拖尾原因及解决办法

技术报告

改善反相HPLC中的峰拖尾

在反相HPLC中峰拖尾是一个普遍的现象。特别是分离碱性化合物和通过

HPLC分析药物成分时是经常产生拖尾缘由。峰拖尾可以引起分离度降低，灵敏

度减弱，精密度和定量变差。图1表明峰之间的分离度和灵敏度与峰拖尾成负相

关。图2表明准确度和精密度因数据系统无法准确识别峰的起点和终点而受到影

响。

图1 拖尾对分离度和灵敏度的影响

当峰拖尾（T，拖尾因子）从1.0增加到2.0时，分离度（Rs）从1.5降到

1.0。灵敏度（峰高）由于峰的体积增大和样品的浓度降低而降低。

图2 峰拖尾对准确度和精密度的不利影响

1

拖尾峰使数据系统难以准确确定峰的终点，故而影响准确度和精密度。在这

个例子中，在B点测得到峰面积比在A点测得的峰面积少约3%。

峰拖尾的原因，峰拖尾的主要原因有：

1、 溶解样品的溶剂比流动像更强，

2、 样品量过载，

3、 固定相中的硅醇基与胺类物质相结合反应，

4、 硅胶吸附酸性化合物，

5、 色谱柱柱床中有空隙。

只要确定了拖尾的原因就可以采取措施减少拖尾并消除之。（表1）

表1 峰拖尾：原因及解决方案 原因 解决方案

样品溶剂极性强于流动相 在流动相中溶解样品，尽可能降低样品

溶剂的强度

样品量过载 减少进样量，参考表2中推荐的不同柱

型对应的不同进样体积

硅醇基与胺类物质的结合 1.调节流动相的pH<3.0。

2.增加流动相的离子强度，25mM～

50mM。

3.流动相中增加竞争性的胺类，10mM

2的TEA（三乙胺）。

4.选择低硅醇活性的固定相。参照图6

C18柱按固定相硅醇活性分级。

5.

酸性物质在硅胶上的吸附 1. 增加流动相中盐的浓度，25mM～

50mM。

2. 调节流动相的pH<3.0

3. 增加竞争性的有机酸，1%醋酸或者

是0.1%TFA（三氟乙酸）

柱子空隙 更换新的色谱柱

尝试填充空隙很少能达到较好的效果。

一、由于溶解样品的溶剂极性强于流动相而引起的拖尾

峰形后拖解决方案和实例

继前一篇《峰形前拖解决方案》，我们对峰形后拖的情况及其解决方案也进行了总结。与《峰形前拖解决方案》相同，在这里我们也同样的撇开所有的污染、塌陷、死体积等其它因素，假设系统是好的，柱子是新的、好的，单纯探讨液相方法与峰形后拖之间的关系，通过调整液相方法来解决峰形前拖的问题。这样有利于厘清拖尾产生的根本原因，对峰形拖尾的问题提供一些经验上解决方案。

首先让我们了解一下峰形后拖的几种常见形式，三种常见的拖尾如下：

系统是好的，柱子是好的，为什么会产生后拖？我们还是回顾一下，色谱分离的一般过程，正常的峰形应该是样品在色谱柱上均匀前移的情况下得到的，浓度分布在整个通过色谱柱柱床的过程中任何时候都呈正态分布，如下图所示：

色谱分离是一个物理过程，样品分子经过在固定相与流动相之间的多次分配、吸附解吸，由于不同分子与固定相和流动相之间的相互作用力的差异而使它们在色谱柱中的移动速度不同，以此实现分离的目的。相同色谱条件下，有些化合物容易产生拖尾，有些则不产生拖尾，这说明拖尾的产生跟样品本身的性质是密切相关的，通常非极性和弱极性的化合物能获得良好的峰形，而带有－COOH、－NH2、－NHR、－NR2等极性基团的化合物则比较容易产生拖尾。

可以想象一下，样品分子在分析过程所处的环境，一是流动相，二是固定相，流动相可以自由流动的，均一性比较好，因此可以认为样品分子四周都被相同组成的流动相所包围，其对每个样品分子的相互作用力也是均匀的、对称的，不应该是引起浓度分布发生变化的主要原因。考虑固定相，固定相中除了C18长链外还有填料键合时残余的硅羟基，由于C18长链是非极性的，其与样品分子的相互作用力也是很微弱的范德华力，而硅羟基则具有一定的极性Si－Oδ－Hδ＋，在pH一定的条件下甚至还会发生电离，形成－Si－O－ 形式的离子态。Si－Oδ－Hδ＋和－Si－O－对于极性化合物之间的作用力则是一种极性的静电作用力，这种作用力比范德华力要强得多，同时，因为硅胶表面键合了C18长链，由于空间位阻作用，样品分子中能接触到残余硅羟基的机会不会很多，只有少部分的分子才能与残余硅羟基产生作用。这样，大多数的样品分子如非极性分子一样均匀前移，而少量的样品分子由于这种静电作用力的存在而被推迟洗脱出来，导致样品分子的浓度分布发生变化，产生后拖。拖尾严重的程度与样品分子极性大小和残余硅羟基的多少有着直接的关系。

高效液相色谱出峰拖尾的原因

原因 简要说明

柱筛板堵塞 可能由于流动相污染、样品溶液不干净或手动阀门操作不当导致。可通过反冲色谱柱或更换筛板解决。

流动相或样品污染 流动相或样品中的杂质可能导致峰拖尾。更换干净的流动相或样品可解决问题。

流动相pH值不合适 pH值过高或过低可能影响化合物的电离状态，导致峰形拖尾。调整流动相的pH值至合适范围可改善峰形。

样品中干扰物质 样品中的杂质或干扰物质可能与目标化合物竞争色谱柱上的吸附位点，导致峰拖尾。通过样品预处理去除干扰物质可解决问题。

色谱柱色谱柱长时间使用或维护不当可能导致污染或污染或塌陷 塌陷，影响峰形。清洗或更换色谱柱可恢复性能。

柱子失效 色谱柱的填料可能因老化、磨损等原因失效，导致峰拖尾。更换新的色谱柱可解决问题。

流动相粘度过高 流动相粘度过高可能增加流动阻力，导致峰形拖尾。降低流动相粘度可改善峰形。

温度波动 色谱柱温度的变化可能影响化合物的保留时间和峰形。调整并稳定色谱柱温度可避免峰拖尾。

进样量过大 进样量过大可能导致色谱柱过载，出现峰形拖尾。减少进样量或稀释样品可改善峰形。

样品溶剂不合适 样品溶剂的极性大于流动相极性时，可能导致峰形拖尾。更换与流动相极性相近的溶剂溶解样品可解决问题。

柱外效柱外死体积（如进样环、连接管等）中的流体扩应 散和混合可能导致峰形拖尾。优化柱外系统可减少此类效应。

化学或二次保留效应 如硅胶中的硅羟基与目标化合物发生二级作用，可能导致峰形拖尾。在流动相中加入适当的添加剂（如酸、碱或缓冲盐）可减少此类作用。

重金属污染 色谱柱中的重金属离子可能与样品中的某些化合物形成螯合物，导致峰形拖尾。选择低金属含量的色谱柱可减少此类问题。

电泳出现拖尾现象

电泳出现拖尾现象，英文成为smear，就是弥散。

琼脂糖凝胶电泳拖尾是怎么回事？

1：样品浓度过高。这种情况稀释一下就行了。提质粒的时候常出现这种情况。

2：蛋白杂质阻碍DNA的泳动。提基因组DNA时常出现这种情况。

以上两种情况，拖尾都是在电泳条带的后面。

3：样品破碎或是被降解

4：存在RNA

这两种情况，拖尾都是在电泳条带的前面。

PCR产物电泳拖尾，主要从以下两个方面考虑：

1、PCR产物自身原因：

往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多，而造成PCR的非特异性产物过多。

对策：①减少Taq酶的量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少引物的用量，减少循环次数，提高退火温度。

2、电泳体系的问题：

（1）电泳缓冲液TAE或者TBE的污染，建议更换缓冲液。（2）上样时样品漂了，建议增加上样缓冲液的用量，以及小心加样。（3）电压太高。（4）适当把你的胶的浓度加大。（根据你的片断大小而定）（5）观察你的marker是否也存在拖尾现象，作为对照。

PCR拖尾及假阳性的原因及对策

拖尾

现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

原因：

1.模板不纯

2.Buffer不合适

3.退火温度偏低

4.酶量过多

5.dNTP、Mg2+浓度偏高

6.循环次数过多

对策：

1.纯化模板

2.更换Buffer

3.适当提高退火温度

4.适量用酶

5.适当降低dNTP和镁离子的浓度

6.减少循环次数

假阳性

现象：空白对照出现目的扩增产物

原因： 靶序列或扩增产物

的交*污染

对策：

1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；

2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管