，SONG Jia-jing，ZHOU An-qi，ZONG Wei （School of Food and Biological Engineering， Zhengzhou University of Light Industry 450002）Abstract： The isolation and purification of EPS LAB include three stages： protein isolation， purification and identification of polysaccharides. In this paper， a single factor optimization experiment was carried out on various conditions， which involved in separation of proteins and the ethanol precipitation， finally， the orthogonal experimentis designed to prove the results， to find the best conditions for the extraction of Lactococcus lactis LAB. Results showed that after the treatment with 60% TCA， under the centrifugal force of 14000×g and last 40min， the vast majority of proteins in the fermentation broth can be removed efficiently； the optimum process for the precipitation of polysaccharides was 3 times the volume of 100% ethanol for the treatment of 12h. The purpose of this study is to obtaina high purity polysaccharide products， which is conducive to the further structural identification and analysis， provides theoretical basis for further research and application of Lactococcus lactis LAB.Key words： Lactic acid bacteria（LAB）；exopolysaccharide （EPS）；extracellular polysaccharide；process optimization乳酸乳球菌胞外多糖（EPS）为乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一类多糖类化合物［1］。
由于乳酸菌相比其他工业用菌安全性高，故近年来对乳酸菌胞外多糖的研究也逐渐增多。
从已有的研究结果来看，合成EPS的乳酸菌中乳酸乳球菌合成能力较强［2］，为80～600mg/L［3-4］。
胞外多糖作为食品添加剂［5］，可用作多种食品的增稠剂、稳定剂、乳化剂和凝胶剂［6］；具有生物收稿日期：2019-06-21 *通讯作者作者简介：陶静（1979-），女，副教授，硕士，研究方向：微生物发酵与保健品研发。
taojing@。
100活性如免疫活性、抗肿瘤和抗溃疡，可应用于医药领域［3］，分子量大约为4.0×104～6.0×106之间［7］。
尽管长期以来研究者们对乳酸菌产EPS的化学组成存在着分歧，但是较一致认为：从乳酸菌中分离得到的胞外聚合物是由α-和β-连接糖重复单元所组成的多糖，并且不同乳酸菌分泌的EPS类型不同［8］。
虽然单糖组成可能有些相似，多为半乳糖、葡萄糖和鼠李糖，但是各成分比率不同［1］。
由于发酵液中EPS的产量较低、蛋白质含量较高，给EPS的提取带来较大困难［9］。
因此，发酵液中提取EPS工艺关键即是蛋白质的除去与EPS的沉淀，可得到稳定、易使用、杂质少的多糖产品。
本实验对乳酸乳球菌发酵液通过不同的条件进行提取纯化EPS，验证最佳除蛋白条件和多糖沉淀条件，为工业化生产乳酸菌胞外多糖奠定理论基础。
1 材料与方法1.1 材料与试剂乳酸乳球菌乳亚种LL9（Lactococcus lactis ctis LL9）（以下简称乳球菌LL9）：郑州轻工业学院实验室提供，由乳酸乳球菌乳亚种6242（中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC））紫外诱变，经葡萄糖耐受及乳链菌肽耐受水平筛选挑出，比较生物活性最终筛出活性高、乳链菌肽产量高的最优化菌株。
分离纯化条件为：发酵液→添加三氯乙酸至2.5%（w/v）→500r/min搅拌5min→4℃沉淀除蛋白20min→10000r/s离心20min除菌体→上清液透析12h→苯酚硫酸法测定EPS。
可得乳酸菌胞外多糖的产量为262.63mg/L［2］。
6%的苯酚溶液：精确称取6.0g重蒸酚晶体，用少量的蒸馏水溶解后倒入100mL的容量瓶中，定容、充分摇匀，倒入棕色试剂瓶中备用［10］。
1.2 实验方法1.2.1 菌种活化保存于甘油管中乳球菌LL9接种于MRS液体培养基内，37℃培养，传代2～3次后，染色镜检，挑选优良菌株，转接斜面培养，4℃冰箱冷藏保藏备用。
1.2.2 摇瓶发酵活化后菌液5%转入摇瓶发酵，37℃恒温150r/min震荡培养24h。
1.2.3 发酵液处理取发酵终点发酵液，10000×g下离心8min 去除菌体，取上清液备用。
1.2.4 苯酚硫酸法测定EPS该方法较适合乳酸菌EPS检测，相对误差为0.2%，具有较好的准确性［9］。
透析液经稀释取2.0mL加入1.0mL 6.0%的苯酚溶液，5.0mL 95.0%的浓硫酸，静置10min，高速振荡器上振荡摇匀，静置20min至冷却。
490nm测定OD 值。
标准曲线上查找对应糖含量，即得乳酸菌胞外多糖产量。
1.2.5 提取纯化工艺流程斜面→MRS液体培养基活化两次（37℃，24h）→摇床扩大培养（37℃，150r/min，24h）→离心去除菌体（5mL，10000×g，8min）→添加三氯乙酸50%（w/v）（12h）→500r/min搅拌5min→离心沉淀除蛋白（4℃，18000×g，30min）→上清加乙醇沉淀多糖（100%，3倍体积，4℃，处理12h）→离心（12000×g，30min）→冷冻干燥→沉淀温水溶解（稀释10倍）→透析MD34（4℃，处理12h）→苯酚-浓硫酸法测定OD值→EPS纯度鉴定2 结果与分析2.1 苯酚硫酸法标准曲线绘制用葡萄糖作为标准物，绘制标准曲线。
由图1可知，糖浓度在0～32mg/L时，糖浓度和透光度呈线性关系。
葡萄糖浓度（mg/L）OD值（49nm）图1 Phenol-H2S04法测定糖浓度的标准曲线Fig.1 Standard curve for determination of sugar concentration by Phenol- H2S04 method1011022.2 除蛋白条件优化2.2.1 除蛋白中三氯乙酸浓度的优化将发酵液通过离心的方法除去菌体后，分别加入30%、40%、50%的三氯乙酸溶液1/5体积，探讨不同三氯乙酸浓度对蛋白质沉淀的影响，如图2所示。
三氯乙酸浓度在30%～50%时与发酵液多糖产量呈正比关系，三氯乙酸浓度过高会对多糖的结构产生影响，因此初步确定除蛋白阶段三氯乙酸的最优浓度为50%。
2.2.2 除蛋白中离心力优化本实验中发酵液细胞分离后，加入50%的三氯乙酸溶液1/5体积，分别在10000×g 、12000×g 、13000×g 、16000×g 离心力下离心30min ，选取最优化离心条件，如图3所示。
在离心力16000×g 时，多糖得率达到最大值，选16000×g 为最优离心力。
三氯乙酸浓度（%）E P S 含量（m g /L ）图2 三氯乙酸浓度对胞外多糖产量的影响Figure 2 Effect of trichloroacetic acid concentration onthe yield of extracellular polysaccharides380.00360.00340.00320.00离心力（×g ）E P S 含量（m g /L ）图3 离心力对胞外多糖产量的影响Figure 3 Effect of centrifugal force on the yield ofextracellular polysaccharides 2.2.3 除蛋白质中离心时间的优化本实验中发酵液细胞分离后，加入50%的三氯乙酸溶液1/5体积，在16000×g 的离心力下分别离心10min 、20min 、30min 、40min ，选取最优化离心时间，如图4所示。
离心的时间选取30～40min 为最佳。
2.3 乙醇沉淀多糖条件的优化2.3.1 乙醇沉淀多糖中乙醇浓度的优化本实验中发酵液细胞分离后，加入50%的三氯乙酸溶液1/5体积，在16000×g 的离心力下分别离心40min ，加入3倍体积浓度分别为70%、80%、95%、100%的乙醇溶液，4℃条件下醇沉12h 。
