反相色谱峰形拖尾的原因和改善方法极限色谱柱

色谱峰拖尾的原因及处理方法色谱峰拖尾那可真让人头疼！为啥会拖尾呢？可能是色谱柱受损啦，就像你的宝贝手机屏幕被划了一道，那肯定不好使了呀！也可能是样品过载，哎呀妈呀，这就好比小货车硬要装大卡车的货，能不垮嘛！还可能是流动相不合适，这就跟你穿了不合脚的鞋子去跑步，能舒服嘛！
那咋处理呢？如果是色谱柱受损，赶紧换一根新的呗！要是样品过载，那就减少进样量呀，可别贪心哦！流动相不合适的话，就调整流动相的组成和比例呗，这就跟做饭调味一样，得恰到好处。

这过程中安全性很重要哦！可别不小心碰到那些有毒的试剂，那可不得了。

稳定性也得注意，别一会儿这样一会儿那样，得有个准头。

这在很多场景都能用得上呢！比如药物分析，你想想，要是药物分析不准确，那多吓人呀！优势嘛，能让你的分析更准确，就像有了一双火眼金睛，啥问题都能看出来。

我给你说个实际案例哈，有一次在实验室，大家就遇到了色谱峰拖尾的问题，后来一检查，原来是色谱柱不行了，换了一根新的，嘿，立马就好了。

这效果，杠杠的！
色谱峰拖尾就得赶紧找原因解决，这样才能让我们的实验更顺利，分析更准确。

咱可不能让这小问题影响了大事。

【转】色谱拖尾原因及解决办法色谱拖尾原因及解决办法，我查看一些资料来班门弄斧了。

1、当经历维修色谱问题（色谱峰拖尾、灵敏度降低、保留时间改变等）时，切去色谱柱前端的1/2 到1 米。

必要时，更换进样口内衬管、隔垫，并清洗进样口。

保护柱可用于提高色谱柱的使用寿命。

（气相）2、衬管脱活进样口衬管上的活性点可以吸附样品组分并导致出现拖尾峰，并可能损失灵敏度和重现性。

用脱活制剂用来覆盖衬管玻璃表面的活性点或与之发生反应。

脱活程序进行脱活，该程序可以使衬管重现性高、惰性好，且使用寿命长。

对于不分流的应用，或者在必须分析极性很弱的化合物时，应当使用脱活的衬管。

即使使用脱活的衬管开始也会表现出活性，当这种情况发生时，应当更换衬管。

可以清洁衬管以除去颗粒物或用溶剂冲洗衬管以除去挥发性较低的组分。

但是，选择合适的衬管清洗程序可能较为困难。

某些溶剂可能会除去脱活层，并且工具可能会划伤衬管的玻璃表面，从而导致出现多余的活性点。

新的衬管几乎总比已清洁过并且重新脱活的衬管表现优异- 尤其对于痕量分析。

3、色谱柱、进样口衬管或被污染的金属进样口密封垫所吸收的样品组分使用新的脱活的衬管或清洗旧衬管并更换玻璃毛。

进样针针头撞击，进样口衬管内的填充物破碎。

从衬管中取出部分填充物，或使用无填充的衬管。

色谱柱末端切口不整齐（样品吸附于此）卸下色谱柱。

使用安全的毛细管熔融石英切割工具（例如陶瓷片或色谱柱切割器）将色谱柱切成垂直的齐口，然后重新装入色谱柱。

断裂或破碎的进样口衬管确保进样口中的总流速为40 ml/min以上。

4、色谱柱在进样口中的位置不正确，可能载气流路存在密封垫的颗粒。

5、一支色谱柱上不能装入超过2-3 个接头。

多个接头会造成死体积（拖尾峰）问题。

6、超出色谱柱的温度上限会造成固定相和管表面的加速损坏。

这样会造成色谱柱的过分流失，活性组分形成拖尾，以及/或降低柱效（分离度）。

幸好热损坏是一个很慢的过程，因此，在色谱柱严重损坏之前还有一段很长的时间可在高于温度极限的条件下使用。

各种造成峰‎形拖尾的原‎因分析：[柱物理损坏‎]色谱柱有物‎理损坏是造‎成峰形拖尾‎的根源。

唯一的解决‎方法就是更‎换新柱。

[柱内填料污‎染]流动相和样‎品中的杂质‎是色谱柱主‎要污染源。

流动相所用‎的各种溶剂‎至少是分析‎纯，尽量使用色‎谱纯试剂。

流动相所用‎的水最好是‎超纯水或全‎玻璃器皿双‎蒸水。

用前先用0‎.45um溶‎剂微孔过滤‎（器）过滤，除去可能存‎在的微粒。

流动相建议‎现用现配，对于含盐的‎溶液尤其注‎意长置会产‎生细菌或出‎现沉淀。

此外还得保‎证储存流动‎相的容器清‎洁。

复杂样品可‎选用0.45um溶‎剂微孔过滤‎（器）或样品预处‎理柱对样品‎进行预处理‎，确保样品中‎不含微粒杂‎质。

若样品不便‎处理，要使用保护‎柱。

柱内填料污‎染时，可将柱头螺‎丝卸下，用专用工具‎挖出柱内前‎段被污染填‎料，再以相同的‎填料重新填‎入，修复。

或以能溶解‎污染物的流‎动相按色谱‎柱使用的相‎反方向，冲洗色谱柱‎（约20至3‎0倍柱体积‎，或视具体情‎况而定；另外，此时不能接‎检测器），将污染物冲‎出色谱柱，再按色谱柱‎标明的使用‎方向使用。

[柱进口处有‎异物]当断定是柱‎进口处有异‎物时，可将柱头螺‎丝卸下，取出滤帽并‎将其置于2‎0%硝酸溶液中‎，用超声波清‎洗约20分‎钟，再置于超纯‎水中，并用超声波‎清洗约10‎分钟，重新装入色‎谱柱内即可‎。

[样品浓度过‎高致使柱超‎载]样品在柱上‎超载能引起‎峰展宽，拖尾（或伸舌）。

适当减小进‎样量或样品‎浓度（需要时，可提高检测‎器灵敏度）直至峰形和‎保留时间不‎再改变，便可消除这‎种不良影响‎。

减小进样量‎还能改善其‎分离度。

正常情况下‎，样品中每种‎化合物在1‎50×4.6mm柱中‎进样量保持‎在3～50ug范‎围内，不会引起明‎显超载。

[样品溶剂不‎对]选择合适的‎样品溶剂，以排除不必‎要的干扰。

最好选用流‎动相溶解样‎品。

[柱外效应]柱外效应（即进样阀、色谱柱及检‎测器间的管‎路过长、直径过粗、管路接头不‎匹配、有死体积）是影响色谱‎柱柱效的主‎要因素之一‎。

色谱峰拖尾解决方法色谱峰拖尾解决方法近年来，越来越多的研究者选择使用色谱仪来进行化学分析，尤其是高效液相色谱仪（HPLC）。

然而，HPLC中的色谱峰拖尾问题一直是研究人员们面临的最大挑战之一。

以下是几种解决色谱峰拖尾问题的方法。

1. 优化仪器条件当研究者遇到色谱峰拖尾问题时，首先应考虑的是优化仪器条件。

常见的优化仪器条件方法包括：优化流速、更换柱子、更换进样针头、更换活塞密封圈等等，这些常见的优化方法可以让仪器恢复到正常的运行状态，从而更好地消除拖尾问题。

2. 改善样品制备另一个可能导致色谱峰拖尾问题出现的原因是样品制备不当。

如果样品含有大量的杂质或者过于浓缩，这些都可能导致拖尾问题出现。

因此，研究者可以考虑改善样品制备方法，如使用更好的萃取工具、制备更纯净的样品和深度稀释等等，以减少拖尾现象的出现。

3. 优化柱子选择在进行柱子选择时，研究者可以考虑选用具有更好分离能力和更高效率的柱子。

较高的分离力可以保证样品分子最大程度地分离，减少拖尾问其他的。

同时，较高的柱效率可以保证分离的同时不会对样品造成太大影响，从而使拖尾问题得以解决。

4. 调整pH值和缓冲液浓度在HPLC分离过程中，样品的pH值和缓冲液浓度都会对色谱峰的形状产生影响，如果分析人员在选取分离柱和实施柱效验测时，能够正确选择条件，峰才能得到兼顾尖度与实时保留时间稳定性的最佳平衡。

这些变量对单色谱峰的对称性、峰的高度以及分离度都会产生影响，因此，也可以考虑通过调整pH值和缓冲液浓度来解决色谱峰拖尾问题。

5. 增加底物或添加剂为消除色谱峰拖尾现象，研究者们可以尝试提高底物或添加剂的浓度。

例如，对于氨基酸分析，可以添加高浓度底物，这样可以增加检测灵敏度，并使拖尾问题得到解决。

总之，色谱峰拖尾问题是化学分析实验中很常见的现象，但它所导致的结果可能会对实验结果的准确性带来很大的影响。

因此，研究者们可以根据上述方法，采取不同策略，找到最符合实验条件的解决方案，以确保得到最准确、最可靠的实验结果。

改善反向液相色谱峰拖尾的方法改善反相HPLC中的峰拖尾一、溶解样品的溶剂极性强于流动相引起的拖尾现象:1、先流出的峰的拖尾较后流出的峰拖尾严重; 分离碱性化合物、通过HPLC分析药物成分时是经常产生拖尾2、进样量减少或样品经流动相稀释后进样峰拖尾情况减轻。

峰拖尾可以引起分离度降低、灵敏度减弱、精密度和定量变差。

(峰之间的分离度和灵敏度与峰拖尾成负相关;准确度和精密度因数据系二、由样品量(进样量超过柱子容量)过载引起的峰拖尾统无法准确识别峰的起点和终点而受到影响)现象: 峰拖尾原因及解决方案1、样品峰呈现直角三角形，当更多的样品量注入时，峰前端变尖、编号原因解决方案后端拖尾更严重。

2、色谱柱过载后，保留时间随样品量的增加而提前。

(见图3) 样品溶剂在流动相中溶解样品，或者将样品经解决方案:减少进样量一极性强于流流动相稀释至进样后峰拖尾符合要求，动相总之尽可能降低样品溶剂的强度柱直径(mm)参考最大样品样品量过减少进样量，参考表2中推荐的不同ID 量(mg) 二载柱型对应的不同进样体积 10 35-65 1.调节流动相的pH<3.0。

4.6 4.5-9.0 2.增加流动相的离子强度，25mM,3.0 2.0-4.0 50mM。

表2 HPLC色谱柱的直径、参考的最大进样量、进样量的范围硅醇基与因为实际进样量依赖于柱子的填料(具有高的表面积的填充材料三胺类物质的3.流动相中增加竞争性的胺类，10mM可以具有大的进样量)，分析物质(分子量大的进样量要少)，和其他结合的TEA(三乙胺)。

的因素比如样品在流动相中的溶解性。

4.选择低硅醇活性的固定相。

参照图6 C18柱按固定相硅醇活性分级。

1.增加流动相中盐的浓度，25mM,50mM。

酸性物质四在硅胶上的2.调节流动相的pH<3.0 吸附 3.增加竞争性的有机酸，1%醋酸或者是0.1%TFA(三氟乙酸) 更换新的色谱柱五柱子空隙尝试填充空隙很少能达到较好的效果。

色谱拖尾原因及解决办法1、当经历维修色谱问题（色谱峰拖尾、灵敏度降低、保留时间改变等）时，切去色谱柱前端的1/2 到1 米。

必要时，更换进样口内衬管、隔垫，并清洗进样口。

保护柱可用于提高色谱柱的使用寿命。

（气相）2、衬管脱活进样口衬管上的活性点可以吸附样品组分并导致出现拖尾峰，并可能损失灵敏度和重现性。

用脱活制剂用来覆盖衬管玻璃表面的活性点或与之发生反应。

脱活程序进行脱活，该程序可以使衬管重现性高、惰性好，且使用寿命长。

对于不分流的应用，或者在必须分析极性很弱的化合物时，应当使用脱活的衬管。

即使使用脱活的衬管开始也会表现出活性，当这种情况发生时，应当更换衬管。

可以清洁衬管以除去颗粒物或用溶剂冲洗衬管以除去挥发性较低的组分。

但是，选择合适的衬管清洗程序可能较为困难。

某些溶剂可能会除去脱活层，并且工具可能会划伤衬管的玻璃表面，从而导致出现多余的活性点。

新的衬管几乎总比已清洁过并且重新脱活的衬管表现优异- 尤其对于痕量分析。

3、色谱柱、进样口衬管或被污染的金属进样口密封垫所吸收的样品组分使用新的脱活的衬管或清洗旧衬管并更换玻璃毛。

进样针针头撞击，进样口衬管内的填充物破碎。

从衬管中取出部分填充物，或使用无填充的衬管。

色谱柱末端切口不整齐（样品吸附于此）卸下色谱柱。

使用安全的毛细管熔融石英切割工具（例如陶瓷片或色谱柱切割器）将色谱柱切成垂直的齐口，然后重新装入色谱柱。

断裂或破碎的进样口衬管确保进样口中的总流速为40 ml/min以上。

4、色谱柱在进样口中的位置不正确，可能载气流路存在密封垫的颗粒。

5、一支色谱柱上不能装入超过2-3 个接头。

多个接头会造成死体积（拖尾峰）问题。

6、超出色谱柱的温度上限会造成固定相和管表面的加速损坏。

这样会造成色谱柱的过分流失，活性组分形成拖尾，以及/或降低柱效（分离度）。

幸好热损坏是一个很慢的过程，因此，在色谱柱严重损坏之前还有一段很长的时间可在高于温度极限的条件下使用。

当有氧存在时会大大加速热损坏。

技术报告改善反相HPLC中的峰拖尾在反相HPLC中峰拖尾是一个普遍的现象。

特别是分离碱性化合物和通过HPLC分析药物成分时是经常产生拖尾缘由。

峰拖尾可以引起分离度降低，灵敏度减弱，精密度和定量变差。

图1表明峰之间的分离度和灵敏度与峰拖尾成负相关。

图2表明准确度和精密度因数据系统无法准确识别峰的起点和终点而受到影响。

图1 拖尾对分离度和灵敏度的影响当峰拖尾（T，拖尾因子）从1.0增加到2.0时，分离度（Rs）从1.5降到1.0。

灵敏度（峰高）由于峰的体积增大和样品的浓度降低而降低。

图2 峰拖尾对准确度和精密度的不利影响拖尾峰使数据系统难以准确确定峰的终点，故而影响准确度和精密度。

在这个例子中，在B点测得到峰面积比在A点测得的峰面积少约3%。

峰拖尾的原因，峰拖尾的主要原因有：1、溶解样品的溶剂比流动像更强，2、样品量过载，3、固定相中的硅醇基与胺类物质相结合反应，4、硅胶吸附酸性化合物，5、色谱柱柱床中有空隙。

只要确定了拖尾的原因就可以采取措施减少拖尾并消除之。

（表1）表1 峰拖尾：原因及解决方案原因解决方案样品溶剂极性强于流动相在流动相中溶解样品，尽可能降低样品溶剂的强度样品量过载减少进样量，参考表2中推荐的不同柱型对应的不同进样体积硅醇基与胺类物质的结合 1.调节流动相的pH<3.0。

2.增加流动相的离子强度，25mM～50mM。

3.流动相中增加竞争性的胺类，10mM一、由于溶解样品的溶剂极性强于流动相而引起的拖尾如果溶解样品的溶剂极性强于流动相，就会引起宽的甚至是拖尾的峰。

有几种线索可以帮助确定是由于此种原因引起的拖尾。

第一种就是先流出的峰的拖尾较后流出的峰拖尾严重；另一种迹象就是进样量减少或者是样品经流动相稀释后进样峰拖尾减轻了。

如果怀疑拖尾的原因是流动相的强度引起的，解决很简单。

将样品溶解在流动相中，或者将样品经流动相稀释至进样后峰拖尾符合要求。

二、由样品量过载引起的峰拖尾当进样量超过柱子的容量，样品峰会呈现一个直角三角形。

技术报告改善反相HPLC中的峰拖尾在反相HPLC中峰拖尾是一个普遍的现象。

特别是分离碱性化合物和通过HPLC分析药物成分时是经常产生拖尾缘由。

峰拖尾可以引起分离度降低，灵敏度减弱，精密度和定量变差。

图1表明峰之间的分离度和灵敏度与峰拖尾成负相关。

图2表明准确度和精密度因数据系统无法准确识别峰的起点和终点而受到影响。

图1拖尾对分离度和灵敏度的影响当峰拖尾（T，拖尾因子）从1.0增加到2.0时，分离度（Rs）从1.5降到1.0。

灵敏度（峰高）由于峰的体积增大和样品的浓度降低而降低。

图2峰拖尾对准确度和精密度的不利影响拖尾峰使数据系统难以准确确定峰的终点，故而影响准确度和精密度。

在这个例子中，在B点测得到峰面积比在A点测得的峰面积少约3%。

峰拖尾的原因，峰拖尾的主要原因有：1、溶解样品的溶剂比流动像更强，2、样品量过载，3、固定相中的硅醇基与胺类物质相结合反应，4、硅胶吸附酸性化合物，5、色谱柱柱床中有空隙。

只要确定了拖尾的原因就可以采取措施减少拖尾并消除之。

（表1）表1峰拖尾：原因及解决方案原因解决方案样品溶剂极性强于流动相在流动相中溶解样品，尽可能降低样品溶剂的强度样品量过载减少进样量，参考表2中推荐的不同柱型对应的不同进样体积硅醇基与胺类物质的结合 1.调节流动相的pH<3.0。

2.增加流动相的离子强度，25mM～50mM。

3.流动相中增加竞争性的胺类，10mM的TEA（三乙胺）。

4.选择低硅醇活性的固定相。

参照图6C18柱按固定相硅醇活性分级。

5.酸性物质在硅胶上的吸附 1.增加流动相中盐的浓度，25mM～50mM。

2.调节流动相的pH<3.03.增加竞争性的有机酸，1%醋酸或者是0.1%TFA（三氟乙酸）柱子空隙更换新的色谱柱尝试填充空隙很少能达到较好的效果。

一、由于溶解样品的溶剂极性强于流动相而引起的拖尾如果溶解样品的溶剂极性强于流动相，就会引起宽的甚至是拖尾的峰。

有几种线索可以帮助确定是由于此种原因引起的拖尾。

改善反向液相色谱峰拖尾的方法HUA system office room 【HUA16H-TTMS2A-HUAS8Q8-HUAH1688】分离碱性化合物、通过HPLC分析药物成分时是经常产生拖尾峰拖尾可以引起分离度降低、灵敏度减弱、精密度和定量变差。

（峰之间的分离度和灵敏度与峰拖尾成负相关；准确度和精密度因数据系统无法准确识别峰的起点和终点而受到影响）峰拖尾原因及解决方案一、溶解样品的溶剂极性强于流动相引起的拖尾现象：1、先流出的峰的拖尾较后流出的峰拖尾严重；2、进样量减少或样品经流动相稀释后进样峰拖尾情况减轻。

二、由样品量（进样量超过柱子容量）过载引起的峰拖尾现象：1、样品峰呈现直角三角形，当更多的样品量注入时，峰前端变尖、后端拖尾更严重。

2、色谱柱过载后，保留时间随样品量的增加而提前。

（见图3）解决方案：减少进样量表2 HPLC色谱柱的直径、参考的最大进样量、进样量的范围因为实际进样量依赖于柱子的填料（具有高的表面积的填充材料可以具有大的进样量），分析物质（分子量大的进样量要少），和其他的因素比如样品在流动相中的溶解性。

图3 样品量过载引起的拖尾表3 反相HPLC常用缓冲液三、固定相中的硅醇基与胺类相互作用引起的拖尾原因：带正电荷的溶液（胺类）与固定相颗粒表面上的酸性硅醇发生了离子交换，引起二次保留(图 4)，常见于固定相具有显着的硅醇活性的的色谱柱，中性pH （6～8）条件下比酸性pH（<3）更易发生。

酸性和中性的化合物一般不受影响，一些碱性化合物更易受到此效应的影响。

解决：1、确认流动相中有合适的缓冲盐，可能的话尽量在pH<3的条件下操作（使硅胶固定相上的硅醇基质子化，减少溶质与硅醇反应的几率）。

使用足够的缓冲液控制pH并减少离子交换效应。

在pH<3的条件下操作，可减少由图4相互作用引起的峰拖尾，原理：固定相表面的酸性硅醇基可以形成与碱性化合物反应的离子交换位点，经反相HPLC分离胺类化合物时，这种离子交换反应常常引起峰的保留（二次保留）和峰拖尾。

一、什么原因导致反相 HPLC 的峰拖尾，应采取什么措施？由于被分析物与色谱柱间的相互作用导致峰拖尾。

这种相互作用是在做反相分析中所发生的分配行为以外的作用。

峰拖尾一般发生在碱性化合物上，通常是由于残留的硅羟基和带正电荷的碱性化合物之间的相互作用引起的。

这种相互作用一般是发生在带正电荷的碱性化合物与带负电荷的色谱柱表面硅羟基之间的离子交换。

当流动相的 pH 值大于 4.5-5.0 时，色谱柱表面的硅羟基会带负电荷。

因此，(1)消除峰拖尾的最有效方式是使用 pH 值小于 4 的缓冲流动相。

由于硅羟基的活性和离子化会降低，因此(2)选择更换新的高纯羟基化硅胶色谱柱也会减少峰拖尾。

ZORBAX 色谱柱中使用这类硅胶的有：StableBond 色谱柱、Eclipse XDB 色谱柱、Bonus-RP 和 Extend-C18 色谱柱。

这些色谱柱均可以减少峰拖尾，但是它们又有所不同。

StableBond (SB)色谱柱在低 pH 值时比较理想，因此在使用较低 pH 值的流动相时通常是首选色谱柱。

在 pH 值为 5-9 时Eclipse XDB 色谱柱是减少峰拖尾的首选色谱柱。

这类色谱柱有双重封端，因此它可以通过覆盖色谱柱表面上尽可能多的残留硅羟基以消除可能的硅羟基副作用，从而减少峰拖尾。

对于这个中间 pH 值区，Bonus-RP 色谱柱也是一个减少峰拖尾的不错选择。

Bonus-RP 色谱柱有一个植入极性物质的键合相。

这些极性物质可减少碱性化合物和残留硅羟基之间的相互作用，因此改善碱性化合物的峰形。

这类色谱柱可以在 pH 值为 2-8 的条件下使用。

Extend-C18 用于高 pH 值，最高可用于 pH 值为 11.5 的条件下。

在较高 pH 值下，很多碱性化合物已经不带电荷，因此和硅羟基的相互作用减小，峰拖尾也减少。

(3)认真选择流动相也可以减少峰拖尾。

缓冲流动相 (25–50 mM) 可减少峰拖尾，同时首选低 pH 值 (pH 2–3) 流动相。

色谱峰拖尾的原因色谱峰拖尾的原因有很多，例如：1．色谱柱本身填装问题,筛板堵塞或填料塌陷；柱坏；2．柱头有污染；3．样品超载；4．样品溶剂不合适；5．柱外效应；6．化学或二次保留（硅羟基）效应；7．缓冲容量不足或不合适；8．重金属污染。

解决方法如下：一、与化学有关的拖尾问题1．流动相中，加入30mM的三乙胺（用于碱性化合物）或醋酸胺（用于酸性化合物），未知化合物加醋酸三乙胺；2．如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；3.降低进样量至<1μg。

二、与色谱柱有关的拖尾问题1.如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96%的二氯甲烷与4%甲醇，加1%氢氧化铵混合液冲洗；正向柱可用甲醇冲洗；2.使用保护柱。

三、与HPLC系统有关的峰拖尾和峰加宽1.进样体积过大，（通常≤25μL）；2.进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大（最佳连接管应<20cm，内径为0.007"）；3.检测器流通池的体积过大。

多数色谱分析工作者在日常工作中想必都遇到过这样的问题：当用反相柱进行酸性或碱性化合物分析时，常常出现峰形拖尾现象，严重降低分离质量和精度，尤其是使用自动数据系统时。

在此，笔者就各种造成峰形拖尾的原因作一次简浅的分析：[柱物理损坏]色谱柱有物理损坏是造成峰形拖尾的根源。

唯一的解决方法就是更换新柱。

[柱内填料污染]流动相和样品中的杂质是色谱柱主要污染源。

流动相所用的各种溶剂至少是分析纯，尽量使用色谱纯试剂。

流动相所用的水最好是超纯水或全玻璃器皿双蒸水。

用前先用0.45um溶剂微孔过滤（器）过滤，除去可能存在的微粒。

流动相建议现用现配，对于含盐的溶液尤其注意长置会产生细菌或出现沉淀。

此外还得保证储存流动相的容器清洁。

复杂样品可选用0.45um溶剂微孔过滤（器）或样品预处理柱对样品进行预处理，确保样品中不含微粒杂质。

若样品不便处理，要使用保护柱。

柱内填料污染时，可将柱头螺丝卸下，用专用工具挖出柱内前段被污染填料，再以相同的填料重新填入，修复。

色谱峰拖尾的原因色谱峰的拖尾是指峰形状在峰顶处附近延伸出长尾部分的现象。

拖尾可以给色谱分析带来许多问题，如降低分离的效率和峰的峰面积准确性。

色谱峰拖尾的主要原因可以分为两类：理化因素和仪器因素。

1.理化因素（1）色谱柱特性：拖尾是由于样品在柱填料中的强烈吸附和解吸现象引起的。

如果填料的吸附特性较强，样品会吸附在柱填料上，使得峰形变宽，并且在离开柱时解吸较慢，导致峰的拖尾；此外，填料表面的不均匀性也可能造成拖尾。

（2）样品性质：拖尾现象还与样品的物理化学性质相关。

样品溶液中可能会存在极性或非极性物质，它们在柱填料上的吸附速度不同，导致部分物质在柱中停留时间较长，从而引起拖尾现象。

（3）样品浓度：高浓度样品溶液中，溶质的吸附和解吸过程会更加明显，因此容易出现拖尾。

溶质浓度高，样品在柱中停留的时间比较长，导致拖尾现象增加。

2.仪器因素（1）柱温：柱温度的升高可以促进吸附和解吸过程，加快了溶质在柱填料上的扩散速度，减少了拖尾现象。

相反，如果温度过低，扩散速度较慢，使得拖尾现象增加。

（2）流速：柱的流速对于拖尾现象也有重要影响。

过高或过低的流速都容易引起拖尾。

流速过高，组分在柱填料上的停留时间较短，未能充分扩散和平衡，导致拖尾；流速过低，则会增加样品在柱中的停留时间，也会导致拖尾。

（3）进样量：进样量的过大会导致柱填料中的分子与进样量之间的相互作用增强，从而增加拖尾现象的发生。

因此，精确控制进样量可以减少拖尾现象。

总之，色谱峰拖尾的原因是复杂的，既受理化因素的影响，也受到仪器设备的影响。

了解并控制这些因素对于减少拖尾现象、提高色谱分析的成果至关重要。

改善反相HPLC 中的峰拖尾分离碱性化合物、通过HPLC 分析药物成分时是经常产生拖尾峰拖尾可以引起分离度降低、灵敏度减弱、精密度和定量变差。

（峰之间的分离度和灵敏度与峰拖尾成负相关；准确度和精密度因数据系统无法准确识别峰的起点和终点而受到影响）峰拖尾原因及解决方案拖尾现象：1、先流出的峰的拖尾较后流出的峰拖尾严重；2、进样量减少或样品经流动相稀释后进样峰拖尾情况减轻。

二、由样品量（进样量超过柱子容量）过载 引起的峰拖尾现象：1、样品峰呈现直角三角形，当更多的样品量注入时，峰前端变尖、后端拖尾更严重。

2、色谱柱过载后，保留时间随样品量的增加而提前。

（见图3）表进样量的范围因为实际进样量依赖于柱子的填料（具有高的表面积的填充材料可以具有大的进样量），分析物质（分子量大的进样量要少），和其他的因素比如样品在流动相中的溶解性。

图3 样品量过载引起的拖尾表3 反相HPLC 常用缓冲液引起的拖尾原因：带正电荷的溶液（胺类）与固定相颗粒表面上的酸性硅醇发生了离子交换，引起二次保留(图 4)，常见于固定相具有显着的硅醇活性的的色谱柱，中性pH （6～8）条件下比酸性pH （<3）更易发生。

酸性和中性的化合物一般不受影响，一些碱性化合物更易受到此效应的影响。

解决：1、确认流动相中有合适的缓冲盐，可能的话尽量在pH<3的条件下操作（使硅胶固定相上的硅醇基质子化，减少溶质与硅醇反应的几率）。

使用足够的缓冲液控制pH并减少离子交换效应。

在pH<3的条件下操作，可减少由图4相互作用引起的峰拖尾，原理：? 固定相表面的酸性硅醇基可以形成与碱性化合物反应的离子交换位点，经反相HPLC分离胺类化合物时，这种离子交换反应常常引起峰的保留（二次保留）和峰拖尾。

2、在流动相中加入竞争性的胺类，如：在流动相中加入三乙胺（TEA）（多数情况下，约10mM 即可）。

TEA可以与硅醇发生强的反应，并抑制样品中的胺类与硅醇反应。

各种造成峰形拖尾的原因分析：[柱物理损坏]色谱柱有物理损坏是造成峰形拖尾的根源。

唯一的解决方法就是更换新柱。

[柱内填料污染]流动相和样品中的杂质是色谱柱主要污染源。

流动相所用的各种溶剂至少是分析纯，尽量使用色谱纯试剂。

流动相所用的水最好是超纯水或全玻璃器皿双蒸水。

用前先用0.45um溶剂微孔过滤（器）过滤，除去可能存在的微粒。

流动相建议现用现配，对于含盐的溶液尤其注意长置会产生细菌或出现沉淀。

此外还得保证储存流动相的容器清洁。

复杂样品可选用0.45um溶剂微孔过滤（器）或样品预处理柱对样品进行预处理，确保样品中不含微粒杂质。

若样品不便处理，要使用保护柱。

柱内填料污染时，可将柱头螺丝卸下，用专用工具挖出柱内前段被污染填料，再以相同的填料重新填入，修复。

或以能溶解污染物的流动相按色谱柱使用的相反方向，冲洗色谱柱（约20至30倍柱体积，或视具体情况而定；另外，此时不能接检测器），将污染物冲出色谱柱，再按色谱柱标明的使用方向使用。

[柱进口处有异物]当断定是柱进口处有异物时，可将柱头螺丝卸下，取出滤帽并将其置于20%硝酸溶液中，用超声波清洗约20分钟，再置于超纯水中，并用超声波清洗约10分钟，重新装入色谱柱内即可。

[样品浓度过高致使柱超载]样品在柱上超载能引起峰展宽，拖尾（或伸舌）。

适当减小进样量或样品浓度（需要时，可提高检测器灵敏度）直至峰形和保留时间不再改变，便可消除这种不良影响。

减小进样量还能改善其分离度。

正常情况下，样品中每种化合物在150×4.6mm柱中进样量保持在3～50ug范围内，不会引起明显超载。

[样品溶剂不对]选择合适的样品溶剂，以排除不必要的干扰。

最好选用流动相溶解样品。

[柱外效应]柱外效应（即进样阀、色谱柱及检测器间的管路过长、直径过粗、管路接头不匹配、有死体积）是影响色谱柱柱效的主要因素之一。

所以在可能的条件下，色谱柱的两端连接管路要尽可能短，连接管内径尽可能细小，切口务必平整光滑，尽可能的减小死体积，以防止因样品扩散造成不能反映色谱柱真实柱效等情况发生。

如何解决峰拖尾与峰前延？峰形对称性的优劣对峰面积和分离度有很大的影响，从而影响分析结果的准确性。

色谱实践中，大部分的峰形问题都不是色谱柱的问题，仪器参数设定、色谱条件和方法正确与否对峰形有很大影响。

引起峰形异常的因素很多，柱外死体积引起峰形异常有个特点：对先出的峰影响大，对后出峰影响小；柱头塌陷、柱头和筛板污染会引起所有的峰形都异常，而硅醇基次级保留只引起部分峰拖尾。

相塌陷除了引起保留下降外，也会造成峰拖尾。

峰拖尾常见的3种拖尾情况：次级保留引起峰拖尾的机理解析：反相色谱中，通常非极性和弱极性的化合物能获得良好的峰形，而带有-COOH、-NH2、-NHR、-NR2等极性基团的化合物则比较容易产生拖尾，原因是硅胶表面残留硅羟基对极性和碱性样品分子产生次级保留效应。

反相填料表面有残余的硅羟基，具有一定的酸性，其pKa约为4.5～4.7。

根据电离规律，流动相的pH-pKa>2即pH>6.7时，99%以上的硅羟基应该是呈离子状态的，即Si-O- ，而pKa-pH>2即pH<2.5时，酸性环境抑制了硅羟基的电离，99%以上的硅羟基应该是呈分子状态的，即Si-OH，但其极性仍然存在，即Si-Oδ-Hδ+。

Si-Oδ-Hδ+和-Si-O-对于极性化合物之间的作用力则是一种极性的静电作用力，这种作用力比范德华力要强得多。

同时，因为硅胶表面键合了C18长链，由于空间位阻作用，样品分子中能接触到残余硅羟基的机会不多，只有少部分的分子才能与残余硅羟基产生强的静电作用而被推迟洗脱出来，产生后拖。

拖尾严重的程度与样品分子极性大小和残余硅羟基的多少有着直接的关系。

完全硅羟化的硅胶表面硅羟基浓度为8mol/m2，由于空间位阻的作用，通常与C18硅烷基发生反应的仅达2～3.5mol/m2，需要再用小分子的硅烷跟硅羟基反应，如图中的三甲基氯硅烷，使硅羟基中的氢变成了三甲基硅烷的一个惰性基团。

三甲基硅烷还是比氢原子大得多，还是不能将所有的残余硅羟基的活性封闭掉。

一、什么原因导致反相 HPLC 的峰拖尾，应采取什么措施？由于被分析物与色谱柱间的相互作用导致峰拖尾。

这种相互作用是在做反相分析中所发生的分配行为以外的作用。

峰拖尾一般发生在碱性化合物上，通常是由于残留的硅羟基和带正电荷的碱性化合物之间的相互作用引起的。

这种相互作用一般是发生在带正电荷的碱性化合物与带负电荷的色谱柱表面硅羟基之间的离子交换。

当流动相的 pH 值大于 4.5-5.0 时，色谱柱表面的硅羟基会带负电荷。

因此，(1)消除峰拖尾的最有效方式是使用 pH 值小于 4 的缓冲流动相。

由于硅羟基的活性和离子化会降低，因此(2)选择更换新的高纯羟基化硅胶色谱柱也会减少峰拖尾。

ZORBAX 色谱柱中使用这类硅胶的有：StableBond 色谱柱、Eclipse XDB 色谱柱、Bonus-RP 和 Extend-C18 色谱柱。

这些色谱柱均可以减少峰拖尾，但是它们又有所不同。

StableBond (SB)色谱柱在低 pH 值时比较理想，因此在使用较低 pH 值的流动相时通常是首选色谱柱。

在 pH 值为 5-9 时Eclipse XDB 色谱柱是减少峰拖尾的首选色谱柱。

这类色谱柱有双重封端，因此它可以通过覆盖色谱柱表面上尽可能多的残留硅羟基以消除可能的硅羟基副作用，从而减少峰拖尾。

对于这个中间 pH 值区，Bonus-RP 色谱柱也是一个减少峰拖尾的不错选择。

Bonus-RP 色谱柱有一个植入极性物质的键合相。

这些极性物质可减少碱性化合物和残留硅羟基之间的相互作用，因此改善碱性化合物的峰形。

这类色谱柱可以在 pH 值为 2-8 的条件下使用。

Extend-C18 用于高 pH 值，最高可用于 pH 值为 11.5 的条件下。

在较高 pH 值下，很多碱性化合物已经不带电荷，因此和硅羟基的相互作用减小，峰拖尾也减少。

(3)认真选择流动相也可以减少峰拖尾。

缓冲流动相 (25–50 mM) 可减少峰拖尾，同时首选低 pH 值 (pH 2–3) 流动相。