【实验九】DNA的粗提取与鉴定
陈小珺（江西省赣州市第三中学 341000）
1 教学建议
在本实验的教学中，教师应注意以下几点。
1.1 实验材料必须准备充足。本实验所用的实验材料是鸡血细胞液,由活鸡的鲜血经沉淀后获得。每组(2个学生)需用5 mL 鸡血细胞液,则每班(50人)至少需要130 mL,而鸡血细胞液与鸡血的体积比为1:3,这样每班至少需要390 mL 鸡血细胞液。宰杀1只中等大小的活鸡,一般可得120 mL 左右的鲜血,因此,1个班实验需要买4只活鸡。也可以到市场售活鸡处去索取鸡血,但所带烧杯中必须提前放入抗凝剂。（每100ml鸡血加入3g柠檬酸钠）
1.2 盛放鸡血细胞液的容器,最好是塑料容器。因为鸡血细胞破碎后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,由于细胞内DNA的含量本来就比较少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就会更少。
1.3 获取较纯净的DNA的关键步骤。
1.3.1 充分搅拌鸡血细胞液：将鸡血细胞液与蒸馏水混合以后,必须用玻璃棒沿一个方向快速搅拌,使鸡血细胞加速破裂,并释放出DNA。
1.3.2沉淀DNA时必须用冷酒精：体积分数为95%的酒精在冰箱中至少存放24 h。
1.3.3正确搅拌含有悬浮物的溶液实验步骤3、5、7,都需要用玻璃棒搅拌。教师应提醒学生注意,在进行步骤3、5时,玻璃棒不要直插烧杯底部,而且搅拌要轻缓,以便获得较完整的DNA分子。进行步骤7时,要将玻璃棒插入烧杯中溶液的中间,用手缓慢转动5 min。
2 实验原理的补充介绍
2.1 DNA的释放 本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破。DNA位于鸡血细胞的细胞核中,正常情况下不会释放出来。为了使DNA从细胞核中释放出来,实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸馏水并且搅拌的方法。蒸馏水对于鸡血细胞来说,是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞破裂。同时,再加上搅拌的机械作用,就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂),于是释放出DNA,当然也有RNA。但是,释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起。
高中生物重要实验：DNA的粗提取与鉴定
考点提示：
(1)鸡血能用猪血代替吗?什么缘故?不能，因为哺乳动物的红细胞中没有细胞核，不能提取DNA。
(2)鸡血中为何要加柠檬酸钠?为何要弃去鸡血细胞的上清液?
防止血液凝固;因为上清液是血浆，不含细胞和DNA。
(3)胀破细胞的方法?能用生理盐水吗?
向血细胞中加入蒸馏水，使细胞大量吸水而胀破;不能用生理盐水，因为血细胞在蒸馏水中不能吸取水分。
(4)该实验中最好应用玻璃烧杯依旧塑料烧杯?什么缘故?最好用塑料烧杯，因为玻璃烧杯容易吸附DNA。
(5)前后三次过滤时，所用纱布的层数分别是多少?什么缘故?
第一次用一层纱布，有利于核物质透过纱布进入滤液;第二次用多层纱布，能防止DNA丝状物透过纱布进入滤液;第三次用两层纱布，既有利于DNA透过纱布，又能防止其它杂质透过纱布。
(6)若实验中所得黏稠物太少，其缘故是什么?第一次加蒸馏水过少，细胞未充分胀破;第二次加蒸馏水过多或过少;第一次过滤用了多层纱布;第二次过滤用了一层纱布。
(7)两次加入蒸馏水的目的分别是什么?
第一次是为了使血细胞吸水胀破;第二次是为了降低氯化钠的浓度，有利于DNA有析出。
(8)实验中搅拌溶液时，为何总要沿一个方向搅拌?防止DNA分子受到损害。
(9)两次析出DNA的方法分别是什么?原理分别是什么?
第一次是加蒸馏水，降低氯化钠的浓度，促使DNA析出;第二次是加入冷酒精，因为DNA不溶于酒精溶液。
(10)三次溶解DNA的液体分别是什么?原理分别是什么?
第一次、第二次差不多上用浓度为2mol/L的氯化钠溶液，第三次用的是0.015mol/L(或2mol/L)的氯化钠溶液。其原理是DNA在氯化钠中的溶解度，是随着氯化钠的浓度的变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。2mol/L的氯化钠溶液和0。015mol/L的氯化钠溶液对DNA的溶解度都比较高。
DNA的粗提取与鉴定
主讲：黄冈中学优秀生物教师 王小敏
课题目标：
1、通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理、化学性质；
2、理解DNA粗提取与鉴定的原理。
课题重难点：
DNA的粗提取和鉴定方法。
一、基础知识
（一）提取DNA的方法
1、提取生物大分子的基本思路
选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
2、提取DNA的基本思路
利用DNA与RNA．蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 3、DNA粗提取的原理
（1）DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同。
DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。
DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最小；在2mol/L的NaCl溶液中溶解度最大。
（2）DNA不溶于酒精
DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。
（3）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
①蛋白酶——水解蛋白质，对DNA没有影响。
②高温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃，而DNA在80℃以上才会变性。
③洗涤剂——溶解细胞膜，去除脂质和蛋白质，但对DNA没有影响。
（二）DNA的鉴定
沸水浴条件下，DNA遇二苯胺被染成蓝色。
原理总结：通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以从细胞中提取和提纯DNA；再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA。
二、实验设计
（一）实验材料的选取
1、材料：
鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取2～3种实验材料）
2、原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液
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1 / 11 DNA的粗提取与鉴定
1．根本原理
2．操作过程
(1)操作流程
选取材料→破碎细胞，获取含DNA的滤液→去除滤液中的杂质→DNA的析出与鉴定。
(2)材料的选取：选用DNA含量相对较高的生物组织。
(3)破碎细胞
①动物细胞：易破碎，可通过吸水破裂。
②植物细胞：参加洗涤剂、食盐后研磨。
(4)除去杂质的方法
方法一：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不同，通过调节NaCl溶液的浓度除去溶于和不溶于NaCl溶液中的杂质。
方法二：利用DNA对酶的耐受性，直接在滤液中参加嫩肉粉，反响10～15 min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质，而不会破坏DNA。
方法三：利用DNA对高温的耐受性，将滤液放在60～75 ℃的恒温水浴箱中保温10～15 min，使蛋白质变性沉淀而DNA分子还未变性。
(5)DNA的析出：向处理后的滤液中参加与滤液体积相等的、冷却的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3 min，溶液中会出现白色丝状物，用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。
(6)DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
易错警示 (1)本实验不能用哺乳动物成熟红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟红细胞无细胞核。可选用鸡血细胞作材料。(2)实验中两次使用蒸馏水，第一次的目的是使成熟的鸡血细胞涨破释放出DNA，第二次的目的是稀释NaCl溶液，使DNA从溶液中析出。
1．如下图表示以鸡血为实验材料进展DNA的粗提取与鉴定的操作程序，请分析回答如下问题：
(1)步骤一中，向鸡血细胞液中参加____________并搅拌，可使鸡血细胞破裂。
(2)步骤二中，过滤后收集含有DNA的____________。
(3)步骤三、四的操作原理是________________________________________________
________________________________________________________________________； word
